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1、药品的卫生学检查方法介绍药品的卫生学检查方法介绍 2l无菌室的质量管理l药品的微生物限度检查l药品的无菌检查3无菌室的要求l位置选择l面积大小l洁净度l采光l紫外杀菌l门l人流物流l地面墙面4无菌室的管理l陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备l无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。l人员：肥皂洗手，0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。l操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，手不能来回出入操作台。l在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气湿气，用紫外灯杀菌半小时。l非无菌室工作人员不得进
2、入，对外来维修人员要进行监督。l缓冲间不得放杂物、培养箱等。l定期对门、窗、墙面等消毒。l定期检查洁净度情况。5洁净度的要求度的要求应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。6l尘埃粒子埃粒子l洁净级别尘粒数/m3活微生数（个）/m3l0.5um5uml100级3,50005l1000级350,00020,00100l100000级3,500,00020,000500lGB/T16294-1996l沉降菌沉降菌l洁净级别个/（）l100级1l1
3、0000级3l100000级107菌种保存、复壮及管理l保存原则l保存方法l复壮l管理8菌种的保存原则l挑选特征典型的纯菌菌落l确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存l选择最适宜的保存方法进行保存l定期对保存的菌种进行检查9菌种保存的常用方法l琼脂斜面低温保存法l甘油冷甘油冷冻管保藏法管保藏法l半固体琼脂斜面低温保存法l液体石蜡保存法l超低温保存法（菌种）l砂土10菌种的复壮l分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的分离l通过宿主复壮l淘汰退化l理化因素诱变11菌种的管理l专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等l定期
4、有专人按操作规程进行传代接种l菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研究处理。l实验菌种不得任意带出l使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理12菌种金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 2600326003铜绿假假单胞菌胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 1010410104生生孢梭菌梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941
5、(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941白色念珠菌白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001(Candida albicans) CMCC(F) 98001黑曲霉黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98003(Aspergillus niger) CMCC(F) 98003大大肠埃希菌埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44102(Escherichia coli) CMCC(B) 44102枯草芽枯草芽孢杆菌杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 6350
6、1(Bacillus subtilis) CMCC(B) 6350113菌液的制备（1）l接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，使细菌数约为10100cfu/ml。14菌液的制备（2）l接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，2328培养1824小时，取此培养物1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，使细菌数约为50100cfu/ml。15菌液的制备（3）l接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
7、养基上，2328培养57天，加35ml0.9无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-6，使细菌数约为50100cfu/ml。16药品微生物限度品微生物限度检查方法介方法介绍172005年版微生物限度标准的应用微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等
8、，除另有规定外，其微生物限度检查均以本标准为依据。检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。182005年版微生物限度标准的分类l1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法的规定。l2、口服给药制剂l3、局部给药制剂3.1.用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌3.2.眼部给药制剂：3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂3.4、阴道、尿道给药制剂3.5、直肠给药制剂3.6、其它局部给药19l4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂l5、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准l6、霉变、长螨者以不合格论l7、原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行20供试品
