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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(chngx)(chngx)(四四个步骤个步骤) )第1页/共21页第一页，共22页。 基因工程(jyn gngchng)的基本操作程序v目的目的(md)基因的获取基因的获取v基因表达载体基因表达载体(zit)的构建的构建v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞操作过程操作过程操作过程操作过程v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定第2页/共21页第二页，共22页。一、目的基因一、目的基因(jyn)(jyn)的获取的获取获取目的基因是实施基因工程的第一步。获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因主要是指目的基因主要是指_获取目的基因的常用
2、方法获取目的基因的常用方法从基因文库从基因文库(wnk)(wnk)中获取中获取（基因组文库（基因组文库(wnk)(wnk)，部分基因文库，部分基因文库(wnk)(wnk)）利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（变性，复性或退火，延伸）（变性，复性或退火，延伸）通过通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成编码蛋白质的结构编码蛋白质的结构(jigu)(jigu)基因基因第3页/共21页第三页，共22页。基因文库基因文库基因组文库基因组文库(wnk)(wnk)（全部）（全部）部分部分(b fen)(b fen)基因文库（如基因文库（如:cDNA:cDN
3、A文文库）库）1.1.基因文库基因文库 将含有某种生物不同将含有某种生物不同(b tn)(b tn)基因的许基因的许多多DNADNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同分别含有这种生物的不同(b tn)(b tn)基因，称为基基因，称为基因文库因文库（一）从基因文库中获得目的基因（一）从基因文库中获得目的基因第4页/共21页第四页，共22页。 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物(shngw)_(shngw)_复制复制_的核酸合的核酸合成技术成技术 条件条件(tiojin)(tiojin)：_、 _
4、_、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _原理原理(yunl)(yunl)：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶( (热稳定热稳定DNADNA聚合酶即聚合酶即TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的
5、基因技术扩增目的基因第5页/共21页第五页，共22页。IMNIMN6 6 过程过程过程过程(guchng)(guchng)：变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火(tu hu)(tu hu)、延伸三步曲、延伸三步曲、延伸三步曲、延伸三步曲变性变性变性变性(binx(binxng)ng)退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸第6页/共21页第六页，共22页。（二）利用（二）利用(lyng)PCR(lyng)PCR技术扩增目技术扩增目的基因的基因第7页/共21页第七页，共22页。IMNIMN(三三). 通过通过DNA合成仪用化学的方法合成仪用化学的方法(fngf)直接人工直接人工合成合成基因基因(jy
6、n)_(jyn)_，核苷酸序列，核苷酸序列_ _ 。较小较小已知已知第8页/共21页第八页，共22页。1.1.用一定的用一定的_切割切割(qig)(qig)质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目的基切断目的基因，使其产生因，使其产生_。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加处，再加入适量入适量_，形成，形成(xngchng)(xngchng)了一个重组了一个重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制限制(xinzh(xinzh)酶酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶切口切口DNADNA连接酶连接酶
7、相同的黏性末端相同的黏性末端二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第9页/共21页第九页，共22页。质粒目的(md)基因限制(xinzh)酶DNA连接酶重组DNA基因(jyn)表达载体的构建第10页/共21页第十页，共22页。质粒质粒DNADNA分子分子(fnz)(fnz)限制限制(xinzh)(xinzh)酶酶处理处理一个切口一个切口(qi ku)(qi ku)两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程: :二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第11页/
8、共21页第十一页，共22页。5.5.基因表达载体基因表达载体(zit)(zit)的组成：的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因(jyn)+(jyn)+启动子启动子+ +终止子终止子+ +标标记基因记基因(jyn)(jyn)二、基因二、基因(jyn)(jyn)表达载体的构建表达载体的构建第12页/共21页第十二页，共22页。基因基因(jyn)(jyn)表达载体的组成：表达载体的组成： 目的基因目的基因(jyn)(jyn)、启动子、终止子、标记、启动子、终止子、标记基因基因(jyn)(jyn)启动子：一段有特殊结构的启动子：一段有特殊结构的DNADNA片段，位于基因的首端，片段，位于基因的
