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1、药品微生物检验基本技术药品微生物检验基本技术中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所刘少佐刘少佐2010年年 web site: e-mail: tel:010-67095509 地址：北京市天坛西里地址：北京市天坛西里2 2号号 邮编：邮编：100050100050 药品微生物检验基本技术药品微生物检验基本技术l1、认识微生物l2、微生物分离l3、微生物培养l4、微生物鉴别l5、溯源性分析l6、保藏与应用l7、安全与防护l8、消毒与灭菌2 2中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所1、认识微生物l微生物定义l原核生物与真核生物l细菌与真菌（霉菌及酵母菌）l需气菌与厌氧菌3 3中国药品
2、生物制品检定所中国药品生物制品检定所1、认识微生物药品微生物检验常用标准菌株枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CMCC（B）63 501金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC（B）26 003生孢梭菌 Clostridium sporogenes CMCC（B）64 941铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa CMCC（B）10 104大肠埃希菌 Escherichia coli CMCC（B）44 102白色念珠菌 Candida albicans CMCC（F）98 001黑曲霉 Aspergillus niger CMC
3、C（F）98 0034 4中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所1、认识微生物菌种编号CMCC 中国医学菌种保藏中心lCMCC（F）或 CMCC（B）lB 代表细菌、F 代表真菌ATCC 美国标准菌种收藏所 著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等共计16000株以上的微生物种株。5 5中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所1、认识微生物l微生物的生长（population growth）与代时（generation time） 不同微生物的代时范围是20min10h 大肠埃希菌：20min 枯草芽孢
4、杆菌：28min 金黄色葡萄球菌：30min 铜绿假单胞菌：35min 大肠埃希菌20min繁殖一代，繁殖13h后，其子代细胞数可以达到1 1013个（约等于人体全部细胞数），培养24h后子代细胞数则可以达到4.7 1021个6 6中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所1、认识微生物l微生物分布l药品中的微生物7 7中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所2、微生物分离微生物收集l气体环境：气体采样仪l液体环境：直接接种、薄膜过滤l固体环境：触皿、搽拭、洗涤与匀浆微生物分离8 8中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所3、微生物培养培养条件l培养基l培养温度l需氧与厌氧培养目的l
5、增菌培养l纯培养l鉴别培养9 9中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所平板划线分离法 斜面接种时的无菌操作 1010中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所4、微生物鉴别l培养形态l微观分析l生化鉴定lDNA鉴定BIOLOG GenIII MicroStation自动快速微生物鉴定仪 革兰染色液套装与bioMrieux微生物鉴定试剂盒 1111中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所5、溯源性分析l相似性分析BRUKER TENSOR27/HTS-XT傅立叶变换红外光谱(FTIR)微生物分析系统 1212中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所6、保藏与应用样品分离菌库环境监
6、控菌库标准菌种菌库标准菌种的保藏与应用 使用频繁 传代限制（5代）1313中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种的保藏与应用 干干菌种(安瓿)的开启：1414中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种的保藏与应用 菌种保藏及应用参考方法： 干菌种（0 0代）代） 100ml液体培养基复苏（1 1代）代） 100ml液体培养基复壮（2 2代）代） 加100ml 20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20或-80保存 每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（3 3代）代）注意：已经
7、解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！1515中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液l菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。l各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。1616中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液参考菌液制备标准程序： 取经35培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9
8、ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）；1717中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液参考菌液制备标准程序： 取经35培养1824小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用；1818中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液参考菌液制备标准程序： 取经25培养1824小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用；1919中国药品生物制品检
9、定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液参考菌液制备标准程序： 取经25培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。 2020中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液关于黑曲霉： 转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；置2328培养57日，培养斜面形态可参照下图；转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121湿热灭菌30分钟再作处理；2121中国药品生物制品检定所中
10、国药品生物制品检定所标准菌种实验用菌液关于黑曲霉： 黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4 0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。关于新鲜培养物（USP31/Chp2010）：制备的菌液应在2小时内使用，保存在28的菌液可以在24小时内使用。对于具有稳定的孢子形态的黑曲霉和枯草芽孢杆菌，作为使用新鲜培养物稀释液的替代方法，可以使用孢子储备液，在验证过的期间内，其稳定的孢子储备液可以保存在28一直使用。2222中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所关于黑曲霉图15 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 0
11、03改良马丁琼脂斜面典型斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。 黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4 0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。2323中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所关于黑曲霉第第2 2天天第第3 34 4天天第第4 45 5天天第第5 57 7天天图14 黑曲霉改良马丁琼脂斜面不同培养时间的生长形态2424中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所关于黑曲霉一类新药一类新药IMM018IMM0182525中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所标准菌种实
12、验用菌液菌液检验：结合验证实验方法进行活菌计数。生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。2626中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所7、安全与防护l洁净实验室lPII级生物安全实验室l生物安全柜2727中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所8、消毒与灭菌消毒l消毒是指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。l凡用于消毒的化学药品称为消毒剂(disinfectant)。消毒剂有液态、固态和气态。消毒剂按其杀灭微生物的能力一般分三级：高效消毒剂-指可杀灭所有种类微生物（包括细菌芽孢）的消毒剂，如戊二醛、过氧乙酸等；中
13、效消毒剂-指可杀灭细菌繁殖体（包括结核杆菌）、大多数种类的病毒与真菌（不包括细菌芽孢）的消毒剂，如乙醇、氯代二甲苯酚等；低效消毒剂-指可杀灭大多数细菌与一些种类的病毒和真菌（不包括结核杆菌和细菌芽孢）的消毒剂，如氯己定、苯扎溴铵等。2828中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所8、消毒与灭菌灭菌l凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。灭菌的手段，称为灭菌法。灭菌的设备，称为灭菌器。准确地讲，灭菌法是指用适当的物理或化学手段将物品中的微生物杀灭或除去的方法。常用的物理方法有：热力、辐照灭菌、物理阻留过滤除菌，还有脉动强光和等离子体、气体灭菌等灭菌方法。l在药品检验工作中，常常涉及对培养基和器材的灭菌，无论采用何种方法，都应考虑到原有成分的稳定性和安全性，对灭菌条件除要求灭菌完全之外，还必须保证被灭菌物质成分不被破坏，不影响检验结果。2929中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所
