《分子生物学实验课件：8大肠杆菌BL21感受态细胞制备及重组DNA的转化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验课件：8大肠杆菌BL21感受态细胞制备及重组DNA的转化（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、大肠杆菌大肠杆菌BL21BL21感受态细胞感受态细胞制备及重组制备及重组DNADNA的转化的转化实实 验验 八八背景理论知识背景理论知识Section 18.1.1 8.1.1 实实 验验 目目 的的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法的方法掌握质粒转化的方法技术掌握质粒转化的方法技术u受体菌受体菌: (: (一般不带特异的筛选标记）一般不带特异的筛选标记） E.Coli BL21（DE3）(用T7启动子进行原核表达) DE3 DE3是整合在细菌基因组上的一种携带是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNAT7 RNA聚聚合酶基因和合酶基因和lacIlacI基因
2、的基因的噬菌体，其基因型为：噬菌体，其基因型为：lacIlacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5u重组质粒重组质粒: : （KanKanr r） pET28a-eGFPpET28a-eGFP 8.1.2 8.1.2 受体菌与重组质粒受体菌与重组质粒8.1.3质粒DNA的转化+质粒DNA42420 0C C热击热击37370 0C C复苏复苏Amp+筛选感受态细胞CaCa2+2+能与加入的能与加入的DNADNA分子结合，分子结合，形成抗形成抗DNADNA酶酶( (DNaseDNase) )的羟基的羟基
3、- -磷磷酸钙复合物，并黏附在细菌细酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当胞膜的外表面上。当4242热刺热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为并随之出现许多间隙，为DNADNA分分子提供了进入细胞的通道。子提供了进入细胞的通道。8.1.4 8.1.4 影响转化效率的因素影响转化效率的因素细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态态ODOD值：值：0.30.30.5 (5X1070.5 (5X107个个/ml)/ml)试剂的质量：试剂的质量：化合物及无
4、机离子：化合物及无机离子：Rb+Rb+、Mn+Mn+、二甲亚砜等二甲亚砜等质粒：大小、构型质粒：大小、构型外源外源DNADNA（质粒）与细胞的比例：质粒）与细胞的比例：器皿的洁净度器皿的洁净度污染污染尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行行实验操作实验操作Section 28.2.1 8.2.1 实验器材实验器材摇床分光光度计冷冻离心机超净工作台恒温水浴涂布棒恒温培养箱LB液体培养基LB固体培养基卡那青霉素（Kan）0.1 M CaCl230% 甘油8.2.2 8.2.2 实验试剂实验试剂1 1、接单菌落到、接单菌落到5ml LB5ml LB液体培养基中
5、，液体培养基中，3737、190rpm190rpm振振荡培养过夜。荡培养过夜。2 2、1%1%（50 50 l) l) 菌液接种到含菌液接种到含5 ml LB5 ml LB的试管中，的试管中，3737 振荡培养振荡培养1-21-2小时，至小时，至OD600 0.4-0.5OD600 0.4-0.5。（已完成）。（已完成）3 3、将将1.5mL1.5mL菌液转移到离心管中。菌液转移到离心管中。4 4、离心离心 5000rpm5000rpm，44，3min3min。5 5、倒出培养液上清。倒出培养液上清。6 6、用冰预冷的、用冰预冷的1ml 0.1M1ml 0.1M的的CaClCaCl2 2处理、