9、的抽样及检验取量l一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量（以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够各种菌检查用的溶液）。l所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。l固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。l液体制剂检验量为10ml。l膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及生化药膜剂检查量为10cm2。l抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。l凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。21供试品的保存l供试
10、品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。l供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。22细菌、霉菌、酵母菌计数23实验前的准备工作l将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）量筒等移到无菌室内，每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入，操作编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。l开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。l操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴无菌
11、衣、帽、口罩、手套。l操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。24平板菌落计数法l供试液制备（10倍递增稀释）l注平皿l倒培养基摇合（45营养琼脂玫瑰红钠琼脂YPD琼脂培养基）l倒置培养（303548小时；252872小时）l菌落点数（30300个30100个）l菌数报告（10条原则）25供试液的制备（1）l乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。l水浴加温时，温度不超过45，时间不超过30分钟。l供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。l供试液的体积：最终体积为100ml。26供试液
12、的制备（2）l稀释剂：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液l肠溶制剂pH7.6磷酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液l非水溶性供试品乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消毒）。十四烷酸异丙酯萃取或过滤27供试液的制备（3） 液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml ，摇匀，作为1:10供试液。 含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。l固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入稀释剂至100ml ，用匀浆仪（3000-5000r/，24min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃
13、溶胶囊加稀释剂后置 451水 浴 振 摇 ， 肠 溶 胶 囊 加 无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 液 后451水浴振摇。28供试液的制备（4）l非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到含已灭菌溶化并45保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混匀后，慢慢加入45左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作供试液（1:20）。l油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 5 8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。l栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45水浴保温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨
14、酯80总量为100ml），摇匀。29供试液的制备l气雾剂，将供试品置冰箱（4-8）1h，取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯80液）此液即为供试品原液。l膜剂 将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，于451水浴中保温，振摇使溶。l茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至100ml，振摇30s,以灭菌纱布过滤，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。l
15、以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂，制成1:201:100供试液。 30供供试品溶液的制品溶液的制备（5）（）（含抑菌成分的供试品） 稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清液再离心集菌薄膜过滤法：0.45um的滤膜，冲洗3次，每次至少100ml中和法：磺胺类100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml砷、汞类100ml硫乙醇酸盐培养基洗必泰类100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中31供试液的稀释
16、（10倍递增稀释法）l10g100ml1:101ml10ml1:1001ml10ml1:1000l至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。l管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后将吸管放入消毒液缸内。32注平皿l在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注2-3个平皿（此时一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕
