细胞工程全套课件

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1、绪绪 论论绪绪 论论知识目标：知识目标：1.了解细胞工程的发展简史2.掌握细胞工程及其相关概念3.掌握细胞工程主要技术4.了解细胞工程的应用绪绪 论论细细胞胞工工程程应用的原理和方法应用的原理和方法细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞整体水平或胞整体水平或细胞器水平胞器水平按照人们的意愿来改按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质变细胞内的遗传物质或获得细胞产品或获得细胞产品概念概念分类分类植物细胞工程植物细胞工程研究的目的研究的目的研究的水平研究的水平动物细胞工程动物细胞工程绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念是指细胞融合和细胞培养技术。包括所有的生物组织、器

2、官及细胞离体操作与培养绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念一、细胞工程（cell engineering）定义是指在细胞细胞水平上的遗传工程，即应用细胞生物学、分子生物学的方法，对细胞进行遗传操作，如细胞培养、细胞融合、细胞诱变、细胞重组、细胞培养、细胞融合、细胞诱变、细胞重组、细胞遗传物质转移和生殖工程细胞遗传物质转移和生殖工程等，以获得所期望遗传组成的细胞或生物体，从而达到改良生物品种或创造新品种，加速繁育动植物个体，或利用细胞培养产生某种有用物质的过程。细胞工程的核心技术：细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖细胞培养与繁殖目的：目的：获得新性状、新个体、新物质获得新

3、性状、新个体、新物质绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念二、细胞工程的分类、植物细胞工程（plant cell engineering）是细胞工程的一个重要的分支，是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念二、细胞工程的分类植物细胞工程的任务（1）研究植物器官、组织和细胞在离体培养条件下，所需要的有机营

4、养、无机营养、植物激素等培养条件和刺激因素。（2）研究植物器官、组织和细胞，在离体培养条件下，所需的温度、湿度和光照等环境条件。（3）研究植物的不同生理年龄、遗传组成（基因型）在离体培养条件下，形态发生的规律。（4）研究离体培养条件下再生植株群体的遗传稳定性和变异性。、 绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念二、细胞工程的分类2、动物细胞工程（ animalcellengineering）是细胞工程的另一个重要的分支，是对动物的细胞、组织和器官培养、细胞融合、细胞重组、遗传物质转移和生殖工程等从细胞水平改变动物细胞的遗传物质，用于生产特定生物制品、培育动物新品种和应用于人

5、类的优生。就技术范围而言，动物细胞工程包括:细胞培养技术（组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆），这些便是动物细胞工程的主要内容。绪绪 论论第一节第一节 细胞工程的基本概念细胞工程的基本概念二、细胞工程的分类2、动物细胞工程（ animalcellengineering）是细胞工程的另一个重要的分支，是对动物的细胞、组织和器官培养、细胞融合、细胞重组、遗传物质转移和生殖工程等从细胞水平改变动物细胞的遗传物质，用于生产特定生物制品、培育动物新品种和应用于人类的优生。就技术范围而言，动物细胞工程包括:细胞培养技术（组织

6、培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆），这些便是动物细胞工程的主要内容。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术一、细胞与组织培养技术一、细胞与组织培养技术（cell and tissue culture）属体外培养（in vitro culture），可分为三个层次的培养：细胞培养 组织培养 器官培养细胞培养是进行细胞工程操作的基本技术和 内容。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术 植物细胞与组织培养的基本技术要点植物细胞与组织培养的基本技术要点: :取材和消毒准备培养基接

7、种移栽绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的细胞工程的主要技术主要技术动物细胞培养过程示意图:绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术 细胞与组织培养技术细胞与组织培养技术价值该技术最显著的价值在于能快速、大量繁殖一些有价值的苗林、花卉、药材和濒危植物等，并可以在培养无毒苗、长期贮存种子、细胞和原生质融合以及生产次生代谢产物方面发挥作用。动物细胞培养技术可生产许多有应用价值的细胞产品，如多种单克隆抗体、疫苗、酶、激素以及免疫调节因子等。其中单克隆抗体的生物反应器大规模生产，已经在医药领域产生了极大的社会和经济效益。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术二、

8、二、细胞融合技术（细胞融合技术（cellfusion）又称细胞杂交（又称细胞杂交（cell hybridizationcell hybridization），是），是指在指在外力（诱导剂或促融剂）外力（诱导剂或促融剂）作用下，作用下，两个或两个或两个以上的异源两个以上的异源（种属间）细胞或原生质体（种属间）细胞或原生质体融合形成融合形成一个细胞一个细胞的过程。是转移异源遗传物的过程。是转移异源遗传物质创造新种质或新材料的一种重要细胞工程质创造新种质或新材料的一种重要细胞工程技术。技术。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术二、细胞融合技术（二、细胞融合技术（cell fu

9、sioncell fusion）技术要点技术要点: : 原生质体的制备原生质体的制备 细胞融合细胞融合 融合细胞的培养融合细胞的培养 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 杂种细胞的分化与再生杂种细胞的分化与再生 再生植株的鉴定再生植株的鉴定 绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术二、二、细胞融合技术（细胞融合技术（cellfusion）技术价值:最大的贡献是动植物、微生物新品种的培育方面。应用该技术能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远源杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段； 动物细胞的融合后形成的杂交瘤主要用来获得单克隆抗体，被成为“生物导弹”

10、，将为治疗癌症开辟一条新的途径；此外细胞融合技术为携带外源基因的载体（如携带抗病基因的载体Ti和Ri）进入细胞创造了条件。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术三、三、细胞细胞拆合拆合技术技术(nuclear transplantation)也称为细胞核(包括细胞器)移植技术，是用某种方法如利用显微操作技术将细胞核和细胞质拆开或者把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把分离的同中或异种细胞核和细胞质重新组合起来，形成一个新细胞或新生物个体，赋予重建的细胞以某种新的功能。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术三、细胞拆合技术三

11、、细胞拆合技术(nuclear transplantation)细胞拆合技术和细胞融合技术汇合，建立了细胞重组技术。细胞重组技术已成为一种十分重要的现代生物技术。 绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术四、四、染色体工程染色体工程 (chromosome engineering )按照人们一定的设计，把单个的染色体或染色体组转入或移出受体细胞，从而形成新的染色体组合和遗传构成，达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术。该技术最大的价值是新品种的培育。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术四、四、染色体工程染色体工程 (chromosome engin

12、eering )主要分为: 植物染色体工程 动物染色体工程 植物染色体工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法达到改变染色体的目的。 动物染色体工程主要是通过对染色体显微操作技术达到转移基因的目的。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术五、五、胚胎工程胚胎工程(embryonic engineering)以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作， 主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。 胚胎移植技术是将一个生物体内的胚胎移植到另一个生物体内繁殖的技术，这样可能大量繁殖优良的品种。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术五、胚胎工程五、胚胎工程(embr

13、yonicengineering)具体操作是：先注射雌性激素在一雌性动物的体内，促使其大量排卵 然后在体外人工受精后发育成为胚胎 后再植入其它同类动物的子宫内使其发育成为个体绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术五、胚胎工程五、胚胎工程(embryonic engineering)价值:一头优良的牛马等动物一年可以产四五十头，大大提高了繁殖率，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源，使农畜动物胚胎移植的推广应用成为可能。 优势:体外受精可以准确地确定受精的时间和胚胎发育阶段，因此，利用体外受精技术进行核移植性别控制和基因导入，可望工厂化生产遗传性稳定生产性能优良的家畜，以

14、加快农畜良种化。 绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术五、胚胎工程五、胚胎工程(embryonicengineering)具体操作是：先注射雌性激素在一雌性动物的体内，促使其大量排卵 然后在体外人工受精后发育成为胚胎 后再植入其它同类动物的子宫内使其发育成为个体绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术六、细胞遗传工程六、细胞遗传工程主要包括细胞克隆和转基因技术。 克隆是指离体条件下的无性繁殖。 动物克隆技术主要是指核移植技术。 简单地讲，将发育各个阶段（胚胎、胎儿、幼子、成年）的一个细胞，利用显微操作技术，移植到一个去掉了细胞核的成熟的卵母细胞中，在

15、适当的条件下，重新形成一个胚胎，把这个胚胎移植到生殖周期相近的代理母体内，最终发育成一个正常的动物个体。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术六、细胞遗传工程六、细胞遗传工程转基因技术即将目标性状基因分离出来，构建重组DNA分子导入生物体，得到稳定表达，并能够遗传给后代的技术。目前已成为物种遗传改良的最有效途径。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术七、干细胞与组织工程七、干细胞与组织工程 干细胞（stem cell）是动物体内具有分化潜能，并能自我更新的细胞. 分为胚胎干细胞和组织干细胞。 胚胎干细胞来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以

16、发育成为完整的个体。 组织干细胞存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术七、干细胞与组织工程七、干细胞与组织工程 组织工程是在干细胞的基础上发展起来的，将干细胞与材料科学相结合，将自体或异体的干细胞经体外扩增后种植在预先构建好的聚合物骨架上，在适宜的生长条件下干细胞沿聚合物骨架迁移铺展生长和分化，最终发育具有特定形态及功能的工程组织。绪绪 论论第二节第二节 细胞工程的主要技术细胞工程的主要技术七、干细胞与组织工程七、干细胞与组织工程“治疗性克隆”:如果能够消除体细胞的“记忆”，它们就有可能恢复到胚胎细

17、胞的状态科学家称之为把细胞“重编程”。把通过“重编程”得到的干细胞在不同的环境条件下进行培养，就能得到各种分化细胞。人们通常把这种利用体细胞制造胚胎干细胞，分化后再移植回人体的技术。绪绪 论论第三节第三节 细胞工程的发展历史细胞工程的发展历史一、植物细胞工程的发展简史一、植物细胞工程的发展简史大致经历了三个阶段： （一）探索阶段（1902-1929） （二）培养技术建立阶段（1930-1959） （三）应用研究阶段（1960- ） （1）原生质体培养和细胞融合。 （2）微繁技术 （3）花药培养技术 （4）次生产物生产绪绪 论论第三节第三节 细胞工程的发展历史细胞工程的发展历史二、动物细胞工程发

18、展史 1、细胞融合现象的发现 2、动物细胞培养技术的建立 3、细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 4、动物克隆技术的建立绪绪 论论第三节第三节 细胞工程的发展历史细胞工程的发展历史（一）植物细胞工程的应用1、脱毒和快速繁殖2、细胞工程育种 （1）利用培养变异，筛选优良 突变体。 （2）利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。 （3）利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 （4）倍性育种3、离体种质保存4、细胞培养生产有用物质绪绪 论论第三节第三节 细胞工程的发展历史细胞工程的发展历史（二）动物细胞工程的应用1、动物细胞培养生产医药产品（单克隆 抗体）2、新品种培育3、试管动

19、物与婴儿4、组织工程5、珍稀动植物资源的保存与保护第二章细胞工程基础第二章细胞工程基础 本章重点回顾与细胞工程相关的理论背景知识，尤其是细胞生物学和分子生物学等方面的知识，为后续章节的学习奠定基础。第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础第二节第二节分子生物学基础分子生物学基础第二章细胞工程基础知识目标：知识目标：掌握原核生物和真核生物的细胞结构与功能重点掌握与细胞工程相关的细胞生物学及分子生物学的有关理论知识。能力目标：能力目标：能够运用细胞生物学、细胞生物学、分子生物学的相关知识为学习细胞工程打下基础。第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础一、细胞的发现二、细胞的分类 三、细胞器的结

20、构与功能四、染色质和染色体五、细胞分裂与繁殖 六、细胞周期七、细胞分化与细胞全能性八、细胞衰老、死亡与癌变 第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础一、细胞的发现第二章细胞工程基础1、构成生物体的结构和功能单位细胞2、1665年，英国人罗伯特胡克观察到死亡细胞的细胞壁，他称之为细胞（cell）1831年罗伯特布朗发现兰科植物叶片表皮细胞中的细胞核。1835年发现细胞质-细胞内含物，于是细胞的基本结构和形态逐渐为人所知。地球上，具有独立生命活动的所有生物均由一个或多个细胞组成。第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础一、细胞的发现第二章细胞工程基础3、德国植物学家施来登(M

21、athias Schleiden)和动物学家施旺(Theodor Schwann)创立了细胞学说 对细胞的研究在细胞形态、细胞（超微）结构、细胞周期、核型、基因调控、信号转导、细胞分化和凋亡、肿瘤生物学等方面取得了重大进展， 二、细胞的分类真核细胞真核细胞: :原核细胞原核细胞: :有成形的细胞核有成形的细胞核( (有核膜包被有核膜包被) )无成形的细胞核无成形的细胞核( (无核膜包被无核膜包被),),只有核区只有核区原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞原核生物原核生物真核生物真核生物 1 1、根据细胞核结构的分化程度不同，将细胞分为根据细胞核结构的分化程度不同，将细胞分为原核细胞原核细胞和和真核

