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1、流式细胞术的参考流式细胞术的参考样品样品河北省肿瘤研究所河北省肿瘤研究所一一 参考标准样品在参考标准样品在FCM使用的意义使用的意义参考标准样品在参考标准样品在FCM中使用，为了监测仪器的中使用，为了监测仪器的液流液流电子和各个光学系统的稳定性，校正和电子和各个光学系统的稳定性，校正和调试仪器的调试仪器的CV值，最大限度的提高仪器的分辨值，最大限度的提高仪器的分辨能力能力 1.调整仪器在高性能的状态下工作。调整仪器在高性能的状态下工作。 2.由于由于FCM的测量是相对的，而不是绝对的，的测量是相对的，而不是绝对的，所以参考细胞有助于单个样品或一组样品的测所以参考细胞有助于单个样品或一组样品的测
2、量参数的解释。量参数的解释。 3.参考标准细胞可供监测工作状态下仪器的稳参考标准细胞可供监测工作状态下仪器的稳定性，以使所测参数具有可靠性和可比性。定性，以使所测参数具有可靠性和可比性。 4参考细胞可被用于监测染色过程。参考细胞可被用于监测染色过程。 5能够用于校验能够用于校验FCM分选术的回收和纯度。分选术的回收和纯度。参考细胞的主要作用如下参考细胞的主要作用如下:二、二、 标准细胞样品具备的特性标准细胞样品具备的特性一个标准样品，应具有较恒定的体积大小一个标准样品，应具有较恒定的体积大小具有较恒定荧光发射量子具有较恒定荧光发射量子细胞的形状较一致细胞的形状较一致在液流中的流动取向较一致在液
3、流中的流动取向较一致在悬液中可保持高度的单分散状态，放置较长在悬液中可保持高度的单分散状态，放置较长时间不会聚集、不改变其形状、体积大小及其时间不会聚集、不改变其形状、体积大小及其光学特性光学特性1. 外标法外标法标准样品在流式分析实验样品前或后，上仪器标准样品在流式分析实验样品前或后，上仪器测量，以校正仪器在工作条件下稳定性。测量，以校正仪器在工作条件下稳定性。缺点缺点 由于参考样品与实验样品不同步染色，由于参考样品与实验样品不同步染色，以及在实验过程中仪器条件的漂移，可能引起以及在实验过程中仪器条件的漂移，可能引起定量检测的误差，因此，近年在流式细胞定量定量检测的误差，因此，近年在流式细胞
4、定量检测中已被摒弃。检测中已被摒弃。参考标准的使用方法参考标准的使用方法2. 内标法内标法内标法是将标准样品与实验样品按一定的细胞内标法是将标准样品与实验样品按一定的细胞数混悬在一起进行同步染色数混悬在一起进行同步染色,这种方法可以避这种方法可以避免外标法引入的误差免外标法引入的误差,可以避免因染色、光源可以避免因染色、光源强度的瞬时波动，以及细胞流速的变化和流束强度的瞬时波动，以及细胞流速的变化和流束与激光束焦点的漂移造成的实验结果偏差。与激光束焦点的漂移造成的实验结果偏差。内标法可保证标准样品与实验样品在同样条件内标法可保证标准样品与实验样品在同样条件下制备和测量，可使测量误差降到最小限度
5、。下制备和测量，可使测量误差降到最小限度。内标法在流式细胞测量术中已广泛应用。内标法在流式细胞测量术中已广泛应用。三、参考样本的制备方法三、参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本 塑料微球已广泛应用于参考标准样品，这些塑塑料微球已广泛应用于参考标准样品，这些塑料小球可分为两种：料小球可分为两种：1. 无荧光塑料小球无荧光塑料小球可用于散射光的校正，此种统一大小无荧光微可用于散射光的校正，此种统一大小无荧光微球，对于校正仪器光散射是非常有用的。最好球，对于校正仪器光散射是非常有用的。最好采用采用10m大小（与正常人淋巴细胞大小相似）大小（与正常人淋巴细胞大小相似），通过微球大小的测量，可