17、后，用1支1ml吸管取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。33倒培养基摇合l将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂、霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另用YPD琼脂）熔化、冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，混匀时切勿将培养基，溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。34倒置培养l培养细菌计数平板倒置于30-35培养箱中培养48h。l霉菌、酵母菌计数平板倒置于23-28培养箱中培养72h。35菌落计数l
18、细菌数选取平均菌落数在30300之间的稀释级。l霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30100之间的稀释级。因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。36菌落报告原则l如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30-100）之间，则将该稀释级的菌落乘以稀释倍数报告。稀释菌落数平均值报告10 1 280 260 270 27010270010 2 29 28 10 3 3 2 37l如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30-100）时，则按比值计算。当比值2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。l高稀释级平均菌落数稀
19、释倍数l比值=l低稀释级平均菌落数稀释倍数l稀释菌落数平均值10 1 大于大于300（无法（无法计数）数） 10 2 280 260 27010 3 38 40 39比值39000/270001.4小于2报告(27000+39000)/23300038l如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30-100）时，则按比值计算。当比值大于2，小于5时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。l高稀释级平均菌落数稀释倍数l比值=l低稀释级平均菌落数稀释倍数l稀释菌落数平均值10 1 大于大于300（无法（无法计数）数） 10 2 280 260 27010 3 80 100 90比值90000/
20、270003.3大于2报告2701002700039l若比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数时，应查明原因，若操作没有问题，说明有抑菌情况，应重新进行方法学验证。40如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。稀释菌落数平均值报告10 1 10 12 11 1110 11010 2 2 3 10 3 1 3如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均落数小于1小时，应报告菌数为1稀释倍数个/g或ml。41实验中的注意事项l（a）培养基及其制备方法（6条）l（b）操作技术（12条）l（c）结果判断（3条）l（d）异常情况处理（3条）42培
21、养基配制的注意事项l采用干燥培养基，按说明配制，灭菌后对培养基pH值进行校验。l配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。l培养基的分装量一般不超过容器的1/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。l培养基配制后在2h内灭菌，避免细菌繁殖，影响灭菌效果。l灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，一般不超过1个月，倒好的碟子不过35天，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，不能反复使用。l不用电炉直接熔化，以免局部过热营养成份被破坏。应用水浴或微波炉加热。43操作技术中的注意事项l将物品一次准备完全，避免来回出入操作台、无菌室，
22、全过程必须符合无菌技术要求。l不溶于水的样品，必须加乳化剂、助溶剂等溶解后操作。l勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭。加完稀释剂后，试管塞就立即塞上。l快速吸管、吹打，不能用嘴吹吸，吸管内放棉花l管尖不许接触可能污染的任何容器或用具l稀释时每一级换管（原吸管不要吹洗），上一级吸管不能接触下一级稀释液44l取均匀供试液稀释、注平皿（特别注意研细）上清液和沉淀物影响测定结果l注平皿时，要求管内不残留溶液l3.3制最准确，即3级稀释，3个平皿，但厂方也可根据自己品种选择l培养基严格控制在451，水浴。l培养基摇合快速、均匀，不要溅到皿边和皿盖上。l从稀释到倾注培养基全部操作在1小时
23、内全部完成。45结果判断的注意事项l不要漏计细小的（可适当延长培养时间）、琼脂内和平皿边缘生长的菌落l注意细菌、酵母菌及霉菌的区别，以及菌落与药渣、培养基沉淀、药物结晶的区别l平均菌落在15个以下时，二个平皿的菌落数不在04，17，29，310，412，514，615范围内；平均菌落在15个以上时，二个平皿菌落数超过1倍；三级菌落数不能显示差别。不能计数需重新实验。46异常情况处理l菌落蔓延l1.加TTC（1000ml营养琼脂加1的TTC1ml）l2.开盖干燥（倒置斜放12h）l3.换陶瓦盖（干热灭菌的）l异常菌落数报告法细菌平皿上长霉菌、霉菌平皿上长细菌，哪个多，以哪个计数，不能相加计数。4
24、7控制菌检查48大肠埃希菌l方法MUGIndole法l原理大肠埃希菌具有D葡萄糖醛酸苷酶，能将底物4-甲基伞形酮D葡萄糖醛酸苷水解成为4-甲基伞形酮，在365nm波长处显蓝紫色荧光。49操作步骤l增菌培养l分离培养l纯培养l革兰氏染色l生化实验50l增菌培养增菌培养取胆盐乳糖（BL）培养基3瓶，每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌50100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照，37培养1824小时。取0.2ml滴于MUG管内（5ml)，37培养，4、24hr后366nm下观察荧光，然后加靛基质试液45滴，观察液面颜色。分离培养分离培养将BL增菌培养