22、细胞真核细胞 第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础二、细胞的分类 第二章细胞工程基础2、原核细胞与真核细胞的主要特征 见书16页表2.1 原核细胞与真核细胞的主要特征比较 （一）（一）原核细胞原核细胞 种类：细菌、蓝藻、放线菌等种类：细菌、蓝藻、放线菌等第二章细胞工程基础 第一节 细胞生物学基础1.细菌 （1）细菌的基本结构n是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体。n可分为：球菌、杆菌和螺旋菌（弧形菌）。n绝大多数细菌的直径在0.5-5m之间。第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础大大肠肠杆杆菌菌第二章细胞工程基础第一节 细

23、胞生物学基础淋淋病病球球菌菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础肉肉毒毒梭梭菌菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础弧弧形形霍霍乱乱菌菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础细细胞胞壁壁：主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以（1-4）糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层。革兰氏阳性菌细胞壁厚约20-80nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40的磷壁酸（teichoic acid。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，

24、另外还有脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础 革兰氏阳性菌细胞壁革兰氏阳性菌细胞壁第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础 革兰氏阳性菌细胞壁革兰氏阳性菌细胞壁 革兰氏阴性菌细胞壁革兰氏阴性菌细胞壁第二章细胞工程基础细胞壁的结构细胞膜 厚约8-10nm，外侧紧贴细胞壁。一些行光合作用的原核生物，质膜具有与捕光反应有关的内褶。一些革兰氏阳性菌质膜内褶形成小管状结构，称为间体 。mesosome第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础n拟核拟核：DNA分子裸露，没有内含子，具有重叠基因。大肠杆菌大肠杆菌低电子密度区低电子密度区为拟核为拟核第二章细胞工程基础第一节 细胞

25、生物学基础n核糖体核糖体： 约含5000-50000个。 部分附着在细胞膜内侧，大部分游离于细胞质中。沉降系数为70S。由大亚单位(50S)与小亚单位(30S)组成。 小亚单位对四环素与链霉素敏感，大亚单位对红霉素与氯霉素敏感。第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础n质质粒粒(plasmid) ：除核区DNA外，可进行自主复制的遗传因子，是裸露的环状DNA分子，所含遗传信息量为2-200个基因，能进行自我复制，有时能整合到核DNA中去。质粒常用作基因重组与基因转移的载体。第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础n荚膜（capsule）：细菌最外表的一层多糖类物质。n功能：抵御不良环境；保护自

26、身不受吞噬；选择性的粘附到特定细胞的表面上。Negativestainedbacteria第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础n鞭毛： 细菌的运动器官，由鞭毛蛋白构成第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础n菌毛：是菌体表面极其的蛋白纤细，与细菌运动无关。分为细胞菌毛和性菌毛两类。前者与细菌吸附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有关。 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础（2 2）繁殖方式）繁殖方式：以二分裂二分裂的方式繁殖，某些细菌处于不利的环境，或耗尽营养时，形成内生孢子，又称芽孢，是对不良环境有强抵抗力的休眠体。 分裂中的链球菌分裂中的链球菌分裂中的大肠杆菌分裂中的大

27、肠杆菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础（3 3）细菌毒素）细菌毒素 细菌产生对机体有毒害作用的化学物质，称为细菌产生对机体有毒害作用的化学物质，称为毒素。包括内毒素和外毒素。毒素。包括内毒素和外毒素。特性特性外毒素外毒素内毒素内毒素产生细菌产生细菌主要是革兰氏阳性菌主要是革兰氏阳性菌主要为革兰氏阴性菌主要为革兰氏阴性菌来源来源由活的细菌释放至菌体外由活的细菌释放至菌体外是是细细菌菌细细胞胞壁壁成成分分，细细菌菌崩解后释放出来崩解后释放出来化学成分化学成分蛋白质蛋白质多糖多糖-磷脂磷脂-蛋白质复合物蛋白质复合物毒性毒性毒毒性性强强，各各种种细细菌菌的的外外毒毒素素对对某某些些组组织织细细

28、胞胞有有特特殊殊的的亲亲和力，引起特异性病变。和力，引起特异性病变。毒性弱，各种细菌内毒素毒性弱，各种细菌内毒素的毒性作用相似。全身性、的毒性作用相似。全身性、致发热、腹泻、呕吐。致发热、腹泻、呕吐。抗原性抗原性强强，能能刺刺激激机机体体产产生生抗抗毒毒素素。经经甲甲醛醛处处理理，可可脱脱毒毒成成为为类类毒素。毒素。弱弱，不不能能刺刺激激机机体体产产生生抗抗毒毒素素。不不能能经经甲甲醛醛处处理理成成为类毒素。为类毒素。致热性致热性对宿主不致热对宿主不致热致热性。常致宿主发热致热性。常致宿主发热耐热性耐热性一一般般不不耐耐热热，60以以上上迅迅速速破坏。破坏。耐热，耐热，60耐热数小时。耐热数小

29、时。第二章细胞工程基础2.古细菌 l无核膜及内膜系统；l以甲硫氨酸起始蛋白质的合成、核糖体对氯霉素不敏感、RNA聚合酶和真核细胞的相似、具有内含子和组蛋白。l细胞膜中的脂类不可皂化，细胞壁不含肽聚糖。l生活在极端环境中，如：极端嗜热菌、产甲烷菌、极端嗜盐菌、极端嗜热菌。 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础海底烟筒附近也具有古细菌海底烟筒附近也具有古细菌第二章细胞工程基础n地球上在大约12亿亿年前才出现真核细胞。真核细胞由原核细胞进化而来，细胞内有核膜包被的真正的细胞核，细胞质内有功能不同的多种细胞器，如线粒体、高尔基体、内质网等。大多数动、植物细胞均为真核细胞。 （二）（二） 真核细胞：

30、真核细胞：第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础1.植物细胞 除简单的藻类植物外，植物细胞都属于真核细胞。高等植物细胞具有最完善的细胞结构。 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础1.细胞膜2.细胞壁3.细胞质4.叶绿体5.高尔基体 6.核仁7.核液8.核膜9.染色质10.核孔 11.线粒体12.内质网13.游离的核糖体14.液泡15.内质网上的核糖体第二章细胞工程基础2.动物细胞 与植物细胞不同，动物细胞没有细胞壁，但具有植物细胞不具有的中心体。1.细胞膜2.细胞质3.高尔基体4.核液5.染色质 6.核仁7.核膜8.内质网9.线粒体10.核孔11.内质网上的核糖体12.游离的核糖体13.

31、中心体第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础动物细胞与植物细胞的比较 细胞组分动物细胞植物细胞细胞壁无有叶绿体无有液泡无有圆球体无有乙醛酸循环体无有溶酶体有有中心体有无通讯连接方式间隙连接胞间连丝胞质分裂方式收缩环细胞板第二章细胞工程基础3真菌 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础 真菌不是植物真菌不含叶绿素，无根、茎、叶的分化。第二章细胞工程基础真菌细菌细胞真核细胞原核细胞细胞核有，还有核仁、核膜拟核，无核仁、核膜细胞器有只有核糖体细胞壁无 肽 聚 糖 ， 由 多 糖（ 75%） 与 蛋 白 质（25%）有肽聚糖对青霉素或头孢菌素敏感不敏感敏感细胞膜含固醇不含固醇大小，复杂程度比细菌大

32、几倍至几十倍，结构复杂小，简单第二章细胞工程基础(1)真菌形态结构及类型单细胞真菌 圆形或卵圆形 酵母菌(yeast)多细胞真菌 菌丝和孢子， 丝状菌(filamentous fungus) 交织成团 或霉菌(mold) 二相性(dimorphic)1.菌丝 hypha2.孢子 spore第二章细胞工程基础单细胞真菌形态单细胞真菌形态新生隐球菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础第二章细胞工程基础酵母菌出芽繁殖第二章细胞工程基础多细胞真菌形态sporesporehyphahypha第二章细胞工程基础菌丝 （ hypha）有隔菌丝 多数致病性真菌无隔菌丝营养菌丝气生菌丝生殖菌丝在环境适宜情况

33、下由孢子长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝 菌丝形态有助于鉴别 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础孢子 spore孢子芽胞作用真菌繁殖结构细菌休眠结构，抵御不良环境抵抗力不强，加热6070短时间即可死亡强 ， 有 的 可 耐100数小时第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础有性孢子有性孢子:同一菌体或不同菌体上的同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减个细胞融合经减数分裂形成数分裂形成 无性孢子无性孢子:菌丝上的细胞分化或出芽生成菌丝上的细胞分化或出芽生成 病原性真菌大多形成无性孢子病原性真菌大多形成无性孢子病原性真菌大多形成无性孢子病原性真菌大多形成无性孢子 分生孢子分生孢子叶状孢子叶状

34、孢子孢子囊孢子孢子囊孢子大分生孢子大分生孢子 大小、细胞数和颜色是鉴大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据定的重要依据 小小分生孢子分生孢子 真菌都能产生真菌都能产生芽生孢子芽生孢子 假菌丝假菌丝 厚膜孢子厚膜孢子 关节孢子关节孢子 第二章细胞工程基础大分生孢子第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础芽生孢子第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础第二章细胞工程基础假菌丝第二章细胞工程基础厚膜孢子第二章细胞工程基础关节孢子第二章细胞工程基础孢子囊孢子(2)发酵生产常用的真菌种类 霉菌 酵母菌 啤酒酵母 红曲霉素 假丝酵母 黄曲霉 抗生菌第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础三、细胞器的结构与功能

35、 （一）主要细胞器（一）主要细胞器 1.内质网（endoplasmic reticulum，ER）： 由膜围成一个连续的管道系统。 第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础内质网和核糖体内质网和核糖体内质网是膜连接成的网状结构,是细胞内蛋白质合成和加工,以及脂质合成的“车间”核糖体有的附着在内质网上,有的游离在细胞质中,是“生产蛋白质的机器”第二章细胞工程基础2.2.高尔基体：是蛋白质进行加工、分类和包装的高尔基体：是蛋白质进行加工、分类和包装的“车间车间”及及“发送站发送站”，与细胞壁的合成有关，与细胞壁的合成有关（单层膜）（单层膜）第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基

36、础3.3.溶酶体：是溶酶体：是“消化车间消化车间”，内含多种水解酶，能，内含多种水解酶，能分解衰老损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病分解衰老损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒和病菌毒和病菌第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础4.4.线粒体线粒体: :细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的的“动力车间动力车间”（双层膜）（双层膜）第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础5.5.叶绿体叶绿体：植物细胞的植物细胞的“养料制造车间养料制造车间”和和“能量转换器能量转换器”（双层膜）（双层膜）第二章细胞工程基础第一节第一节

37、 细胞生物学基础细胞生物学基础6.中心粒： 是动物细胞特有的细胞器，位于动物细胞的中心部位，故名中心粒。它的主要化学成分是微管蛋白。7.微体：由单层单位膜围成的小泡状结构，含有多种氧化酶，与分解过氧化氢和乙醛酸循环有关。 第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础(二)、细胞骨架蛋白质纤维构成的网架结构,与细胞运动、分裂、分化以及物质运输、能量交换、信息传递等生命活动密切相关。第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础四、染色质和染色体第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础染色质是是细胞核内容易被碱性染料染成深色的物质被称为染色质或染色

38、体。染色质和染色体的主要成分都是DNA和蛋白质。它们是同一物质在间期和分裂期的不同形态表现。染色质出现于分裂间期，呈细长的丝状，并且交织成网状；染色体出现于分裂期，每条染色质细丝就高度螺旋化，缩短变粗，成为柱状或杆状，且有基本恒定的数目，不同种类的生物有不同数目的染色体，例如人体细胞有染色体23对，共计46条。四、染色质和染色体第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础染色体的四级结构模型(a)DNA绕组蛋白形成核小体；（b）核小体按一定间隔沿DNA构成纤维丝；（c）纤维丝螺旋化构成一个螺线管；（d）螺线管进一步螺旋化；（e）浓缩构成染色体五、细胞分裂与繁殖五、细胞分裂与繁殖

39、 l细胞分裂是生物生长、发育和实现个体繁殖的基础。细胞分裂是生物生长、发育和实现个体繁殖的基础。单细胞生物：通过细胞分裂进行繁殖。单细胞生物：通过细胞分裂进行繁殖。多细胞生物：由细胞分裂产生新细胞，以补充衰老、死多细胞生物：由细胞分裂产生新细胞，以补充衰老、死亡的细胞。其生长和发育，实际就是细胞分裂和分化的亡的细胞。其生长和发育，实际就是细胞分裂和分化的过程。过程。第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础细胞分裂细胞分裂细胞分裂的方式：细胞分裂的方式：有丝分裂有丝分裂无丝分裂无丝分裂体细胞，动植物细胞分裂的体细胞，动植物细胞分裂的主要形式主要形式如：蛙的红血细胞如：蛙的红血