9、首端，是是RNARNA聚合酶识别聚合酶识别(shbi)(shbi)和结合的部位。和结合的部位。终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNADNA片段，使转录片段，使转录(zhun l)(zhun l)在所需要的地方停止下来。在所需要的地方停止下来。标记基因标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。从而将含有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建第13页/共21页第十三页，共22页。转化转化(zhunhu) (zhunhu) 方法方法(fng
10、f(fngf) )将目的将目的(md)(md)基因基因导入导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法（双）基因枪法（双）花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞第14页/共21页第十四页，共22页。1 1、将目的、将目的(md)(md)基因导入植物细胞的方法：基因导入植物细胞的
11、方法：三、将目的三、将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞农杆菌农杆菌(gnjn)(gnjn)转化法（双、裸）转化法（双、裸）第15页/共21页第十五页，共22页。2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：）方法：（2 2）程序注射）程序注射(zhsh)(zhsh)过程过程3 3、将目的基因、将目的基因(jyn)(jyn)导入微生物细胞导入微生物细胞（1 1）常用大肠杆菌：）常用大肠杆菌： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少（2 2）大肠杆菌的转化方法）大肠杆菌的转化方法 首先用首先用Ca2+Ca2+处理细胞，使
12、细胞处于一种能吸收周围环处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中境中DNADNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓冲液中与感受分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNADNA分子，完成转化过程。分子，完成转化过程。三、将目的三、将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞显微注射法显微注射法第16页/共21页第十六页，共22页。检测检测(jin (jin c)c)鉴定鉴定(jindng(jindng)
13、 )：检测检测(jin c)(jin c)转基因生物染色体转基因生物染色体的的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定第17页/共21页第十七页，共22页。DNADNA分子分子(fnz)(fnz)杂交示意杂交示意图图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术
14、手段，将两种生物的DNADNA分子分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区（杂交带）；在没有成杂合双链区（杂交带）；在没有(mi yu)(mi yu)互补互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 P15P15思考思考(sko)(sko)与探究与探究第18页/共21页第十八页，共22页。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(chngx)(chngx)为什么要分四为什么要分四个步骤个步骤n n为什么要
15、有为什么要有“目的基因的获取目的基因的获取”这一步？本专题题图中基因工程的概念这一步？本专题题图中基因工程的概念是这样的：是这样的：“基因工程是指按照基因工程是指按照(nzho)(nzho)(nzho)(nzho)人们的愿望，进行严格的设计人们的愿望，进行严格的设计，通过体外，通过体外DNADNADNADNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”可以说这既是概念，也是可以说这既是概念，也是原理。这里所说的原理。这里所说的“更符合人们需要更符合人们需要”
16、，就是目的，那么更符合人们需要，就是目的，那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。一种生物的遗传特性。n n为什么要有为什么要有“表达载体的构建表达载体的构建”这一步？单独的这一步？单独的DNADNADNADNA片段片段目的基因目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因
17、能表达和发挥作用。第19页/共21页第十九页，共22页。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(chngx)(chngx)为什么要分为什么要分四个步骤四个步骤n n为什么要有为什么要有“ “目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞” ”这一步？教材指出含有目的这一步？教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。一种生物的基因在另一种生物中的转化。n n为什么要有为什么要有“ “目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定” ”这一步？这是因为目的基因这一步？这是因为
18、目的基因是否真正插入受体细胞的是否真正插入受体细胞的DNADNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传中，是否能够在受体细胞中稳定遗传(ychun)(ychun)和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。第20页/共21页第二十页，共22页。感谢您的观看(gunkn)！第21页/共21页第二十一页，共22页。内容(nirng)总结基因工程的基本操作程序(四个步骤)。方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循。重组DNA分子（重组质粒）。标记基因：为了鉴别受体细胞(xbo)中是否含有目的基因，。转化 。显微注射法。Ca2+感受态细胞(xbo)。目的基因进入_内，并且在 受体细胞(xbo)内维持_和_的过程。方法。”可以说这既是概念，也是原理。第20页/共21页。感谢您的观看。第21页/共21页第二十二页，共22页。