25、液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或Macc平板上，培养1824h，观察平板上有无可疑大肠埃希菌菌落生长。51菌落形态EMB：紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽Macc：鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。52纯培养培养如生长菌落与大肠埃希菌特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑菌培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种EMB琼脂平板，培养1824h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。生化生化试验（IMVIC)靛基质试验（I）。甲
26、基红试验（M）乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）枸橼酸盐利用试验（C）乳糖发酵试验革革兰氏染色、氏染色、镜检革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。53结果判断MUG-IEMBIMVic结果无菌无菌有菌有菌检出未检出未检出未检出检出检出54注意事项lMUG法不必从混合菌中分离单个菌落。l配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得超过7.4l培养时间：一般在4h、24h观察，如荧光很微弱，可延长至48hl结果观察：取供试品、阳性、阴性管同时在366mm紫外灯下观察l务必挑选23个以上菌落纯培养，分别做IMViC试验鉴别。l在IMViC试验中，
27、切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。l枸橼酸盐利用试验培养时间为2-4天。l阳性对照必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境。l大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。55沙门菌l沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，沙门菌分5个亚属，药品中沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每g（或ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。56操作步骤l增菌培养增菌培养预增菌增菌：取营养肉汤培养基3瓶，100ml。2瓶分别加入10ml的供试液，其中1瓶加入对照菌50100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照，37培养1824小时。增菌增菌：1ml
28、预增菌接种至四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）10ml，37培养1824小时。分离培养分离培养将TTB增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于DHL或S.S平板上及EMB或Macc平板上，培养1824h，观察平板上有无可疑菌落生长。疑似菌落为透明半透明无色或微显培养基色在含H2S指示系统培养基上菌落中心呈黑色57l初步初步鉴别三糖铁琼脂培养基（TSI）红/黄H2S，红/黄H2S，黄/黄H2Sl血清凝集血清凝集试验直接凝集(0多价1血清）煮沸30分钟后凝集试验l革革兰氏染色氏染色革兰氏阴性杆菌l生化生化试验靛基质试验，脲酶试验，氰化钾试验，赖氨酸脱羧酶试验，动力试验58结果判断凝集反应煮沸
29、凝集0.9NaCl对照生化试验 结果+符合符合不符合检出检出未检出59注意事项l分离平板在使用前应置36温箱内倒置孵育1-2h，使其表面温暖湿润，利于分离。l在对供试品进行测试的同时，需做阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长，阳性对照应显示阳性结果，否则检验结果无效。l对分离平板上的疑似菌落，应多选取几个菌落同时进行试验。挑取菌落时，在菌落分布稀疏部位挑选。l生化试验及血清学试验的被鉴定的培养物必须是纯培养物，否则，不可能得到正确结果。l三糖铁琼脂斜面反应的时间，应在242h，时间过短过长，都可能出现错误的结果判断。氰化钾试验，试管口应密塞，否则氰化钾浓度降低，致使抑菌作用下降。l血清凝集
30、试验的影响因素多，除与电解质、pH、温度有关外，须特别注意抗原与抗体用量的比例恰当，本法试验用多价血清，其凝集力相对较弱，试验用菌液量切不能过大。测试前，可用已知阳性菌测试以掌握适宜菌液浓度。l沙门菌为肠道重要致病菌，操作时应特别注意防止分离待检菌及阳性对照菌对操作环境及试验的污染。所有用过的增菌、分离、生化试验培养基、血清学凝集试验及染色镜检后的玻片等，均需经灭菌后方能洗涤。60铜绿假单胞菌 l铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。l本菌
31、是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤，眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然耐药性，增加了治疗的难度、国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为外用药物检查项目之一。61操作步骤l增菌增菌：BL100ml3份l分离培养：分离培养：溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于37培养1824h。典型菌落：灰白色扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，周边略呈扩散现象，菌落周围呈蓝绿色，但也有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。l纯培养：培养：营养琼脂斜面l革革兰氏染色：氏染色：阴性，无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列l生化生化试验：氧化酶试验，绿脓菌素试验，硝酸盐还原产气试
32、验，41生长试验，明胶液化试验62结果判断lG生化1、2阳性阳性报告lG生化1阳性、2阴性且3、4、5均为阳性阳性报告63金黄色的葡萄球菌 l金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界，空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中的重要病原菌。64操作步骤l增菌增菌：营养肉汤（亚碲酸钠肉汤）100ml3份l分离培养：分离培养：卵黄氯化钠平板，甘露醇氯化钠平板，血平板l典型菌落：金黄色、圆形凸起、边
33、缘整齐，光滑湿润，有乳浊圈（卵黄氯化钠平板），黄色环（甘露醇氯化钠平板），透明溶血环（血平板）l纯培养：培养：营养琼脂斜面l革革兰氏染色：氏染色：革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列l生化生化试验：血浆凝固酶试验65结果判断lG球菌、血浆凝固酶试验阳性，报告阳性66无菌检查法的介绍67 表表1 1 批批产品出厂最少品出厂最少检验数量数量供供试品品批批产量量N N（个）（个）每种培养基最少每种培养基最少检验数量数量注射注射剂10010010%10%或或4 4个（取个（取较多者）多者）100100N500N5001010个个5005002%2%或