40、细胞生殖细胞产生的过程。生殖细胞产生的过程。减数分裂减数分裂第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础（一） 有丝分裂v有丝分裂的过程v有丝分裂包括两个紧密相连的过程：核分裂、细胞质分裂。通常有丝分裂主要是指核分裂，特别是在遗传学中更主要讨论细胞核分裂v有丝分裂过程可分为五个时期，即：间期、前期、中期、后期、末期v应当注意的是：有丝分裂过程本身是一个连续的自然过程。细胞分裂时期是人为划分的，是根据所观察到整个有丝分裂过程中的各种形态、结构和状态的差异而进行的划分；其目的是便于对整个过程进行研究的描述。第二章细胞工程基础有丝分裂过程示意图第二章细胞工程基础（二）（二）无丝分裂无

41、丝分裂过程：非常简单，在分裂过程中不出现染色体和过程：非常简单，在分裂过程中不出现染色体和纺锤丝的形成。纺锤丝的形成。 细胞的无丝分裂在动、植物体内虽时有发现，细胞的无丝分裂在动、植物体内虽时有发现，但和有丝分裂相比，是少见的。但和有丝分裂相比，是少见的。第二章细胞工程基础（三）减数分裂 减数分裂是性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊的有丝分裂，又称成熟分裂。其结果是产生染色体数目减半的性细胞，所以称为减数分裂。v减数分裂的特殊性表现在：v具有一定的时间性和空间性：生物个体性成熟后，动物性腺和植物造孢组织细胞中进行。v连续进行两次分裂：遗传物质经过一次复制，连续两次分裂，导致染色体数

42、目的减半。v同源染色体在第一次分裂前期(前期I，PI)相互配对(paring)，也称为联会(synapsis)；并且在同源染色体间发生片段的交换。第二章细胞工程基础第一节第一节细胞生物学基础细胞生物学基础减数分裂的过程v间期间期(前间期前间期, preinterphase)v减数第一分裂减数第一分裂 (meiosis I)v减数间期减数间期 (interkinesis)v减数第二分裂减数第二分裂 (meiosis)前期I (prophase I, PI), 中期I(metaphase I, MI)后期I(anaphase I, AI)末期I(telophase I, TI)前期II (prop

43、hase II, PII), 中期II(metaphase II, MII)后期II(anaphase II, AII)末期II(telophase II, TII)前期I (prophase I, PI), 中期I(metaphase I, MI)后期I(anaphase I, AI)末期I(telophase I, TI)第二章细胞工程基础1.间期(interphase) v性母细胞进入减数分裂前的间期称为前减数分裂间期，也称为前间期。v这一时期是为性细胞进入减数分裂作准备。其准备的内容包括：v染色体复制；v有丝分裂向减数分裂转化.v特征：v持续时间比有丝分裂间期长，特别是合成期较长；v合

44、成期间往往仅有约99.7%的DNA完成合成，而其余的0.3%在偶线期合成。 第二章细胞工程基础2.减数第一次分裂(meiosis I)v减数第一次分裂是减数分裂中比较重要的一次分裂，减数第一次分裂是减数分裂中比较重要的一次分裂，行为复杂，主要是前期的染色体变化多。行为复杂，主要是前期的染色体变化多。v(1). 前期I(prophase I, P I)；v(2). 中期I(metaphase I, M I)；v(3). 后期I(anaphase I, A I)；v(4). 末期I(telephase I, P I)。细线期(leptotene，PI1).偶线期(zygotene，PI2).粗线期

45、(pachytene，PI3).双线期(diplotene，PI4).终变期(diakinesis，PI5).第二章细胞工程基础（1）前期 I (prophase I, PI), v这一时期细胞内变化复杂，所经历的时间较长，细胞核比有丝分裂前期核要大些。v根据核内变化特征，可进一步分为五个时期：v细线期(leptotene，PI1).v偶线期(zygotene，PI2).v粗线期(pachytene，PI3).v双线期(diplotene，PI4).v终变期(diakinesis，PI5).第二章细胞工程基础细线期(leptonene，PI1)v染色体开始螺旋收缩，在光学显微镜下呈细长线状；有

46、时可以较为清楚地计数染色体数目。v这时每个染色体含有两染色单体，由着丝点连接，但在光学显微镜下还不能分辨染色单体。第二章细胞工程基础偶线期(zygotene，PI2)v同源染色体的对应部位相互同源染色体的对应部位相互开始开始紧密并列，逐渐沿纵向配紧密并列，逐渐沿纵向配对在一起，称为对在一起，称为联会现象联会现象( (synapsissynapsis) )。v细胞内细胞内2n2n条染色体可配对形成条染色体可配对形成n n对染色体。配对的两条同源对染色体。配对的两条同源染色体称为染色体称为二价体二价体(bivalent)(bivalent)。v细胞内二价体细胞内二价体(n)(n)的数目就是同源染色

47、体的对数。的数目就是同源染色体的对数。第二章细胞工程基础粗线期(pachytene，PI3)v随着染色体的进一步螺旋，二价体逐渐缩短加粗，二价体具随着染色体的进一步螺旋，二价体逐渐缩短加粗，二价体具有四条染色单体，所以又称为有四条染色单体，所以又称为四合体四合体或或四联体四联体(tetrad)(tetrad)；联；联会复合体的结构完全形成；会复合体的结构完全形成；v姊妹染色单体与非姊妹染色单体；姊妹染色单体与非姊妹染色单体；v非姊妹染色单体间会形成非姊妹染色单体间会形成交叉交叉( (chiasmatachiasmata) )或或交换交换(crossing (crossing over)over

48、)现象，导致同源染色体发生片段现象，导致同源染色体发生片段交换交换(exchange)(exchange)，最，最终导致同源染色体间发生遗传物质终导致同源染色体间发生遗传物质重组重组(recombination)(recombination)。第二章细胞工程基础粗线期细胞形态图第二章细胞工程基础双线期(diplotene，PI4)v染色体继续缩短变粗，在光学显微镜下四个染色单体均可见；染色体继续缩短变粗，在光学显微镜下四个染色单体均可见；v非姊妹染色单体之间由于螺旋卷缩而相互排斥，同源染色体非姊妹染色单体之间由于螺旋卷缩而相互排斥，同源染色体局部开始分开；局部开始分开；v非姊妹染色单体间的交换

49、部位仍由横丝连接，因而同源染色非姊妹染色单体间的交换部位仍由横丝连接，因而同源染色体间仍由一至二个交叉联结。体间仍由一至二个交叉联结。第二章细胞工程基础终变期(diakinesis，PI5)v染色体进一步浓缩，缩短变粗；染色体进一步浓缩，缩短变粗；v同源染色体间排斥力更大，的交叉向二价体两端移动，逐渐同源染色体间排斥力更大，的交叉向二价体两端移动，逐渐接近于末端，该过程称为接近于末端，该过程称为交叉端化交叉端化( (terminalizationterminalization) )。v二价体在核内分散分布，因而常用以鉴定染色体数目，二价二价体在核内分散分布，因而常用以鉴定染色体数目，二价体数目

50、就是同源染色体的对数。体数目就是同源染色体的对数。第二章细胞工程基础（2）中期 I(metaphase I, MI)v核仁和核膜消失，纺锤体形成，纺锤丝附着在着丝点上并核仁和核膜消失，纺锤体形成，纺锤丝附着在着丝点上并将二价体拉向赤道板位置。将二价体拉向赤道板位置。v每个二价体的两同源染色体分布在赤道板的两侧，同源染每个二价体的两同源染色体分布在赤道板的两侧，同源染色体的着丝点分别朝向两极，赤道板位置上是将同源染色色体的着丝点分别朝向两极，赤道板位置上是将同源染色体相连交叉部分体相连交叉部分( (已经端化已经端化) )。v在二价体趋向赤道板的过程中，两条同源染色体的排列方在二价体趋向赤道板的过

51、程中，两条同源染色体的排列方向向( (着丝粒取向着丝粒取向) )是随机的。是随机的。v从纺锤体的极面观察，从纺锤体的极面观察，n n个二价体分散排在赤道板的附近，个二价体分散排在赤道板的附近，因而这也是可用于鉴定染色体数目的重要时期之一。因而这也是可用于鉴定染色体数目的重要时期之一。第二章细胞工程基础（3）后期 I(anaphase I, AI)v纺锤丝牵引染色体向两极运动，使纺锤丝牵引染色体向两极运动，使得同源染色体末端脱开，一对同源得同源染色体末端脱开，一对同源染色体分别移向两极。染色体分别移向两极。v每极具有一对同源染色体中的一条每极具有一对同源染色体中的一条( (共有共有n n条染色体

52、条染色体) )，使得子细胞中染，使得子细胞中染色体数目从色体数目从2n2n减半到减半到n n。v此过程并不进行着丝粒分裂，没有此过程并不进行着丝粒分裂，没有发生染色单体分离；每条染色体都发生染色单体分离；每条染色体都仍然具有两个染色单体，并且由着仍然具有两个染色单体，并且由着丝粒相连。丝粒相连。第二章细胞工程基础（4）末期 I(telophase I, TI)v染色体到达两极之后，染色体到达两极之后，松散、伸长、变细松散、伸长、变细( (但通但通常并不完全解螺旋常并不完全解螺旋) )；v核仁、核膜逐渐形成核仁、核膜逐渐形成( (核核分裂完成分裂完成) )，产生两个子，产生两个子核。核。v细胞质

53、也随之分裂，两细胞质也随之分裂，两个子细胞形成，称为二个子细胞形成，称为二分体分体(dyad)(dyad)。第二章细胞工程基础3.减数间期(interkinesis)v减数间期是减数分裂的两次分裂之间的一个间歇。v此时期与有丝分裂的间期相比有显著不同：v时间很短暂。在许多动物之中，甚至没有明显的停顿和间歇存在。v不进行DNA复制，中间期前后细胞中DNA的含量也没有变化。v染色体的螺旋化程度较高。第二章细胞工程基础4.减数第二次分裂(meiosis)v减数第二分裂是第一分裂所产生的两个子细胞继续进行同步分裂，与有丝分裂没有实质区别, 仍可分为前、中、后、末四个时期：v(1). 前期(propha

54、se, P)；v(2). 中期(metaphase, M)；v(3). 后期(anaphase, A)；v(4). 末期(telephase , P)。第二章细胞工程基础第二章细胞工程基础减数分裂的遗传学意义1、精子(n) +卵细胞(n)= 2n 染色体数目恒定性、物种相对 稳定性2、非姊妹染色单体间交换、后 期 I 同源染色体随机分离 变异、生物进化 第二章细胞工程基础六、细胞周期 u从一次细胞分裂到下一次分裂前的过程。细胞周期包括一个间期和一个有丝分裂期。植物细胞的周期从十几个小时至几十个小时不等。 u细胞分裂间期：因有丝分裂是周期性进行的，处于两个分裂期之间称分裂间期，是有丝分裂的准备阶

55、段，细胞表面无明显变化，只是细胞核较一般细胞大，核质中有分散的染色质。包括复制前期（G1期）、复制期（S期）和复制后期（G2期）。 第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础第二章细胞工程基础第一节第一节 细胞生物学基础细胞生物学基础细胞周期的各时期特征细胞周期的各时期特征 时 期 特特 征征分裂间期G1期转录大量的RNA和合成大量的蛋白质，为DNA复制作准备S期DNA复制，一个DNA分子复制出的两个DNA分子通过着丝点连在一起，与蛋白质结合形成2个姐妹染色单体 G2期为进入分裂期作准备分裂期前期染色质转变成染色体；核膜解体，核仁消失；纺缍体形成中期着丝点排列在赤道板中央；染

56、色体数目最清晰，形态最固定后期着丝点分裂，染色单体分裂，在纺缍丝牵引下移向细胞两极末期染色质转变成染色体；核膜重建，核仁出现；纺缍体解体；赤道板形成细胞壁（植物细胞）第二章细胞工程基础细胞的增殖过程细胞的增殖过程第二章细胞工程基础细胞的生长公式： dNt/dt=Nt 代表群体细胞的比生长速率（s1） 细胞生长曲线 细胞的增殖过程细胞的增殖过程第二章细胞工程基础潜伏期：当细胞接种至合适的培养液中，细胞数不增长或增长很少对数（生长）期 ：细胞随时间呈指数函数形式增长 倍增时间Td（s）：细胞数量增加1倍所需的时间 Td(ln2)/ 细胞的增殖过程细胞的增殖过程第二章细胞工程基础稳定期 细胞数量在一