6、轻轻悬浮细胞。处理、轻轻悬浮细胞。7 7、冰上静置、冰上静置20min20min。8 8、5000rpm5000rpm，44离心离心5min5min，倒出上清。，倒出上清。9 9、100100 l CaCll CaCl2 2轻轻悬浮，冰浴待用。轻轻悬浮，冰浴待用。8.2.3 8.2.3 大肠杆菌大肠杆菌BL21BL21感受态的制备感受态的制备实验流程图8.2.4 8.2.4 质粒的转化质粒的转化1.1.100100 l l的感受态细胞分成的感受态细胞分成2 2管管(50(50 l/EPl/EP管管) )2.2.实验样品实验样品: : 将将2 2 l l重组质粒重组质粒DNADNA加入到加入到5
7、050 l l感受态细感受态细胞胞EPEP管中，用枪头轻轻混匀管中，用枪头轻轻混匀( (勿吹打勿吹打) )（标记（标记P+P+）3.3.阴性对照：将阴性对照：将2 2 l l无菌水加入到无菌水加入到5050 l l感受态细胞感受态细胞EPEP管中，用枪头轻轻混匀管中，用枪头轻轻混匀( (勿吹打勿吹打) )（标记（标记P-P-）4.4.冰浴冰浴1010minmin5.5.（热击）（热击）4242，90sec90sec，静置，勿摇动，静置，勿摇动6.6.迅速放到冰上迅速放到冰上, ,冰浴冰浴2 2minmin7.7.（复苏）加入（复苏）加入950950 l l LB LB液体液体培养基（无抗性），
8、标培养基（无抗性），标明组号，明组号，3737，150rpm150rpm摇床培养摇床培养15min15min每两人一组做重组每两人一组做重组DNA的转化：的转化：每每50L感受态细胞悬液中加入感受态细胞悬液中加入2L重组重组DNA,轻轻轻轻摇匀，同时设置一组对照，摇匀，同时设置一组对照，具体操作按下表进行：具体操作按下表进行：编号编号组内分工组内分工组组 别别重组重组DNA/l灭菌水灭菌水l平皿抗性平皿抗性受体菌受体菌/ l1学生学生A1阴性对照阴性对照2Kan502学生学生A1重组重组DNA2Kan503学生学生A2阴性对照阴性对照2无无504学生学生A2重组重组DNA2Kan50每组（两人
9、）在转化菌复苏时制备三块每组（两人）在转化菌复苏时制备三块Kan LBKan LB琼琼脂平板脂平板, ,一块无抗性平板，并作好标记。一块无抗性平板，并作好标记。l制备制备LBLB琼脂平板琼脂平板( (每组自己制备每组自己制备) ) 含含KanKan的的LBLB固体培养基倒平板三块。固体培养基倒平板三块。 无抗性的无抗性的LBLB固体培养基倒平板一块。固体培养基倒平板一块。l涂布涂布 首先在首先在平板底部平板底部标记好对应的标记好对应的组号组号和和样品编号样品编号，样品名称样品名称及及日期日期。 阴性对照（阴性对照（编号编号3 3）涂）涂200ul200ul于于无抗性无抗性平板平板。 实验样品（
10、实验样品（编号编号1 1、2 2 和和 4 4）涂）涂200ul200ul于于KanKan平板平板。 l培养培养 静置静置15mins, 15mins, 倒置平板倒置平板3737 培养过夜，培养过夜，第二天第二天上午观察实验结果上午观察实验结果，并将平板放到，并将平板放到44保存。下保存。下周实验前，提前一天来接菌。周实验前，提前一天来接菌。8.2.5 8.2.5 涂布棒的使用涂布棒的使用1 1、使用前，浸入、使用前，浸入75%75%酒精中；酒精中；2 2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧（不要烧到手）；到手）；3 3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；4 4、涂布均匀；、涂布均匀；5 5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用。、将涂布棒重新除菌以备下一次使用。实验关键点实验关键点无菌操作无菌操作轻轻操作轻轻操作低温操作低温操作第二天观察实验结果第二天观察实验结果下周实验提前一天接菌下周实验提前一天接菌l 对比大肠杆菌对比大肠杆菌 DH5a DH5a 与与 BL21BL21的异的异同点，观察两者在生长形态上的差别。同点，观察两者在生长形态上的差别。思思 考考 题题下下 次次 实实 验验蛋白质的诱导表达蛋白质的诱导表达开始工作吧！开始工作吧！LETS BEGIN NOW！