6、以对实验样品细胞，通过微球大小的测量，可以对实验样品细胞的面积，直径，横截面积和体积作出相对大小的面积，直径，横截面积和体积作出相对大小的判断。的判断。2. 标记有荧光染料的塑料微球标记有荧光染料的塑料微球标记荧光染料多选用标记荧光染料多选用PI、EB、FITC、AO等，等，荧光染色的塑料微球可用于调整和监测光散射荧光染色的塑料微球可用于调整和监测光散射和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结合的荧光的数目和细胞体积的大小进行较准确合的荧光的数目和细胞体积的大小进行较准确的计算。的计算。流式细胞仪对于微球分辨率的大小，取决于微流式细胞仪对于微球分辨率的大
7、小，取决于微球大小是否一致，分辨率的大小一般用变异系球大小是否一致，分辨率的大小一般用变异系数数(Coeffience of Variation CV)来表示，目前来表示，目前有的生产厂家出售的商品微球已标明有的生产厂家出售的商品微球已标明cv值。值。美国生产微球有如下公司的产品：美国生产微球有如下公司的产品：1.DOW Diagnostics 2.02m2.PolyscienCes Inc 400Valley Road Warrmgton PA 18979 1.75 m3.Becton Dickinson Conpany Production 1.75 m,2.02 m以上几种微球在以上几种
8、微球在FACS仪器上，光散射仪器上，光散射CV值为值为1.2%，荧光，荧光CV值为值为2.2%(为浅黄色荧光为浅黄色荧光)。4.Duke Standard SamPLe 5.1 m5.Counter Electronics Inc 10 m这两种微球的这两种微球的CV值为光散射值为光散射2%，荧光，荧光2.8%。非生物性塑料小球可作为长期使用于流式的标非生物性塑料小球可作为长期使用于流式的标准样品，其配制方法和保存方法根据出售厂家准样品，其配制方法和保存方法根据出售厂家的产品说明。但各种微球多要避光保存，因白的产品说明。但各种微球多要避光保存，因白炙光可使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保存炙光可
9、使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保存要防止冷冻结冰和悬液干燥破坏微球，在长期要防止冷冻结冰和悬液干燥破坏微球，在长期使用过程中或换批号使要做对比鉴定。使用过程中或换批号使要做对比鉴定。 生物性标准样品生物性标准样品1. 某些生物性颗粒某些生物性颗粒 可作为短期标准，例如植物花粉、一些真菌等，可作为短期标准，例如植物花粉、一些真菌等，可作为体积大小的光散射标准，但是由于其准可作为体积大小的光散射标准，但是由于其准确性较差，产生误差较大，且在水中不易保存确性较差，产生误差较大，且在水中不易保存和易发生体积大小、光学型号特征等方面的变和易发生体积大小、光学型号特征等方面的变化，因此很少在流式细胞术中使
10、用。化，因此很少在流式细胞术中使用。鸡红细胞的制备：鸡红细胞的制备：鸡红细胞在体内为一终末细胞，其鸡红细胞在体内为一终末细胞，其DNA含量是含量是均一致的，相当于正常人淋巴细胞均一致的，相当于正常人淋巴细胞(二倍体细二倍体细胞胞)DNA含量的含量的35%，流式细胞术测定其，流式细胞术测定其DNA含含量分布组方图。所得结果为单一狭窄、对称的量分布组方图。所得结果为单一狭窄、对称的正态峰，在前向光散射组方图上表现为两个正正态峰，在前向光散射组方图上表现为两个正态峰。出现两个光散射正态峰的原因是鸡血红态峰。出现两个光散射正态峰的原因是鸡血红细胞呈盘状，在流过光探测敏感区时，由于细细胞呈盘状，在流过光
11、探测敏感区时，由于细胞所处的取向不同，造成前向光散射强度不同，胞所处的取向不同，造成前向光散射强度不同，因此在光散射组方图上出现不同大小的光散射因此在光散射组方图上出现不同大小的光散射信号，即呈两个正态分布的组方图。信号，即呈两个正态分布的组方图。生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡血红细胞即可作为鸡血红细胞即可作为DNA内参标准，也可以作内参标准，也可以作为调整仪器的标准样品，美国为调整仪器的标准样品，美国Stanford大学医大学医学部成功的使用鸡血红细胞调试仪器，其学部成功的使用鸡血红细胞调试仪器，其CV值值最好可达最好可达2%，用戊二醛固定的鸡红细胞可发，用戊二醛固定的鸡红细胞可发出自发