57、定的时间内保持恒定原因：营养成分的耗尽；细胞代谢废产物的积累可抑制细胞生长衰亡期：细胞不断死亡，数量随着培养的进程而减少 (一)细胞分化1、定义 是指细胞后代在形态结构和功能上发生差异的是指细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程过程. .细胞分化的实质是基因的差别表达 细胞分化的具体表现为特异性蛋白质的形成 通过分化产生不同类型的细胞，由此形成不同的组织，而器官则是不同类型细胞稳定而有机组合的结果。七、细胞分化与细胞全能性第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础(一)细胞分化2、细胞分化的分子基础细胞决定：一个细胞的分化可被识别之前，细胞沿着特定方向变化的能力已经被提前赋予了分子基础：特定的

58、基因在特定时间和空间处于激活状态，导致特异性蛋白质的优先合成基于细胞分化的基因分类： 奢侈基因决定分化细胞的特殊性状 持家基因维持细胞最低限度功能所不可缺的基因 七、细胞分化与细胞全能性第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础(一)细胞分化3、影响细胞分化的因素胞外信号分子（近距离）：如成纤维细胞生 长因子、转化生长因子激素 （远距离）细胞质的不均一性：如卵细胞和受精卵细胞 七、细胞分化与细胞全能性第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础（二）细胞的全能性（ totipotency） 指生物的每个细胞经过分裂和分化后，仍然保持发育成完整个体的潜在能力 对于整体细胞：全能性随着细胞分化程度的提高

59、而逐渐受到限制，分化潜能变窄 对于细胞核：没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性 七、细胞分化与细胞全能性第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础（二）细胞的全能性（ totipotency）细胞分化的分子基础细胞决定：一个细胞的分化可被识别之前，细胞沿着特定方向变化的能力已经被提前赋予了分子基础：特定的基因在特定时间和空间处于激活状态，导致特异性蛋白质的优先合成基于细胞分化的基因分类：奢侈基因决定分化细胞的特殊性状持家基因维持细胞最低限度功能所不可缺的基因七、细胞分化与细胞全能性第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础( (一一一一) ) 细胞的衰老细胞的衰老细胞的衰

60、老细胞的衰老 细胞衰老（细胞衰老（细胞衰老（细胞衰老（cell senescence)cell senescence)是指细胞在正是指细胞在正 常环境条件下发生的细胞的生理功能和增常环境条件下发生的细胞的生理功能和增 殖能力减弱以及细胞形态发生改变，趋向殖能力减弱以及细胞形态发生改变，趋向 死亡的现象死亡的现象。1 1、细胞衰老的概念、细胞衰老的概念八、细胞衰老、死亡与癌变第二章细胞工程基础第一节 细胞生物学基础衰老症状与原因分析衰老症状与原因分析细胞膜通透性功能改变细胞膜通透性功能改变饮食减少饮食减少细胞内色素的累积细胞内色素的累积老人斑老人斑细胞内的酶活性降低细胞内的酶活性降低头发变白头发

61、变白细胞水分减少，体积减小细胞水分减少，体积减小皮肤干燥、发皱皮肤干燥、发皱原因分析原因分析衰老症状衰老症状第二章细胞工程基础2 2、细胞衰老的特征、细胞衰老的特征（1）形态变化）形态变化第二章细胞工程基础vvDNADNA：复复复复制制制制与与与与转转转转录录录录受受受受阻阻阻阻，端端端端粒粒粒粒DNADNA、mtmtmtmtDNADNA缺缺缺缺失失失失。DNADNA氧氧氧氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。vvRNARNA：含量降低。含量降低。含量降低。含量降低。vv蛋白质：

62、含成下降，发生修饰、交联。蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。蛋白质：含成下降，发生修饰、交联。vv酶酶酶酶分分分分子子子子：活活活活性性性性中中中中心心心心被被被被氧氧氧氧化化化化，金金金金属属属属离离离离子子子子丢丢丢丢失失失失，酶酶酶酶分分分分子子子子的的的的二二二二级级级级结构、溶解度、等电点发生改变，酶失活。结构、溶解度、等电点发生改变，酶失活。结构、溶解度、等电点发生改变，酶失活。结构、溶解度、等电点发生改变，酶失活。vv脂类：不饱和脂肪酸被氧化。脂类：不饱和脂肪酸被氧化。脂类：不饱和脂肪酸被氧化。脂类：不饱和脂肪酸被氧化。（2）分子水平的变化）分子

63、水平的变化第二章细胞工程基础（1）代谢废物积累代谢废物积累代谢废物积累代谢废物积累：如：脂褐质：如：脂褐质3 3、细胞的衰老学说、细胞的衰老学说正常细胞内存在清除自由基的防御系统：正常细胞内存在清除自由基的防御系统：酶系统：超氧化物歧化酶酶系统：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢，过氧化氢(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)；非酶系统：维生素非酶系统：维生素E，醌类等电子受体。，醌类等电子受体。（2）自由基理论自由基理论自由基理论自由基理论：过量的自由基：过量的自由基：过量的自由基：过量的自由基导致导致DNA、蛋、蛋白质变异。白质变异。第二章细胞工程基础第三章、细胞

64、工程实验室设置与基本技术第三章、细胞工程实验室设置与基本技术细胞工程是以离体细胞和组织的无菌操作为基础的实验性学科，它需要在模拟动植物细胞生长发育而设置的实验条件和环境下进行一系列操作的。为此需要各种实验设施设备适宜的培养条件与技术。本章重点介绍细胞工程实验室的设置主要仪器设备以及细胞工程的基本实验操作技术，这些是从事细胞工程工作的基础。第一节第一节 实验室设置实验室设置第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术第四节第四节 培养基的成分、配制与选择培养基的成分、配制与选择第五节第五节 培养条件的选择培养条件的选择知识目标：知识

65、目标：了解细胞工程的了解细胞工程的通用技术通用技术熟悉实验室熟悉实验室设置、仪器设备、器具以其处理方法设置、仪器设备、器具以其处理方法掌握掌握培养基配制、培养条件的控制培养基配制、培养条件的控制掌握掌握灭菌以及无菌操作灭菌以及无菌操作的原理与操作方法的原理与操作方法能力目标：能力目标：掌握掌握洗涤、灭菌和无菌操作洗涤、灭菌和无菌操作技术（详见实训部分）技术（详见实训部分）会配制会配制培养基培养基（详见实训部分（详见实训部分第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第一节第一节实验室设置实验室设置一、洗涤室一、洗涤室二、灭菌室二、灭菌室三、配制室三、配制室四、无菌操

66、作室四、无菌操作室( (接种室接种室) )五、培养室五、培养室 六、鉴定室六、鉴定室七、驯化移植室七、驯化移植室第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第一节第一节 实验室设置实验室设置一、洗涤室一、洗涤室 用途：洗涤室主要用于玻璃器皿用具和培养材料清洗 配置:洗涤水槽、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器二、灭菌室二、灭菌室用途：用于培养基及培养器械的灭菌。配置:配备实验台高压灭菌锅排风灭火设备细菌过滤设备干热消毒柜电炉等。 要求：设备的安装和排列要合理房间要宽敞明亮通风条件好，地面要便于清洁防滑。 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第一节第一节 实验室设置实验室设置三、配制室三、配制室用途：配

67、制室主要用于配置培养基。配置:：冰箱天平微波炉pH计培养基分装器药品柜器械柜抽气泵电炉各种规格的培养瓶和用具培养皿移液管烧杯量筒容量瓶储藏瓶等。冰箱用于储存培养基母液激素维生素等贵重药品彩色胶卷及保存植物材料。天平应有不同感量。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第一节第一节 实验室设置实验室设置四、无菌操作室四、无菌操作室( (接种室接种室) )用途：主要用于实验材料的接种操作配置:超净工作台或接种箱、固定式载物台、移动式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。要求：无菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，忌粗陋放散，是植物组织培养研究或生产工作

68、中最关键的部分，关系到培养物的污染率，接种工作效率等重要指标。 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术五、培养室五、培养室用途：能控制光照和温度，防止微生物感染，对离体材料进行控制培养要求：应保持干燥和清洁。配置:培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器、摇床等。六、鉴定室六、鉴定室用途：对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求：清洁明亮干燥，配置:各种光学仪器七、驯化移植室七、驯化移植室用途：用于试管小植株的锻炼和移植。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件配置: 温室弥雾装置荫棚移植床钵盆塑料布草炭蛭石粗沙等，第一节第一节 实验室设置实验室设置第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节

69、第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备包括常规设备、灭菌设备、培养设备等。熟练掌握它们的结构、用途、使用方法及注意事项是顺利完成实验的重要保证。一、常规设备一、常规设备主要是用于试剂保存与称量、培养基配制与分装和水处理等。如天平、冰箱和冰柜、酸度计、离心机、水纯化装置天平离心机第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备二、灭菌设备二、灭菌设备（一）高压蒸汽消毒装置培养基、蒸馏水、不含糖的缓冲液、培养器皿及其他用具等均需经过高压蒸汽消毒灭菌后方可使用。高压灭菌器时，一般在121，控温1540分钟，既可切断电源，缓慢降压至读数为0

70、时，方可取出灭菌物。（二）干燥灭菌器 用于各种用具的灭菌。通常采用160180持续90分钟来灭菌。 （三）过滤除菌装置高压灭菌器滤器第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备 二氧化碳培养箱养箱养箱倒置显微镜三、培养设备三、培养设备（一）培养设备包括培养架培养箱摇床和生物反应器等。（二）倒置显微镜多用于隔瓶观察记录外植体及悬浮培养物（细胞团原生质体等）的生长情况。（三）双筒实体显微镜多用于剥离植物茎尖。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备（四）细胞计数工具用作培养细胞的计数和活性的观察。（五）细胞冷冻

71、保存装置普通的液氮容器常称为液氮罐。液氮温度约为-196，使用时要注意勿使液氮溅到皮肤上，以防冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮情况，及时补充液氮，避免挥发过多而导致细胞受损。（六）其他仪器如磁力搅拌器恒温水浴箱振荡器超声波清洗仪等。冷冻装置第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备主要金属器材四、培养容器与用具（一）接种用具用途：主要用于接种外植体解剖动物取材和原代培养中切割组织。消毒方法采用高压蒸汽消毒或采用70酒精浸泡消毒。 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术培养器皿多孔培养板（二）培养器皿体外培养必须使用大量的各式器皿 第二节第二节

72、 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备离心管Eppendorf管第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备（三）移液器三）移液器移液器1电动移液器：2微量移液器：3多通道可调式微量移液器 （四）特殊用具第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第二节第二节 实验室主要仪器设备实验室主要仪器设备五、无菌操作设备五、无菌操作设备超净（净化）工作台是目前已普遍应用的无菌操作装置。 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 超净工作台第三章、细胞工程实验室设置与基本

73、技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术一、洗涤技术一、洗涤技术体外培养细胞使用的器材品种较多，器皿表面常残留微量有毒物质。由于离体细胞对各种毒物都很敏感，除去器皿表面残留的微量有毒物质，改善玻璃表面性质，有利于细胞的粘着和生长，所以细胞培养所用器材的清洗消毒处理是培养能否成功的关键之一。（一）洗涤剂的配制常用洗涤剂的配制与适用范围见书的43页表3.1 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术(二)洗涤方法A、新购买的玻璃仪器的清洗 表面常附着有游离的碱性物质可先用0.5的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在12盐酸

74、溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。B、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术C、 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，第一次使用塑料器皿时，可先

75、用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用103 mol/L EDTA 除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。D、金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E、除菌过滤器洗涤 用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术二、灭菌技术二、灭菌技术 （一）

76、灭菌是指杀灭培养物培养基培养用具及培养环境的杂菌，是防止微生物污染的最重要最基本的环节，是细胞工程技术中必须注意的问题。 （二）、灭菌的方法： 1、 物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）、紫外灯、超声波等。 2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等第三章、细胞工程实验室设置与基本技术（1）干热灭菌 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150 、40min或120 、120min，如果发现芽孢杆菌，160 、90120min（2）湿热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121 维持2030min注意点：加足水、排

77、尽气、气压降到0时，才能开盖（3）过滤灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术（4）射线灭菌 主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。（5）火焰灼烧灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。（6）消毒剂适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三

78、节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术注意： （1）实验器皿、操作表面、皮肤一般用7075%酒精（2）升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上，二则使用后要进行处理，不能直接导入下水道。 升汞处理方法： 升汞Na2S絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）FeSO4（中和过多的Na2S ） （3）长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术三、无菌操作技术三、无菌操作技术1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30m