34、或2020个（取个（取较少者）少者）大体大体积注射注射剂（100100 mlml）2%2%或或1010个（取个（取较少者）少者）眼用及其他非注射眼用及其他非注射产品品2002005%5%或或2 2个（取个（取较多者）多者）2002001010个个桶装固体原料桶装固体原料44每个容器每个容器4 4N50N5020%20%或或4 4个容器（取个容器（取较大者）大者）50502%2%或或1010个容器（取个容器（取较大者）大者）68抗生素固体原料抗生素固体原料药（5 5克）克）6 6瓶瓶( (支支) )医医疗器具器具10010020%20%或或4 4件（取件（取较大者）大者）100100N500N5
35、001010件件5005002%2%或或2020件（取件（取较少者）少者）注：注：1.1.每种培养基各接种每种培养基各接种1010支供支供试品。品。 2.2.抗生素粉抗生素粉针剂（5 5克）及抗生素原料克）及抗生素原料药（5 5克）的最少克）的最少检验数数量量为6 6瓶（或支），桶装固体瓶（或支），桶装固体原料原料的最少的最少检验数量数量为4 4个包装。个包装。 3.3.如果医用器械体如果医用器械体积过大，培养基用量可在大，培养基用量可在2000ml2000ml以上，将其完全以上，将其完全浸没。浸没。 69 表表2. 2. 上市抽上市抽验样品（液体制品（液体制剂）的最少）的最少检验量量供供试品
36、装量品装量V(ml)V(ml)每支每支样品接入每管培品接入每管培养基的最少量（养基的最少量（mlml）最少最少检验数量（瓶或数量（瓶或支）支）11全量全量 20 201 11 1V V5 5半量半量10105V5V20202 2101020V20V50505 5101050V50V10010010 10 101050V50V100(100(静静脉脉给药) )半量半量1010100V100V500500半量半量6 6V 500V 5005005006 61.1.每种培养基各接种每种培养基各接种1010支供支供试品。品。70 表表3 3 上市抽上市抽验样品（固体制品（固体制剂）的最少）的最少检验量
37、量供供试品装量品装量M M（mg/mg/支支或瓶）或瓶）每每支支样品品接接入入每每管管培培养基的最小量（养基的最小量（mgmg）最少最少检验数量（瓶或数量（瓶或支）支）M 50M 50全量20（1）50M30050M300半量半量1010300M5g300M5g1501501010M5gM5g50050010102 2外外科科用用敷敷料料棉棉花花及及纱布布取取100 mg 100 mg 或或1cm3cm1cm3cm1010缝合合线、一一次次性性医医用用材料材料整个材料整个材料3 31010带导管管的的一一次次性性医医疗器具（如器具（如输液袋）液袋）1010其它医其它医疗器具器具整个器具整个器具
38、3 3（切碎或拆（切碎或拆散开）散开）101071注：1.每种培养基各接种10支供试品。 2.抗生素粉针剂（5克）及抗生素原料药（5克）的最少检验数量为6瓶（或支），桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。 3.如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。 72大容量（50-100ml注射剂），取半量检查。表1，2，3中最少检验量不包括阳性对照试验的用量。薄膜过滤法 增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；直接接种法 增加供试品1支作阳性对照。采用直接接种法，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基时，则应接种硫乙和马丁培养基。 采用薄膜过滤法，其检验量不少于直接接
39、种法的总量，只要供试品特性允许，可将容器内容物全部过滤。 73阳性对照 l应根据供试品的特性选择相应的阳性对照菌： 1、无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌； 2、抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌； 3、抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 4、抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。l加菌量为小于100cful供试品用量 同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量（见表2、表3）。l阳性对照管培养4872小时应生长良好。 74阴性对照 每次无菌检查所用的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。75检查法检查法 有直接接种法和薄膜过
40、滤法。只要供试品允许，可优先采用薄膜过滤法。 如果容器内有一定的真空度，可用带有除菌过滤器的针头，向检品容器内导入无菌空气。 各供试品检查时，所用培养基的装量必须以“验证试验”的结果而定。76薄膜过滤法l无菌检查用的滤膜孔径为0.45m与直径为50mm。l封闭式滤器和开放式滤器。l根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。l滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；l水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。l过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面；l冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为
41、100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。77直接接种法 直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%(表2)，用量和培养基的高度同方法验证试验； 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。78培养及观察 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2日、真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。79结果判断 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定； 若供试品管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。80谢谢81