12、荧光，在不染色的条件下，其激发光谱出自发荧光，在不染色的条件下，其激发光谱和发射光谱与荧光素和罗丹明极接近，美国和发射光谱与荧光素和罗丹明极接近，美国Beckton Dickison生产的生产的FACS仪器上，其荧仪器上，其荧光分布的单峰光分布的单峰CV值在值在10%左右。左右。鸡血红细胞作为内参标准样品，放入实验样品鸡血红细胞作为内参标准样品，放入实验样品的比例为的比例为510:100。鸡血红细胞制备简单，。鸡血红细胞制备简单，来源丰富，价格低廉，是一种值得提倡的内参来源丰富，价格低廉，是一种值得提倡的内参标准。标准。 虹鳟鱼红细胞标准样品的制备：虹鳟鱼红细胞标准样品的制备：鳟鱼血细胞的鳟鱼
13、血细胞的DNA含量相当于人二倍体细胞含量相当于人二倍体细胞(人淋巴细胞人淋巴细胞)80%左右，由于其左右，由于其DNA含量接近含量接近于人的二倍体细胞，其计算比值产生的误差较于人的二倍体细胞，其计算比值产生的误差较小，鳟鱼红细胞小，鳟鱼红细胞DNA含量均一含量均一 .近年来，已有大量报道使用该细胞作为近年来，已有大量报道使用该细胞作为DNA定定量检测的内参标准或仪器校正的标准样品，量检测的内参标准或仪器校正的标准样品，Vindelov等使用鳟鱼和鸡血细胞作为双内参标等使用鳟鱼和鸡血细胞作为双内参标准，比较了鳟鱼细胞和鸡血细胞与二倍体细胞准，比较了鳟鱼细胞和鸡血细胞与二倍体细胞DNA含量的计算比
14、值，结果发现鳟鱼细胞与二含量的计算比值，结果发现鳟鱼细胞与二倍体细胞倍体细胞DNA比值误差较小。比值误差较小。 鸡血红细胞和鳟鱼红细胞鸡血红细胞和鳟鱼红细胞DNA含量，随含量，随着其性别差异有所不同着其性别差异有所不同.表表1 鸡、鳟鱼不同性别红细胞鸡、鳟鱼不同性别红细胞DNA含量含量 细胞类别 雄 雌 P值 鸡红细胞 100.0 96.3 0.001 鳟鱼细胞 100.0 100.6 0.023 人淋巴细胞悬液的制备：人淋巴细胞悬液的制备：正常人外周血中淋巴细胞是一终末细胞，具有正常人外周血中淋巴细胞是一终末细胞，具有细胞核细胞核DNA含量均一，细胞体积大小一致，形含量均一，细胞体积大小一致
15、，形态相似的特点，已作为适用的调整流式细胞仪态相似的特点，已作为适用的调整流式细胞仪的生物性参考样品，并已被确认为一种可靠的的生物性参考样品，并已被确认为一种可靠的二倍体细胞二倍体细胞DNA含量的参考标准，在肿瘤细胞含量的参考标准，在肿瘤细胞DNA倍体的研究中，已广泛用于倍体的研究中，已广泛用于DNA倍体的计倍体的计算标准。算标准。 元鱼血细胞的制备：元鱼血细胞的制备：元鱼血细胞的核元鱼血细胞的核DNA含量相当于人二倍体细胞含量相当于人二倍体细胞的的70%左右，其核左右，其核DNA含量均一，形态大小一含量均一，形态大小一致，国内已有作者采用元鱼细胞作为流式细胞致，国内已有作者采用元鱼细胞作为流
16、式细胞仪的参考指标，其变异系数可达仪的参考指标，其变异系数可达1.8%左右，远左右，远低于鸡血红细胞。其来源丰富，制备简单，一低于鸡血红细胞。其来源丰富，制备简单，一只元鱼可取只元鱼可取10ml血液，在血液，在80oC冰箱中保存冰箱中保存两年以上无任何变化，是实验中理想的生物性两年以上无任何变化，是实验中理想的生物性内参标准细胞。内参标准细胞。四、四、DNA定量分析参考标准定量分析参考标准 Tiersch等选择了等选择了39种脊椎动物细胞，应种脊椎动物细胞，应用流式细胞术定量分析这些动物二倍体细胞的用流式细胞术定量分析这些动物二倍体细胞的DNA含量含量(见表见表2)用于用于DNA含量分析的参考