79、in。注意：台 面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术三、无菌操作技术三、无菌操作技术4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。5、取流

80、水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术三、无菌操作技术三、无菌操作技术6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注意事项（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。第三章、细胞工程

81、实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术三、无菌操作技术三、无菌操作技术注意事项（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。第三章、细胞工程实

82、验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术四、外植体的选择与处理技术 用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源： 一是生长在自然环境下的植物； 二是在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已经过离体培养的植物。 （一）、外植体的选择 （二）、外植体的处理 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术四、外植体的选择与处理技术 （一）、外植体的选择 1、选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，

83、并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。 2、取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术四、外植体的选择与处理技术 （一）外植体的选择 3、外植体大小选择 因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（以后具体讲） 4、选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。第三章、细胞工程实验室

84、设置与基本技术第三节第三节 细胞工程的基本操作技术细胞工程的基本操作技术（二）、外植体的处理 1、取材母株的预处理 人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。 2、外植体休眠的处理 有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。 3、 组织内生菌的 处理 （1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养物的死亡 （2）取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。 （3）取被内生菌污染的培养物的 茎尖不停的转接。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制

85、与选择成分、配制与选择一、培养基的成分及其作用（一）无机营养物质 大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, S。 微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl（二）有机化合物 维生素类物质 氨基酸类物质 糖类物质 一些其它的有机添加物 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（二）.有机化合物 1、维生素类物质 维生素类物质在酶系统中有催化功能。 硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素 盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长 烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育 有的配方中还

86、使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。 第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（二）有机化合物2、AA类物质绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖类糖在培养基的作用： 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与

87、选择（二）有机化合物4、其它有机物质1）肌醇（环己六醇） 肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成2）天然有机物 一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（三）植物生长调节物质 植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。 无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活

88、动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。1、生长素类：2、细胞分裂素3、赤霉素（GA3）4、脱落酸（ABA）（第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（三）植物生长调节物质1、生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 2）萘酸类： NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。 生长素的生理作用1）促进细胞生长和细胞分裂2）诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3）形成愈伤组织，促进生根4）与一定量的细胞分裂素配合共同诱导

89、不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（三）植物生长调节物质2、细胞分裂素 是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6苄基氨基嘌呤。 功能：1）促进细胞的分裂和分化2）诱导芽的分化3）促进侧芽的萌发和生长4）抑制衰老第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（三）植物生长调节物质 3、赤霉素（GA3）生理作用：1）诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生

90、型特别有效，对根无效2）对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。3）破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4）对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（三）植物生长调节物质 4、脱落酸（ABA）生理作用：1）、抑制蛋白质的合成2）、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用3）、诱导休眠、促进衰老和脱落第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择

91、（四）固化剂和悬浮剂1、固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养） 琼脂的用量一般在4-10g/L，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。2、悬浮剂Ficoll（聚蔗糖）第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择二、培养基的配方及培养基的选择二、培养基的配方及培养基的选择（一）培养基的种类（一）培养基的种类 根据无机盐的浓度，培养基分为： 高无机盐含量培养基、高硝态氮培养基 、中等无机 盐含量培养基、低无机盐含量培养基 根据培养物的培养过程，培养基分

92、为: 初代培养基和继代培养基。 根据其作用不同，培养基分为 诱导培养基增殖培养基和生根培养基。 根据其营养水平不同，培养基可分为 基本培养基和完全培养基。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择二、培养基的配方及培养基的选择二、培养基的配方及培养基的选择（二）培养基的筛选（二）培养基的筛选1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养基。2植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞

93、分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择三、培养基的配制方法（一）贮备液（母液）的配制包括：大量元素母液微量元素母液铁盐母液有机母液激素母液配制等（详见植物细胞工程实训部分）第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择（二）培养基的配制步骤1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量

94、（mg/L）1000ml/母液浓度（mg/L）。2、移液 取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意 （1）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。（2）量取母液时，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。3、称取琼脂蔗糖备用第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择4、融化 用搪瓷量杯量取600700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢

95、，造成烫伤。 5、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、配制与选择6、调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右)。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第四节第四节 培养基的培养基的成分、配制与选择成分、

96、配制与选择7、分装 溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1L培养基，可分装2030瓶。8、包扎 用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9、培养基的灭菌第三章、细胞工程实验室设置与基本技术培养条件的选择十分关键。培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织一.光照的影响主要表现在光强、光质、以及光周期等方面： 光周期：黑暗与光照交替的时间；光量：光照强度；光质：光的波长离体培养中光周期的调节最常用的周期是16h的光照，8h

97、的黑暗。 愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照， 器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。第五节第五节 培养条件的选择培养条件的选择第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第五节第五节 培养条件的选择培养条件的选择二.温度的影响 培养都是在2327之间进行，一般采用252。 喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在26-28 冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培养温度控制在18-22 或临界密度临界密度)2372、培养基成份3、初始细胞植板密度(临界密度)三、影响单细胞培养的因素相互依赖植板密度

98、较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等物质.238临界密度临界密度：单细胞培养时，初始植：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在一般要求每毫升在1000个细胞以上。个细胞以上。2394培养方式的影响培

99、养方式的影响培养方式不同也是重要的影响因素培养方式不同也是重要的影响因素固体培养；固体培养；液体培养。液体培养。240其他因素其他因素 5.5.生长激素生长激素加加1种细胞分裂素和几种氨基酸。临界种细胞分裂素和几种氨基酸。临界密度只需密度只需25-30细胞细胞/毫升。激素配比不当毫升。激素配比不当影响培养效果。影响培养效果。6.pHPH值不适或变化过大都不利于值不适或变化过大都不利于培养。培养。7.CO2培养容器内气体状况也是重要的影响因素。241四、细胞培养注意事项四、细胞培养注意事项1实验进行前，无菌室及无菌操作实验进行前，无菌室及无菌操作台台(laminarflow)以紫外灯照射以紫外灯

100、照射30-60分钟灭菌，以分钟灭菌，以70%ethanol擦拭擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转风扇运转10分钟后，才开始实验操分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。以避免失误混淆或细胞间污染。2422无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。3.实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。243

101、4工作人员应注意自身之安全，须工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。穿戴实验衣及手套后才进行实验。操作过程中，小心毒性药品，并避操作过程中，小心毒性药品，并避免尖锐针头之伤害等。免尖锐针头之伤害等。5.实验完毕后，将实验物品带出工作实验完毕后，将实验物品带出工作台，以台，以70%ethanol擦拭无菌操作擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运台面。操作间隔应让无菌操作台运转转10分钟以上后，再进行下一个细分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。胞株之操作。244思考题：1.如何得到单离的细胞？2.单细胞培养有哪些方法？3.影响单细胞培养因素？245再见！1、定义：液体培养

102、基中能保持良好分散状态的 细胞和小细团的培养。2、优点：（1）充分吸收营养 （2）细胞增殖快（3）可进行大规模的培养第三节第三节 植物细胞悬浮培养植物细胞悬浮培养1、定义：液体培养基中能保持良好分散、定义：液体培养基中能保持良好分散状态的细胞和小细团的培养。状态的细胞和小细团的培养。2、优点：、优点：（1）充分吸收营养）充分吸收营养 （2）细胞增殖快）细胞增殖快（3）细胞的相对大小均一）细胞的相对大小均一 (4) 可进行大规模的培养可进行大规模的培养一、细胞悬浮培养原理一、细胞悬浮培养原理植物离体培养可产生愈伤组织植物离体培养可产生愈伤组织,将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培将疏松型的愈伤组织悬浮

103、在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散悬浮培养物。间后，可形成分散悬浮培养物。细胞的悬浮培养示意图细胞的悬浮培养示意图（一）悬浮培养（一）悬浮培养Suspension culture特点特点1.细胞可以不断增殖，形成高密度的细细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；胞群体，适于大规模培养；2.能够提供大量较为均匀的细胞，为研能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出必须指出悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。（二）植物细胞悬浮培养的特（

104、二）植物细胞悬浮培养的特性性1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；差；2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为直细胞生长的中期及对数期易凝聚为直径达径达350m一一400m的团块，悬浮培养较的团块，悬浮培养较难；难；4培养时需供氧，培养液粘度大：培养时需供氧，培养液粘度大：5具有群体效应；具有群体效应；6因为有细胞壁因为有细胞壁,培养细胞产物滞留于培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；细胞内，产量较低

105、；7细胞培养过程有结构与功能全能性细胞培养过程有结构与功能全能性,因因而易分化而易分化,从而导致目的产物低于原植物从而导致目的产物低于原植物体内浓度；体内浓度；8悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（否则不生长（2500050000个个/ML）。）。起始悬浮液的制备起始悬浮液的制备愈伤愈伤组织组织液体培养基液体培养基摇床摇床振荡振荡悬浮培养悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速转速30-150rpm2-3cm冲程冲程防细胞破裂防细胞破裂二二、培养方法、

106、培养方法植物细胞悬浮培养通常深层培植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为：分批式流加式养可分为：分批式流加式半连续式连续式和灌注式半连续式连续式和灌注式五种。五种。1、分批培养、分批培养/成批培养（成批培养（Batch culture）含义：含义：将愈伤组织培养在一定容积的将愈伤组织培养在一定容积的密闭容密闭容器中器中进行培养。它是进行细胞生进行培养。它是进行细胞生 长和细胞分长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。裂的生理生化研究常用的培养方法。但要进行下一批培养，则生长一定时间后，但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。需要继代转移。 分批式培养（batchculture）该方式

107、大多采用机械搅拌式生物反应器，该方式大多采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。物、培养基的操作方式。该方式的特点该方式的特点培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。培养基体积固定，不添加任何营养成分。培养基体积固定，不添加任何营养成分。直观反映细胞生长代谢的过程。培

108、养过程直观反映细胞生长代谢的过程。培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。增长。反应器系统属于封闭式，反应器系统属于封闭式，必须适当搅拌控必须适当搅拌控制温度制温度pH值和通气值和通气。2流加式培养（流加式培养（feedingculture）流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初始接种的培养搅拌式生物反应器系统，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的基体积一般为终体积的1/21/3，在培养过程，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流中根据细胞对营养物质的不断消耗和需

109、求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度。长至较高的密度。整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩纯化目标蛋系，分离细胞和细胞碎片，浓缩纯化目标蛋白。白。（1）流加培养特点：流加培养流加培养根据情况流加浓缩的营养培养基，根据情况流加浓缩的营养培养基，流加的速率与消耗的速率相同，保证合理的培流加的速率与消耗的速率相同，保证合理的培养环境与较低的代谢产物抑制水平。养环境与较低的代谢产物抑制水平

110、。培养过程以低稀释率流加，细胞在培养系培养过程以低稀释率流加，细胞在培养系统中停留时间较长，总细胞密度较高，产物浓统中停留时间较长，总细胞密度较高，产物浓度较高。度较高。流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环境优化，是整个培养工艺中的主要内容。境优化，是整个培养工艺中的主要内容。在工业化生产，悬浮流加培养工艺参数的在工业化生产，悬浮流加培养工艺参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，可采用工艺参数的直接放大理解和掌握，可采用工艺参数的直接放大。（2）流加工艺中的营养成分主要分）流加工艺中的营养成分主

111、要分为三大类为三大类葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质。源物质。谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质。的氮源物质。氨基酸维生素及其他：主要包括营养必需氨氨基酸维生素及其他：主要包括营养必需氨基酸营养非必需氨基酸一些特殊的氨基酸如基酸营养非必需氨基酸一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包羟脯氨酸羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱生长刺激因子。括其他营养成分如胆碱生长刺激因子。（3）流加式培养分为两种类型单一补料分批式培养单一补料分批式培养反复补料分批式培

112、养。反复补料分批式培养。单一补料分批式培养单一补料分批式培养单一补料分批式培养是在培养开始时投单一补料分批式培养是在培养开始时投入一定量的基础培养液，培养到一定时期，入一定量的基础培养液，培养到一定时期，开始连续补加浓缩营养物质，直到培养液开始连续补加浓缩营养物质，直到培养液体积达到生物反应器的最大操作容积，停体积达到生物反应器的最大操作容积，停止补加，最后将细胞培养液一次全部放出。止补加，最后将细胞培养液一次全部放出。该操作方式受到反应器操作容积的限制，该操作方式受到反应器操作容积的限制，培养周期只能控制在较短的时间内。培养周期只能控制在较短的时间内。反复补料分批式培养反复补料分批式培养反复

