《HBV一管法实验操作培训实用教案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HBV一管法实验操作培训实用教案（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、预期(yq)用途乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种疾病，主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床表现有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有低热(dr)等症状。人感染HBV后，病毒持续6个月仍未被清除者可发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。该产品采用实时荧光定量PCR扩增检测技术，用于定量检测已确诊为HBVDNA阳性患者血清或血浆中的HBVDNA。第1页/共12页第一页，共13页。检验(jinyn)原理本试剂盒采用微量核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的HBVDNA，利用针对HBV核酸保守区设计的一对特异
2、性引物、一条特异性荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HBVDNA的定量检测。本试剂盒系采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中进行HBVDNA核酸提取与扩增，对3l的微量血清或血浆样本直接进行快速、准确定量的荧光PCR系统；微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性(ynxng)。此外，标准品直接采用灭活后的血清质控，与样本同时进行处理与检测，实现全程监控与准确定量。第2页/共12页第二页，共13页。主要(zhyo)组成成份第3
3、页/共12页第三页，共13页。操作步骤及注意事项一、试剂准备（在试剂准备区进行）1、取出试剂盒，室温(shwn)放置，充分溶解后混匀并瞬时离心注意：a、试剂要闭光放置，-20保存，避免反复冻融b、试剂盒打开后核酸释放剂和促荧光剂可以4保存，其余成分-20保存，随用随取，用完立即放回。c、两个质控品和四个标准品使用前可以涡旋震荡然后瞬时离心，其它四种成分不可涡旋震荡，需要混匀的可轻轻颠倒混匀第4页/共12页第四页，共13页。一、试剂准备（在试剂准备区进行）2、根据待测样本、HBV阴性质控品、HBV临界阳性质控品(OT)、HBV定量标准品(OT)的数量，按比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备
4、成PCR-mix，混匀并瞬时离心后备(hubi)用，比例如下：注意：a、HBV酶混合物最后加，并且(bngqi)需要快速放回存储设备 b、加酶混合物前需润洗枪头2-3次，然后缓慢加样 c、在混匀和离心时注意闭光 d、PCR-mix可在样本处理结束后配制第5页/共12页第五页，共13页。操作步骤及注意事项二、样本处理（在样本处理区进行）1、取3ul核酸释放剂，加入PCR反应管中注意：需要过吸加样，并且垂直加入PCR反应管底部2、分别取待测样本、HBV阴性质控品、HBV临界阳性质控品(OT)、HBV定量标准品(OT)各3ul加入对应的PCR反应管中，并用(bnyn)移液器在管底吹打混匀35次注意：
5、常规吸样（无需过吸，移液器不要碰触样品管管壁），加样时垂直进入PCR反应管加样，然后移液器稍微倾斜快速吹打3-5次（不要有气泡产生），最后垂直退出移液器（退出时枪头不要碰触PCR反应管管壁）第6页/共12页第六页，共13页。操作步骤及注意事项二、样本处理（在样本处理区进行）3、各PCR反应管中分别加入30ul无菌石蜡油，然后在PCR反应管口贴上封口膜注意：悬空加入无菌石蜡油（不要有气泡产生），八连排PCR反应管可以盖上相应的盖子，若是用移液器，需要在吸样前润洗枪头2-3次，然后缓慢加样4、将PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行反应。反应温度及时间设定如下：温度时间95 10分钟注意：此反应
6、也可使用专用的恒温装置；PCR反应管不能直接(zhji)放在95直接(zhji)反应，需要放置好PCR反应管后开始升温，反应结束后需要等温度降到室温再去下PCR反应管进行后面的操作第7页/共12页第七页，共13页。操作步骤及注意事项三、PCR扩增（早扩增与分析区进行）1、将经过裂解处理后的PCR反应管从荧光定量PCR仪中取出，撕弃封口膜，在各管中按33ul/管加入前面所制备的PCR-mix，悬空加入到反应管内(unni)，瞬时离心2、PCR扩增程序设置第8页/共12页第八页，共13页。结果(jigu)分析一、根据不同的仪器和结果，可适当的调整基线和阈值二、质量控制1、HBV阴性质控品：无S型扩
7、增曲线或无CT值显示；2、HBV临界(lnji)阳性质控品(OT)：呈S型扩增曲线且检测浓度介于1.01022.0103IU/ml；3、四个HBV定量标准品(OT)：呈S型扩增曲线，且标准曲线相关系数R20.98；4、以上要求需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行检测。第9页/共12页第九页，共13页。结果(jigu)分析三、检验结果的解释1、如果靶基因FAM通道没有出现S型扩增曲线，判为HBVDNA检测阴性。2、如果靶基因FAM通道出现S型扩增曲线，判为HBVDNA检测阳性(yngxng)，检测结果有如下解释：1）测定值在0500IU/ml的样本报告为“低于试剂盒检出下限(5
8、00IU/ml)”，即“500IU/ml”。应结合其它临床诊断指标进行判断。2）测定值在5002.5108IU/ml之间的样本，直接报告所测定的数值；3）测定值大于2.5108IU/ml的样本，可报告为2.5108IU/ml；若需精确定量，可根据结果将样本稀释至2.5108IU/ml以下复测，并根据以下公式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。可报告数值(最终样本浓度)=稀释后浓度稀释倍数稀释倍数=(样本量+稀释液量)/样本量第10页/共12页第十页，共13页。第11页/共12页第十一页，共13页。感谢您的观看(gunkn)！第12页/共12页第十二页，共13页。内容(nirng)总结预期用途。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种(y zhn)疾病，主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。2、HBV临界阳性质控品(OT)：呈S型扩增曲线且检测浓度介于1.01022.0103IU/ml。3、四个HBV定量标准品(OT)：呈S型扩增曲线，且标准曲线相关系数R20.98。可报告数值(最终样本浓度)=稀释后浓度稀释倍数。感谢您的观看第十三页，共13页。