17、标含量分析的参考标准细胞。准细胞。 标本采集标本采集:使用人末梢血淋巴细胞，牛、狗、使用人末梢血淋巴细胞，牛、狗、猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其他动物均采猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其他动物均采用全血细胞，用全血细胞，(这些动物的全血细胞均为有核这些动物的全血细胞均为有核红细胞红细胞)他们还提出他们还提出DNA含量的计算公式，含量的计算公式，DNA含量的单位以微微克或沙克含量的单位以微微克或沙克Pico gram. Pg 10-9/克来表示。克来表示。 PG7.0(X/S) (S/H) 7.0：二倍体淋巴细胞二倍体淋巴细胞DNA含量值含量值 X：实验细胞组方图中实验细胞组方图中G0/1期细胞峰
18、的均道值期细胞峰的均道值 H：人淋巴细胞人淋巴细胞G0/1峰细胞均道值峰细胞均道值 S：内参考标准细胞内参考标准细胞G0/1峰的均道值峰的均道值对于标准样品细胞对于标准样品细胞DNA含量的计算，不能使用染色体含量的计算，不能使用染色体条数计算条数计算DNA含量。含量。人类的二倍体细胞有人类的二倍体细胞有46条染色体条染色体(DNA含量为含量为7.0)，在，在东南亚有一种小鹿仅有东南亚有一种小鹿仅有6条染色体，但其二倍体细胞条染色体，但其二倍体细胞DNA含量与人二倍体细胞含量与人二倍体细胞DNA含量相似，家马的二倍含量相似，家马的二倍体细胞染色体为体细胞染色体为64条，但其二倍体条，但其二倍体D
19、NA含量比人的二含量比人的二倍体细胞还少约倍体细胞还少约10%。在使用标准样品的过程中，不同的染色和不同的固定在使用标准样品的过程中，不同的染色和不同的固定剂都会出现不同的定量分析结果，作者总结了一些文剂都会出现不同的定量分析结果，作者总结了一些文献报道和我们所测结果，人的淋巴细胞与鸡血红细胞，献报道和我们所测结果，人的淋巴细胞与鸡血红细胞，鳟鱼和元鱼红细胞鳟鱼和元鱼红细胞DNA含量的所测比值含量的所测比值(见表见表3)，还有，还有作者报道标准样品的保存温度和保持时间也会对测定作者报道标准样品的保存温度和保持时间也会对测定结果准确性产生影响，因此在使用标准样品时应严格结果准确性产生影响，因此在
20、使用标准样品时应严格遵照同样染色方法和固定方法。遵照同样染色方法和固定方法。五、肿瘤五、肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准1984年，在洛杉矶召开国际细胞分析学会年，在洛杉矶召开国际细胞分析学会,就就DNA含量分析的二倍体细胞标准作出了规定：含量分析的二倍体细胞标准作出了规定：在在DNA定量分析时，一般应用同种同一个体的定量分析时，一般应用同种同一个体的正常细胞正常细胞DNA含量作为二倍体细胞的标准，禽、含量作为二倍体细胞的标准，禽、鱼类红细胞或荧光微球只能作为仪器准直的标鱼类红细胞或荧光微球只能作为仪器准直的标准样品。准样品。因此，人的末梢血淋巴
21、细胞被广泛用于因此，人的末梢血淋巴细胞被广泛用于DNA二二倍体标准样品细胞，在很多肿瘤细胞倍体标准样品细胞，在很多肿瘤细胞DNA倍体倍体FCM研究中，也使用了人的淋巴细胞、白细胞研究中，也使用了人的淋巴细胞、白细胞和单核细胞等。和单核细胞等。1992年，由美国国立癌症研究中心年，由美国国立癌症研究中心,在亚特兰在亚特兰大组织召开了大组织召开了FCM DNA定量分析的统一标准定量分析的统一标准的国际会议，制定了的国际会议，制定了FCM DNA倍体的标准，倍体的标准，严格使用严格使用DNA二倍体标准样品，二倍体标准样品，DNA倍体的标倍体的标准必须：准必须：同种属，同个体，同样的正常细胞同种属，同
22、个体，同样的正常细胞同样的样品处理方法，同样的固定方法，同样同样的样品处理方法，同样的固定方法，同样的染色方法，和样品细胞与的染色方法，和样品细胞与DNA标准细胞同步标准细胞同步染色，即采用内参考标准。染色，即采用内参考标准。采用双内参标准即仪器准直标准细胞和采用双内参标准即仪器准直标准细胞和DNA二二倍体细胞同时按一定细胞比例加入实验细胞样倍体细胞同时按一定细胞比例加入实验细胞样品中去。品中去。石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准大量的实验研究发现，石蜡包埋肿瘤组织的大量的实验研究发现，石蜡包埋肿瘤组织的DNA定量分析中，其定量分析中，其DNA二倍体标准使用存在