113、补料分批式培养是在单一补料分批反复补料分批式培养是在单一补料分批式操作的基础上，每隔一定时间按一定比式操作的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分培养液，使培养液体积始终例放出一部分培养液，使培养液体积始终不超过反应器的最大操作容积，从而在理不超过反应器的最大操作容积，从而在理论上可以延长培养周期，直至培养效率下论上可以延长培养周期，直至培养效率下降，才将培养液全部放出。降，才将培养液全部放出。3半连续式培养（半连续式培养（semi-continuousculture）半连续式培养即每隔一定时间（如半连续式培养即每隔一定时间（如1-2天）天）收获部分培养物，再加人等量培养基的方收获部分培养物

114、，再加人等量培养基的方法。又称为重复分批式培养或换液培养。法。又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统的悬浮培采用机械搅拌式生物反应器系统的悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。器内的总体积不变。半连续式特点半连续式特点（1）培养物的体积逐步增加；）培养物的体积逐步增加；（2）可进行多次收获；）可进行多次收获；（3）细胞可持续指数生长，并可保持产物）细胞可持续指数生长，并可保

115、持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。延续到很长时间。（4）该操作方式的优点是操作简便，生产）该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，在动物细胞培养和药品生产中被广泛品，在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。应用。4连续式培养（连续式培养（continuousculture）连续培养方法，即培养若干天后连续收获细胞连续培养方法，即培养若干天后连续收获细胞培养物的同时不断补充培养液的方法。连续式培养物的同时不断补充培养液的方法。连续式培养是一种常见的悬浮培养模式。培养是一种

116、常见的悬浮培养模式。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。连续培养（连续培养（Continuous culture）示意图）示意图加入培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物 二者体积相等二者体积相等连续式培养的特点连续式

117、培养的特点细胞维持持续指数增长；细胞维持持续指数增长；产物体积不断增长；产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。可控制衰退期与下降期。连续培养意义：连续培养意义：植物细胞代谢调节的研究（某种生长植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速物质浓度对细胞生长的影响）；限速物质浓度对细胞生长的影响）；次生物质的大量生产。次生物质的大量生产。5灌流式培养（灌流式培养（perfusionculture）灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连不断地将部分条件培养基取出，同

118、时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。分细胞。灌流式培养使用的生物反应器灌流式培养使用的生物反应器灌流式培养常使用的生物反应器主要有两灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始

119、多采用微孔膜过装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。的沉降系统或透析系统。另一种生物反应器另一种生物反应器中空纤维生物反应器也是连续灌流操作常用的一中空纤维生物反应器也是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分近年来中空纤维生物反

120、应器被广泛应用于产物分泌性植物细胞的生产。泌性植物细胞的生产。总之：这几个系统较明显地提高了细胞的生产率，总之：这几个系统较明显地提高了细胞的生产率，可收获快速生长的细胞。可收获快速生长的细胞。三三、悬浮系的建立与继代培养、悬浮系的建立与继代培养(一一)悬浮系的制备悬浮系的制备将疏松的愈伤组织放入将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经过摇床不断振动，使细液体培养基中，经过摇床不断振动，使细胞分散。通常适于愈伤组织生长的液体培胞分散。通常适于愈伤组织生长的液体培养基也适用于同种植物细胞的悬浮培养。养基也适用于同种植物细胞的悬浮培养。有时需要调节激素的浓度。有时需要调节激素的浓度。一个成功的悬浮细胞

121、培养体系必一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件须满足三个条件1悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。单细胞组成的植物细胞悬浮系。2均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。3细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更

122、短时间便可增加一倍。天甚至更短时间便可增加一倍。(二二)继代培养继代培养继代培养继代培养亦称亦称“传代培养传代培养”。将培养的植。将培养的植物细胞组织或器官乃至植物小植株从原物细胞组织或器官乃至植物小植株从原来的培养基上转移到一种新鲜的培养基上来的培养基上转移到一种新鲜的培养基上继续培养的过程称为继代培养。它是培养继续培养的过程称为继代培养。它是培养物连续传代的一种方法，每转移培养一次物连续传代的一种方法，每转移培养一次即称为一代。因此按转移培养的次数确定即称为一代。因此按转移培养的次数确定继代培养的代数。继代培养的代数。1.继代的方法和最佳时期继代的方法和最佳时期继代方法继代方法：用注射器或

123、移管吸取一用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。瓶里，继续进行培养。继代继代最佳继代时期：最佳继代时期：了解细胞数目增长了解细胞数目增长变化变化S形曲线后，选择形曲线后，选择对数生长期对数生长期和和直线直线 生长期生长期！2.细胞生长曲线细胞生长曲线在整个培养过程中，细胞数目不在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈细胞的生长呈S型曲线

124、型曲线培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目12345S形曲线形曲线滞后期滞后期对数生长期对数生长期直线生长期直线生长期缓慢期缓慢期静止期静止期培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目1234512345细胞生长各个时期的特点：细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）滞后期（延迟期） 细胞很少分裂，其长短与接种量大细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期对数生长期细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变速率保持不变直线生长期直线生长期细胞生长和发育最明显的时期细胞生长和发育最明显的时期细胞

125、生长各个时期的特点：细胞生长各个时期的特点：缓慢期缓慢期生长逐渐缓慢：培养液消耗尽，生长逐渐缓慢：培养液消耗尽，有毒代谢物质增多，氧气减少有毒代谢物质增多，氧气减少静止期静止期生长几乎处于停止状态，细胞数目生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。增加极少，甚至开始死亡。生长速率的计算生长速率按下列公式计算：生长速率按下列公式计算：P=（lnx-lnX0）/tP为生长速率为生长速率X为为t时间的细胞密度，时间的细胞密度，X0为起始细胞密度为起始细胞密度讨论讨论 （1）滞后期的长短滞后期的长短主要取决于在继主要取决于在继代时原种培养细胞所处的代时原种培养细胞所处的生长期生长期和转入和

126、转入细胞数细胞数量量的多少。的多少。（2）加入加入条件培养基条件培养基可以缩短滞后期。可以缩短滞后期。 条件培养基：条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。培养基。（3）缩短缩短两次继代时间两次继代时间间隔间隔，则可使悬浮，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。培养的细胞一直保持对数生长期。（4）如果使处在如果使处在静止期静止期的细胞悬浮液保持的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解死亡和解体体。（5）观察细胞染色体在对数生长期18 chromosomes操作注意事项：操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径

127、对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 2- 4 4细胞），使用吸管或注射器。细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。养物。四悬浮培养细胞的同步化四悬浮培养细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。同时通过细胞周期的某一特定时期。同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、

128、同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化，所以人们代谢以及生理生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，常用的处理方法常用的处理方法（一）物理方法（一）物理方法1分选法通过细胞体积大小分级，直接将分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。2冷处理法。低温处理可以提

129、高培养体系冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度。中细胞同步化的程度。（二）化学方法（二）化学方法1饥饿法饥饿法2抑制剂法抑制剂法3有丝分裂阻抑法有丝分裂阻抑法五细胞增殖的测定五细胞增殖的测定（一）细胞计数法（一）细胞计数法取一定体积的细胞悬取一定体积的细胞悬液，加入液，加入2倍体积的倍体积的8%的三氧化铬的三氧化铬（CrO3），置），置70水浴处理水浴处理15min。冷却。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置入血胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置入血细胞计数板上计数。细胞计数板上计数。或用或用5铬酸或铬酸或0

130、.25果胶酶使悬浮细胞团果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。分散用血球计数板进行。（二）细胞密实体积（二）细胞密实体积（PCV）将体积已知均匀分散的悬浮液放入一将体积已知均匀分散的悬浮液放入一个个15ml的离心管中，的离心管中，2000转下离心，转下离心，用每用每ml培养液中细胞总体积的培养液中细胞总体积的ml数表示。数表示。（三）细胞生物量计算法1鲜重法（freshweighmethod）直接称量法：在转代培养的不同时间，直接称量法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，真空抽虑取一定体积的悬浮细胞培养物，真空抽虑或离心收集后，称量细胞的鲜重。或离心收集后，称量细胞的鲜重。制

131、作制作细胞鲜重生长曲线法：细胞鲜重生长曲线法：.为了解悬浮培养细为了解悬浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图，以鲜重为纵座标，以培养时间为横线图，以鲜重为纵座标，以培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。座标，绘制鲜重增长曲线。2干重法（dryweighmethod）直接称量法：可在称量鲜重之后，将细直接称量法：可在称量鲜重之后，将细胞进行烘干，胞进行烘干，60干燥干燥12小时，再称量干小时，再称量干重。以每毫升培养物或重。以每毫升培养物或106个细胞的重量表个细胞的重量表示。示。绘制细胞干重生长曲线法：以干重为纵绘制细胞干重生长曲线法：以干重为纵坐

132、标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。生长曲线。（四）植板率用平板法培养单细胞或原生质体时，常用植板率用平板法培养单细胞或原生质体时，常用植板率来表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百来表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分率。植板：将分率。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液份已调整好密度的单细胞悬浮液与与4份份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培

133、养皿封严以防污染。在封口膜将培养皿封严以防污染。在25黑暗条件下培养黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。周即可长出肉眼可见的愈伤组织。植板率评估它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。植板率(%)=（每个平板上形成细胞团的数目/每个平板上接种的细胞的数目）100。植板效率（或植板率）：植板效率（或植板率）：已形成细胞团已形成细胞团的百分数（即每的百分数（即每100个铺在平板上的细胞个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。中有多少个能长出细胞团）。每个平板上形成的细胞团数每个平板上形成的细胞团数植板效率植板效率=该平板上接种的细胞数该平板上接种的细胞数（五）细胞大小

134、测量常用显微尺测量在显微镜下所观察的细胞常用显微尺测量在显微镜下所观察的细胞长度来表示，也有同时测量长度和宽度的。长度来表示，也有同时测量长度和宽度的。测量长度时，通常用目镜测微尺与镜台测测量长度时，通常用目镜测微尺与镜台测微尺配合使用。微尺配合使用。六、培养细胞活力的测定六、培养细胞活力的测定v相差显微术法相差显微术法vTTC法（法（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑）氯化三苯基四氮唑）vFDA法（荧光素双醋酸酯法）法（荧光素双醋酸酯法）v伊凡蓝法伊凡蓝法观察细胞质环流和细胞核存在与否，观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正环流正常、核存在表明有活力常、核存在表明有活力；在在活活细胞中，细胞中

135、，TTC被还原成被还原成红色甲鐟红色甲鐟，提取，提取分光光度计检测。分光光度计检测。活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不能，不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞互补互补FDA法的原理法的原理vFDA本本身身不不具具有有极极性性，不不能能发发出出荧荧光光，可可以以自由出入细胞膜自由出入细胞膜。v在在活活细细胞胞中中，FDA被被酯酯酶酶裂裂解解，释释放放出出有有极极性的荧光素性的荧光素。v荧光素荧光素不能自由穿越不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。质膜，在活细胞中积累。v荧光素在荧光素在死细胞中不能积累死细胞中不能积累。v在

136、在UV照照射射下下，活活细细胞胞中中的的荧荧光光素素发发出出绿绿色色荧荧光光。FDA荧光素荧光素活活细胞细胞死死细胞细胞请请思考思考活活细胞细胞死死细胞细胞FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为的母液，终浓度为0.01%细胞再生能力的鉴定为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使其再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。思考题思考题：细胞悬浮培养有哪些方法？细胞悬浮培养有哪些方法？如何测定培养细胞的活力？如何测定培养细胞的活力？如何计量培养细胞的数目？如何计量培养细胞的数目？FDA测活力的原理是什么？测活力的原理是什么？如何获得同

137、步化的培养细胞？如何获得同步化的培养细胞？再见！第四节第四节植物细胞的规模培养植物细胞的规模培养一、概述一、概述植物细胞规模培养是指把高等植物的细胞植物细胞规模培养是指把高等植物的细胞从植物体内分离出来，通过建立大规模培从植物体内分离出来，通过建立大规模培养系统，进行逐级放大培养的方法。养系统，进行逐级放大培养的方法。（一）植物细胞培养意义（一）植物细胞培养意义1许多杂合的重要经济作物通常是以无性方式繁许多杂合的重要经济作物通常是以无性方式繁殖殖-植物细胞培养，可以保存每一栽培品系的优良植物细胞培养，可以保存每一栽培品系的优良性状；性状；2培养用于无性繁殖，大大增加了无性繁殖的范培养用于无性繁

138、殖，大大增加了无性繁殖的范围和潜力，细胞培养能够提高繁殖速度，一个优围和潜力，细胞培养能够提高繁殖速度，一个优良品种，用细胞培养再分化植株的方法，在几个良品种，用细胞培养再分化植株的方法，在几个月内就能大面积种植，而常规的育种法需要好几月内就能大面积种植，而常规的育种法需要好几年；年；3细胞培养能使以前不能进行无性繁殖的细胞培养能使以前不能进行无性繁殖的植物易于繁殖；植物易于繁殖；4植物细胞培养在生物科学研究以及提供植物细胞培养在生物科学研究以及提供医药产品等方面也有着广阔的情景。医药产品等方面也有着广阔的情景。植物细胞培养的应用植物细胞培养的应用植物细胞培养的应用主要有以下三个方面植物细胞培

