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1、常用的生化反应常用的生化反应实验目的实验目的认识染色方法鉴别细菌的局限性认识染色方法鉴别细菌的局限性掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断甲基红试验甲基红试验产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液pHpH5.45.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性pHpH5.45.4，指示剂甲基红指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。呈红色，称甲基红试验阳性。 枸橼酸盐利用试验枸
2、橼酸盐利用试验能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，由此使培养基变为碱性，使由此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（指示剂溴麝香草酚蓝（BTBBTB）由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。 吲哚试验吲哚试验（靛基质）（靛基质） 含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基可分解色氨酸生成吲哚（
3、靛基质），若加入对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。阳性。 硫化氢试验硫化氢试验 变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。菌。尿素分解试验尿素分解试验 变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基呈碱性，以酚红为指示剂
4、检测呈红色。呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。 阳性阳性阴性阴性尿素酶试验尿素酶试验吲哚（吲哚（I I）、甲基红（）、甲基红（M M）、）、VPVP（V V）、枸橼酸盐利用）、枸橼酸盐利用（C C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为IMViCIMViC试验试验。大肠埃希菌呈大肠埃希菌呈“+-”+-”，产气肠杆菌为，产气肠杆菌为“-+”-+”。硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由
5、氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。原性产物。硝酸盐还原的过程因细菌不同而异硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝
6、酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。酸。试剂：甲液试剂：甲液 对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸 乙液乙液 -奈胺奈胺结果：出现红色为阳性。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，硝酸盐没有被还原，试验阴性；试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确
7、实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。如有气泡产生，表示有氮气生成。过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验(触酶试验触酶试验)原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。试剂：试剂：3 3过氧化氢溶液。过氧化氢溶液。方法：取待测菌涂在玻片上，然后加方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3 3过氧化氢数
8、滴立过氧化氢数滴立即观察结果。即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。氧化酶试验氧化酶试验原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C C氧化，氧化，再由氧化型细胞色素再由氧化型细胞色素C C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。合物。试剂：试剂：1 1盐酸四甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺或1 1盐酸二甲基对苯二胺。盐酸二甲基对苯二胺。方法：
9、取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。方法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。结果：细菌在与试剂接触结果：细菌在与试剂接触1010秒内呈深紫色，为阳性。秒内呈深紫色，为阳性。克氏双糖铁琼脂（克氏双糖铁琼脂（KIA） 葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖1 10铁：枸橼酸铁铵铁：枸橼酸铁铵指示剂：酚红指示剂：酚红我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。葡葡葡葡（）（）（）（）葡葡葡葡（）（）（）（） 葡葡葡葡（）（）（）（）葡葡葡葡（）（）（）（） 乳乳乳乳（）（）（）（） 乳乳乳乳（）（）（）（） 乳乳乳乳（）（）（）（）HH2 2S S（）（）（）（
10、）乳乳乳乳（）（）（）（）克氏双糖铁琼脂（克氏双糖铁琼脂（克氏双糖铁琼脂（克氏双糖铁琼脂（KIAKIA）原理原理以葡萄糖，乳糖为例以葡萄糖，乳糖为例葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。斜面斜面1 1、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也大大氧化氧化丙酮酸丙酮酸 COCO2 2H H2 2O O中性，中性，PHPH不变不变2 2、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生NHNH3 3，碱
11、性，碱性，酚红指示剂为红色。酚红指示剂为红色。高层高层高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在2424小时内小时内不会被氧化，因此仍为黄色。不会被氧化，因此仍为黄色。结果结果高层黄色斜面红色高层黄色斜面红色如葡萄糖，乳糖，则高层与斜面均为黄色（如葡萄糖，乳糖，则高层与斜面均为黄色（2424小时内）小时内）。如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变为红色。为红色。有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨
12、酸等，有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢生成硫化氢H H2 2S SFeFe 黑色的硫化亚铁黑色的硫化亚铁问：有无葡萄糖，乳糖的情况？为什么问：有无葡萄糖，乳糖的情况？为什么？MIU试验试验半固体半固体M M代表动力代表动力I I代表吲哚（靛基质）代表吲哚（靛基质）U U代表尿素代表尿素结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二管变红为尿素阳性），然后加入管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观对二甲基氨基苯甲醛，观察吲哚试验结果。察吲哚试验结果。思考题：思考题： KIA的试验原理的试验原理实验内容实验内容1 1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征2 2、将四种试验细菌接种各种生化反应管：、将四种试验细菌接种各种生化反应管：O-FO-F管管2 2支，支，KIAKIA、MIUMIU、硝酸盐还原各硝酸盐还原各1 1支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水2 2支。接种支。接种完毕放置完毕放置3535培养培养18-2418-24小时。小时。3 3、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。