23、二倍体标准使用存在的差异比新鲜组织更大。的差异比新鲜组织更大。Schutte等研究发现，用新鲜组织二倍体细胞等研究发现，用新鲜组织二倍体细胞或用末梢血淋巴细胞以及用仪器准直标准作为或用末梢血淋巴细胞以及用仪器准直标准作为石蜡包埋肿瘤组织细胞石蜡包埋肿瘤组织细胞DNA倍体标准更不合适，倍体标准更不合适，主要原因在于石蜡包埋组织的固定剂为主要原因在于石蜡包埋组织的固定剂为10%甲甲醛，如用醛，如用EB、PI等荧光染色，甲醛固定剂对细等荧光染色，甲醛固定剂对细胞荧光染色有很强的干扰作用，而且在正常组胞荧光染色有很强的干扰作用，而且在正常组织细胞之间也存在较大差异。织细胞之间也存在较大差异。我们对各种
24、石蜡包埋的正常组织二倍体细胞我们对各种石蜡包埋的正常组织二倍体细胞DNA含量进行了研究，将人的淋巴细胞含量进行了研究，将人的淋巴细胞DNA含含量作为计算标准，将人的淋巴细胞分离出来后，量作为计算标准，将人的淋巴细胞分离出来后，进行石蜡包埋，以进行石蜡包埋，以70%乙醇固定的鸡血红细胞乙醇固定的鸡血红细胞作为作为DNA内参标准，采用内参标准，采用PI同步染色，结果发同步染色，结果发现，各种正常组织细胞之间现，各种正常组织细胞之间DNA含量存在较大含量存在较大的差异的差异(见表见表4) 。各种正常组织细胞之间各种正常组织细胞之间DNA含量存在差异，推含量存在差异，推断，可能各组织细胞之间与荧光染料
25、结合多少断，可能各组织细胞之间与荧光染料结合多少有密切关系，荧光染料与有密切关系，荧光染料与DNA结合取决于染色结合取决于染色质的结构和染色质的凝聚程度。质的结构和染色质的凝聚程度。例如例如7AAD(Aminoactionmycin，7氨基氨基放线菌素放线菌素D)与不同的正常组织与不同的正常组织DNA二倍体细二倍体细胞结合，可以测定不同的胞结合，可以测定不同的DNA含量结果。含量结果。例如精子细胞其染色质高度凝聚，像例如精子细胞其染色质高度凝聚，像PI、EB、AO一些荧光染料不能与其一些荧光染料不能与其DNA结合，需经过结合，需经过酸或热变性处理后才能被染色。酸或热变性处理后才能被染色。鉴于石
26、蜡包埋组织的二倍体标准细胞鉴于石蜡包埋组织的二倍体标准细胞DNA含量含量的定量结果差异较大的特点，对的定量结果差异较大的特点，对DNA二倍体标二倍体标准的使用强调同种、同个体、同源组织，最好准的使用强调同种、同个体、同源组织，最好在同一个石蜡包埋组织块中既有正常组织又有在同一个石蜡包埋组织块中既有正常组织又有肿瘤组织。肿瘤组织。 表表4 人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞DNA含量分析含量分析正常组织类别 例数 DNA比值人淋巴细胞 5 2.930.13淋巴结细胞 30 2.910.16脾细胞 10 2.870.13扁桃体 15 2.900.17口腔粘膜 22 2.6
27、50.21食管粘膜 53 2.650.18胃粘膜 40 3.012.03肠粘膜 25 3.010.16气管粘膜 17 2.880.14肺组织 22 2.770.13肾组织 10 2.810.15肾上腺 5 3.110.27膀胱粘膜 25 2.790.14甲状腺 8 3.060.19胰腺组织 6 3.030.21胸腺组织 8 2.960.11鼻咽粘膜 13 2.820.17宫颈粘膜 38 2.760.12宫内膜 20 2.810.16脑组织 18 2.840.18皮肤组织 23 2.560.13乳腺组织 25 2.740.15 我们还探讨了石蜡包埋组织保存时间与我们还探讨了石蜡包埋组织保存时间与DNA定量分析的关系定量分析的关系(见表见表5)，发现与保存时间之，发现与保存时间之间没有明显的关系，石蜡包埋时间长短不影响间没有明显的关系，石蜡包埋时间长短不影响DNA定量分析定量分析 表表5 30例不同时间石蜡包埋淋巴结细胞例不同时间石蜡包埋淋巴结细胞DNA含量分析含量分析