139、养的应用主要有以下三个方面,即用于即用于有用物质的生产快速繁殖以及植物细胞遗传、有用物质的生产快速繁殖以及植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究。目前已有生理、生化和病毒方面的研究。目前已有20多种多种重组蛋白在植物细胞培养中得以生产重组蛋白在植物细胞培养中得以生产,它们包括抗它们包括抗体、酶、激素、生长因子和细胞分裂素等等。体、酶、激素、生长因子和细胞分裂素等等。很多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名很多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫杀菌，而对环境和人畜无害。以用于杀虫杀菌，而对环境和

140、人畜无害。（二）植物细胞培养的优势（二）植物细胞培养的优势植物悬浮细胞既能像微生物一样能在简单的培养植物悬浮细胞既能像微生物一样能在简单的培养基中较快地生长基中较快地生长,培养基不需要做特殊处理培养基不需要做特殊处理,不需要不需要太昂贵的生产设备太昂贵的生产设备;也能像动物细胞培养一样合成也能像动物细胞培养一样合成较复杂的多聚体蛋白和糖蛋白较复杂的多聚体蛋白和糖蛋白;与田间完整植株培养不一样与田间完整植株培养不一样,植物细胞培养生产代植物细胞培养生产代谢产物（例如重组蛋白等）不受气候、土壤质量、谢产物（例如重组蛋白等）不受气候、土壤质量、季节、除草剂和杀虫剂等因素的影响。更重要的季节、除草剂和

141、杀虫剂等因素的影响。更重要的是它具有较简单易行的产物分离纯化过程是它具有较简单易行的产物分离纯化过程,特别是特别是目的重组蛋白能分泌于悬浮细胞培养液中。目的重组蛋白能分泌于悬浮细胞培养液中。植物细胞大规模培养的成本较高，而且所植物细胞大规模培养的成本较高，而且所产生的次生代谢产物含量往往发生变化，产生的次生代谢产物含量往往发生变化，阻碍植物细胞规模化培养的发展。对此，阻碍植物细胞规模化培养的发展。对此，一方面应与生物技术上游领域合作，采用一方面应与生物技术上游领域合作，采用基因工程手段提高有效成分合成能力，另基因工程手段提高有效成分合成能力，另一方面在培养的系统上要加强创新。一方面在培养的系统

142、上要加强创新。（三）规模化细胞培养是生产植（三）规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径物次生产物的理想途径1保护生态环境保护生态环境2提高生产效率提高生产效率3促进新型生物技术产业的发展促进新型生物技术产业的发展1保护生态环境保护生态环境随着人们对药用植物资源的利用度日益增随着人们对药用植物资源的利用度日益增加，使不少药用植物资源处于濒危状态。加，使不少药用植物资源处于濒危状态。面对着药用植物有限的蕴藏量，如何进行面对着药用植物有限的蕴藏量，如何进行合理有效地开发利用是我们亟待解决的问合理有效地开发利用是我们亟待解决的问题。而自然界许多珍贵药用植物的有效成题。而自然界许多珍贵药用植物的有效

143、成分是其次生代谢产物，药用植物的次生代分是其次生代谢产物，药用植物的次生代谢产物作为药品香料越来越得到关注。谢产物作为药品香料越来越得到关注。采用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产采用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产物是解决资源问题的较为有效的途径物是解决资源问题的较为有效的途径目前我国珍稀植物及野生中药材资源令人目前我国珍稀植物及野生中药材资源令人堪忧。由于社会需求增多，人们盲目挖掘，堪忧。由于社会需求增多，人们盲目挖掘，再加上生态环境恶化，我国珍稀植物及野再加上生态环境恶化，我国珍稀植物及野生中药材资源锐减，有些品种还面临灭绝。生中药材资源锐减，有些品种还面临灭绝。受威胁最严重的野生中药

144、包含石斛珠子受威胁最严重的野生中药包含石斛珠子参金铁锁三颗针银背叶党参冬参金铁锁三颗针银背叶党参冬虫夏草雪莲杜仲等等，尤其野生天麻虫夏草雪莲杜仲等等，尤其野生天麻不但难找，甚至连标本都采集不到了。不但难找，甚至连标本都采集不到了。用药用植物细胞培养技术生产次用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产物有很大潜力。生代谢产物有很大潜力。首先次生代谢产物是在完全人工控制的条件下生首先次生代谢产物是在完全人工控制的条件下生产的，可一年四季不断进行，不受地区和季节限产的，可一年四季不断进行，不受地区和季节限制，节约土地，较便于工业化生产。其次，通过制，节约土地，较便于工业化生产。其次，通过改变培养条件和选择

145、优良系的方法可得到超越原改变培养条件和选择优良系的方法可得到超越原植物产量的代谢物，例如通过新疆紫草的细胞培植物产量的代谢物，例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高养获得了比原植株含量高6倍的紫草素。倍的紫草素。再者，药用植物的细胞培养是在无菌条件下完成再者，药用植物的细胞培养是在无菌条件下完成的，因此可排除病菌及虫害对药用植物的侵扰。的，因此可排除病菌及虫害对药用植物的侵扰。植物细胞具有植物细胞具有“全能性全能性”，利用生物技术中的，利用生物技术中的植物组织细胞培养技术将药用植物分生组织植物组织细胞培养技术将药用植物分生组织细胞进行离体培养，诱导愈伤组织并分化为细胞进行离体培养，诱导

146、愈伤组织并分化为完整植株。完整植株。“生物反应器培养快繁生物反应器培养快繁”是植物大规模培养快是植物大规模培养快繁的发展和重要组成部分，是在大规模培养生繁的发展和重要组成部分，是在大规模培养生物反应器内，借助于先进的自动控制技术，人物反应器内，借助于先进的自动控制技术，人工为生物繁殖体大量繁殖和快速生长营造最适工为生物繁殖体大量繁殖和快速生长营造最适宜的物理环境营养条件等，从而快速、大量宜的物理环境营养条件等，从而快速、大量地生产无病毒的植物体细胞胚和不定芽，大量地生产无病毒的植物体细胞胚和不定芽，大量繁殖珍贵稀有和难繁殖的药用植物，缓解野繁殖珍贵稀有和难繁殖的药用植物，缓解野生资源压力，避免

147、过度开发掘采而造成的生态生资源压力，避免过度开发掘采而造成的生态环境恶化。环境恶化。2提高生产效率提高生产效率植物体和细胞培养的紫草宁含量比较植物体和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产方式生产周期生产周期紫草宁含量（紫草宁含量（干重）干重）完整植株完整植株2 23 3年年1 12 2植物细胞培养植物细胞培养3 3周周1414珍稀濒危植物的培养快繁，也称为植物珍稀濒危植物的培养快繁，也称为植物“克隆克隆”，是基于植物细胞具有的全能性，是基于植物细胞具有的全能性，即每个植物细胞都可能像胚胎细胞一样可即每个植物细胞都可能像胚胎细胞一样可以在体外培养成完整的植株。以在体外培养成完整的植株。此此“克隆

148、克隆”技术培育的植物数量，不仅比技术培育的植物数量，不仅比常规繁殖方法提高常规繁殖方法提高50倍以上，而且成活率倍以上，而且成活率更高。更高。3促进新型生物技术产业的发展促进新型生物技术产业的发展（1）促进生物制药产业的发展；）促进生物制药产业的发展；（2）促进食品生物技术产业发展；）促进食品生物技术产业发展；（3）促进化工生物技术产业发展。促进化工生物技术产业发展。二、植物细胞规模化培养体系的建立二、植物细胞规模化培养体系的建立（一）植物细胞大规模培养的技术要求（一）植物细胞大规模培养的技术要求从工程的角度讲必须要进一步研究和开发从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的

149、生物反应器，适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统；从培养技术建立最佳的控制和调节系统；从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：方面讲必须满足以下三个条件：1培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；到产量恒定的产物；2细胞生长及生物合成的速度快，在较短细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量终产物；的时间内能得到较高产量终产物；3代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。解，最好能将其释放到培养基中。（二）植物细胞规模培养技术要点（二）植物细胞规模培养技术

150、要点1.细胞系的建立和选择细胞系的建立和选择2.优良细胞系的增殖培养优良细胞系的增殖培养3.大规模培养体系的建立大规模培养体系的建立（1）一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。培养系统。（2）两步法：用于目的产物合成在细胞生长发两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后

151、，大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。再将其转入到产物合成培养基中培养。（3）如果采用固相培养方式生产次生产物，一如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。般均需采用两步法建立体系。（三）培养方式的选择（三）培养方式的选择1悬浮细胞培养是指将单个游离细胞或小悬浮细胞培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖技术。细胞团在液体培养基中进行培养增殖技术。（1）起始培养物的建立）起始培养物的建立选择适宜的外植体：幼胚胚轴子叶选择适宜的外植体：幼胚胚轴子叶是最常使用的外植体。是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高浓度激素浓

152、度；选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。必要的附加物质。愈伤组织的要求：松散性好；增殖快；愈伤组织的要求：松散性好；增殖快；再生能力强。再生能力强。（2）悬浮系的建立）悬浮系的建立分批培养流加分批培养两级或多级分批培养流加分批培养两级或多级分批培养分批培养连续培养单级连续培养多级连续培连续培养单级连续培养多级连续培养回流式连续培养。养回流式连续培养。（3）影响悬浮细胞生长的因素影响悬浮细胞生长的因素起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量接种细胞密度接种细胞密度培养条件：方式温度培养条件：方式温度继代周期继代周期2固定化细胞培养固定化细胞培养细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部

153、或细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面的细胞培养系统。贴附在它的表面的细胞培养系统。近些年，通过固定化细胞培养的方法生产次生代近些年，通过固定化细胞培养的方法生产次生代谢物的研究也越来越多，谢物的研究也越来越多，固定化细胞培养加强了固定化细胞培养加强了细胞之间的接触，有利于细胞进行次生代谢，从细胞之间的接触，有利于细胞进行次生代谢，从而提高产量。同时，固定化有可能使细胞保持休而提高产量。同时，固定化有可能使细胞保持休止状态，可以解决植物细胞在悬浮培养中容易变止状态，可以解决植物细胞在悬浮培养中容易变异的问题。异的问题。（1）常用的固定化方法常用的固定化方法凝胶包埋；凝胶包埋

154、；吸附吸附；泡沫固定；泡沫固定；应用膜反应器。应用膜反应器。（2）固定化培养实例固定化培养实例固定化培养运用于植物细胞已有十几年的历史固定化培养运用于植物细胞已有十几年的历史,由由于固定化技术可以反复利用细胞于固定化技术可以反复利用细胞,增加细胞密度增加细胞密度,大幅度提高有效成分的产量。目前大幅度提高有效成分的产量。目前,固定化培养已固定化培养已成为利用植物细胞培养生产次生物质研究的一个成为利用植物细胞培养生产次生物质研究的一个重要方向。重要方向。例如，对硬紫草的新近研究表明，以微生物菌体例如，对硬紫草的新近研究表明，以微生物菌体制备的絮状生物作为活性载体，可提高操作的稳制备的絮状生物作为活

155、性载体，可提高操作的稳定性，同时还具有刺激细胞分泌次生代谢物活性定性，同时还具有刺激细胞分泌次生代谢物活性的作用，对硬紫草固定化方法和条件的研究，同的作用，对硬紫草固定化方法和条件的研究，同样可以尝试应用于新疆紫草。样可以尝试应用于新疆紫草。（3）植物细胞自生固定化植物细胞自生固定化植物细胞自生固定化培养是近几年才一发植物细胞自生固定化培养是近几年才一发展起来的一项培养技术。由于植物具有聚展起来的一项培养技术。由于植物具有聚集成团的特性，通过选择合适的植物激素集成团的特性，通过选择合适的植物激素及配比，可使悬浮培养的植物细胞自动聚及配比，可使悬浮培养的植物细胞自动聚集成具有一定分化程度的大颗粒

156、，在适当集成具有一定分化程度的大颗粒，在适当的培养条件下，培养液是澄清的，几乎无的培养条件下，培养液是澄清的，几乎无单个细胞存在。植物细胞自生固定化可以单个细胞存在。植物细胞自生固定化可以免去人工载体的使用，但它仍具有人工固免去人工载体的使用，但它仍具有人工固定化细胞培养的优点。定化细胞培养的优点。目前只有鸟茄烟草咖啡万寿菊高目前只有鸟茄烟草咖啡万寿菊高山红景天等少数几种植物，实现了细胞自山红景天等少数几种植物，实现了细胞自身固定化培养。身固定化培养。研究表明自生固定化的植物细胞颗粒内具研究表明自生固定化的植物细胞颗粒内具有内在的有效的氧传递机制，颗粒内细有内在的有效的氧传递机制，颗粒内细胞的

157、生长并不会受到氧扩散限制的影响。胞的生长并不会受到氧扩散限制的影响。三、生物反应器类型及特点三、生物反应器类型及特点植物细胞培养技术能否大规模工业化商业化，植物细胞培养技术能否大规模工业化商业化，关键在于能否设计出合适的生物反应器关键在于能否设计出合适的生物反应器（bioreactor）。）。由于植物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的由于植物细胞与微生物细胞有很大差异，传统的微生物反应器显然不适用于植物细胞的大规模培微生物反应器显然不适用于植物细胞的大规模培养。养。首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，首先必须满足在低剪切力及良好的混合状态下，能够提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物能够

158、提供充足的氧以供细胞生长及细胞进行产物的合成。的合成。生物反应器的优点生物反应器的优点生物反应器技术已广泛应用于微生物发酵生物反应器技术已广泛应用于微生物发酵技术技术,反应器培养具有很多优点反应器培养具有很多优点:工作体工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。条件控制方便等。（一）植物细胞悬浮培养生物反（一）植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点应器主要类型及其特点目前，植物细胞悬浮培养用生物反应器主目前，植物细胞悬浮培养用生物反应器主要可分为要可分为4种：机械搅拌式反应器气升式种：机械搅拌式反应器气升式反应器鼓泡式反应器和转鼓式反应器

159、。反应器鼓泡式反应器和转鼓式反应器。固定化植物细胞反应器主要可分为流化床固定化植物细胞反应器主要可分为流化床反应器中空纤维及其它膜式反应器填反应器中空纤维及其它膜式反应器填充床反应器等。充床反应器等。生物反应器结构示意图生物反应器结构示意图图图(A)：搅拌式生物反应器（：搅拌式生物反应器（stirredtankreactor），内含搅拌装置；），内含搅拌装置；图图(B)：气泡柱式生物反应器（：气泡柱式生物反应器（bubblereactor），主要依赖以喷雾形式引入的），主要依赖以喷雾形式引入的空气或其它气体进行搅拌；空气或其它气体进行搅拌；图图(C)(D)：气升式生物反应器（：气升式生物反应器

160、（airliftreactor），内含内置或外置的循环管道，内含内置或外置的循环管道，由引入的气体运动导致反应器内不同部由引入的气体运动导致反应器内不同部位液体密度不同，是培养基进行混合并位液体密度不同，是培养基进行混合并保持循环流动保持循环流动(C)、(D)分别为外环流和内环流两种分别为外环流和内环流两种（二）固定化植物细胞反应器（二）固定化植物细胞反应器固定化细胞较悬浮细胞具有较多的优点：固定化细胞较悬浮细胞具有较多的优点：(1)有利于次级代谢产物的积累；有利于次级代谢产物的积累；(2)细胞经包埋后，可以减小剪切力的损伤，细胞经包埋后，可以减小剪切力的损伤，有利于产物合成和分泌；有利于产物

161、合成和分泌；(3)有利于进行连续培养和生物转化等有利于进行连续培养和生物转化等.细胞固定化培养技术按照其支持细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类物不同可以分为两大类（1）平床培养系统平床培养系统（2）立柱培养系统）立柱培养系统植物细胞平床培养系统植物细胞平床培养系统本系统由培养液、储液罐和动泵等构成。新鲜的本系统由培养液、储液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过管道向下滴注培养液。培养

162、床上的营养液再通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。空气的设备。植物细胞立柱培养系统植物细胞立柱培养系统本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个制成一个个1-2cm3的细胞团块

163、，并将它们的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即流经大部分细胞，亦即滴液区滴液区比例大大提比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。面积大为减小。这一技术的优点在于：这一技术的优点在于：细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；度，有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可由于

164、细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。可以中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。可以较容易

165、地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节定的代谢途径，并便于调节植物细胞固定化培养时必须考虑植物细胞固定化培养时必须考虑以下几个问题：以下几个问题：所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间的生活能力；的生活能力；所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影响，对产物的合成是否有阻碍；响，对产物的合成是否有阻碍；终产物是否能释放到培养基中，如果产物不释终产物是否能释放到培养

166、基中，如果产物不释放到培养基中，是否能采用物理放到培养基中，是否能采用物理(电击电击)或化学或化学(离离子渗透法子渗透法)方法使其释放而又不影响细胞生活力。方法使其释放而又不影响细胞生活力。虽然生物反应器技术在植物组织细胞培养虽然生物反应器技术在植物组织细胞培养中的应用存在一定困难，应用也不尽广泛，中的应用存在一定困难，应用也不尽广泛，但其应用可大大降低劳动力需求，而且反但其应用可大大降低劳动力需求，而且反应器中通过物化条件调控可达到最佳的生应器中通过物化条件调控可达到最佳的生长、分化和代谢，不受时间和地点的限制，长、分化和代谢，不受时间和地点的限制，随时随地进行规模化生产，这为植物组织随时随

167、地进行规模化生产，这为植物组织细胞培养工业化开辟了广阔的前景。细胞培养工业化开辟了广阔的前景。四植物细胞规模化培养中的有四植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题及解决方案关工程技术问题及解决方案（一）有关工程技术问题（一）有关工程技术问题1悬浮培养系统必须适应植物细胞特性悬浮培养系统必须适应植物细胞特性2植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的流变特性3植物细胞培养过程中的气体调节植物细胞培养过程中的气体调节4泡沫和表面粘附性泡沫和表面粘附性5剪切力对植物细胞的影响剪切力对植物细胞的影响（二）解决方案（二）解决方案随着不同产品过程优化与放大技术研究的随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫

168、切需要新设计原理的生物反应器进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。代生物技术改造的主要内容之一。（二）解决方案（二）解决方案例如，机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细例如，机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如下改进：胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如

169、下改进：（1）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小，）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小，搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器（但其缺点是搅拌不均匀）。（但其缺点是搅拌不均匀）。（2）因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水）因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；分和

170、营养，因此必须设计加液装置；（3）由于植物细胞的生理活动需要新鲜空）由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，氧气，且细胞代谢也可能产生有害气体，氧和二氧化碳的控制调节，氧过多或过少均和二氧化碳的控制调节，氧过多或过少均不利于生长，所以必须设计通气装置；不利于生长，所以必须设计通气装置；（4）便于取样观察，一般还设计有取样口。）便于取样观察，一般还设计有取样口。本节复习思考题本节复习思考题1名词解释：植物细胞名词解释：植物细胞规模培养悬浮培养固规模培养悬浮培养固定化培养次生代谢产物定化培养次生代谢产物2.悬浮培养与固定化培养悬浮培养与固定化培养有何区别？有何区别？3.生

171、产、分离次生代谢产生产、分离次生代谢产物有何意义物有何意义？再见！第五节植物细胞培养的应用第五节植物细胞培养的应用一、筛选突变体一、筛选突变体二、生产植物次生代谢产物二、生产植物次生代谢产物本章几个基本概念本章几个基本概念体细胞：生殖细胞以外的细胞。体细胞：生殖细胞以外的细胞。体细胞无性变异株：是一株由体细胞经无性过程体细胞无性变异株：是一株由体细胞经无性过程培养发生的体细胞变异植株。培养发生的体细胞变异植株。突变体：经过突变而产生的新个体。突变体：经过突变而产生的新个体。嵌合性：同一有机体中同时存在有遗传组成不同嵌合性：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。的细

172、胞，它是组织培养中常见的现象。嵌合体：同一有机体中同时存在有遗传组成不同嵌合体：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞的个体。的细胞的个体。一、筛选突变体一、筛选突变体（一）植物细胞培养与突变体筛选（一）植物细胞培养与突变体筛选由于生物体突变频率低，由于生物体突变频率低，植物基因突变频率一般植物基因突变频率一般为为10-7，且绝大多数为有害突变。在自然界发现，且绝大多数为有害突变。在自然界发现适合于我们人类需要的性状突变是很难的，即使适合于我们人类需要的性状突变是很难的，即使是出现了也常常是嵌合体而难以利用是出现了也常常是嵌合体而难以利用.而单细胞培养，不仅提高了突变率，也可利用细而单细胞培

173、养，不仅提高了突变率，也可利用细胞的全能性分离培养获得突变体（胞的全能性分离培养获得突变体（mutant）。）。举例：选择二倍体突变植株举例：选择二倍体突变植株哪种细胞是哪种细胞是突变细胞？突变细胞？诱变处理的单倍体体细胞在基本培养基诱变处理的单倍体体细胞在基本培养基中培养中培养96小时，有营养缺陷的细胞不能小时，有营养缺陷的细胞不能继续生长，只有野生型细胞生长旺盛。继续生长，只有野生型细胞生长旺盛。此时把此时把BUdR加入培养基，暗培养加入培养基，暗培养36hr，BUdR只能与活跃生长的细胞中的只能与活跃生长的细胞中的DNA结合，并使与其结合的结合，并使与其结合的DNA获得光获得光敏特性，因

174、此当把培养物再转到光下时，敏特性，因此当把培养物再转到光下时，引起在基本培养基上生长的那些细胞引起在基本培养基上生长的那些细胞DNA严重损伤，突变细胞不结合严重损伤，突变细胞不结合BUdR。将两种细胞转入完全培养基，只有突变将两种细胞转入完全培养基，只有突变细细胞胞才能繁殖，再经过二倍化处理，可得到才能繁殖，再经过二倍化处理，可得到纯合二倍体突变系。纯合二倍体突变系。自发突变和诱发突变自发突变和诱发突变突变可以是自发产生（自发突变），也可突变可以是自发产生（自发突变），也可以受诱变剂诱发产生（诱发突变）。以受诱变剂诱发产生（诱发突变）。影响突变频率的因素包括植物的遗传基因影响突变频率的因素包括

175、植物的遗传基因型、年龄、细胞和组织继代培养的时间、型、年龄、细胞和组织继代培养的时间、培养部位、培养基的组成和培养的环境条培养部位、培养基的组成和培养的环境条件等。件等。1诱变剂的选择诱变剂的选择植物细胞的诱变因素与微生物细胞的基本植物细胞的诱变因素与微生物细胞的基本相同。相同。诱变剂可分物理和化学的两大类型。诱变剂可分物理和化学的两大类型。物理诱变物理诱变物理诱变主要是通过射线磁场以及温度物理诱变主要是通过射线磁场以及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后等对培养物进行一定处理，然后对处理后的的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括括X射线射线射线快中子

176、（高能粒子）射线快中子（高能粒子）紫外线等。其中紫外线诱变不需要昂贵的紫外线等。其中紫外线诱变不需要昂贵的设备，一般实验室都可以应用。设备，一般实验室都可以应用。化学诱变化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。突变。烷化剂烷化剂碱基类似物碱基类似物移码诱变剂，如移码诱变剂，如ICR化合物和吖啶类似物等；化合物和吖啶类似物等；其它如亚硝酸其它如亚硝酸羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。化学诱变剂都是一些结构复杂的试剂，一般都有化学诱

177、变剂都是一些结构复杂的试剂，一般都有毒性，大多有致癌作用，因此操作起来要特别小毒性，大多有致癌作用，因此操作起来要特别小心。心。2诱变材料的选择诱变材料的选择选择起始材料需根据试验目标确定，一般选择起始材料需根据试验目标确定，一般需考虑以下几方面的问题：需考虑以下几方面的问题：目标性状的目标性状的可行性。可行性。必需充分考虑试验植物的细胞必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。择方案。适当的细胞类型亦是提高体细适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要

178、条件。胞突变系筛选效率的重要条件。（二）突变体的类型（二）突变体的类型目前，已筛选到遗传变异植物主要有以下目前，已筛选到遗传变异植物主要有以下几类：抗寒抗旱耐盐营养缺陷型几类：抗寒抗旱耐盐营养缺陷型抗氯酸盐抗氨基酸抗抗菌素类药物抗氯酸盐抗氨基酸抗抗菌素类药物抗除草剂和抗病虫性植物的新品种。抗除草剂和抗病虫性植物的新品种。其中，营养缺陷型抗氯酸盐和抗抗菌素其中，营养缺陷型抗氯酸盐和抗抗菌素类药物的突变体，已被广泛应用于遗传学类药物的突变体，已被广泛应用于遗传学和基因工程的研究之中。和基因工程的研究之中。（三）突变体的筛选方法（三）突变体的筛选方法通常采用的筛选方法有正筛选系统、负筛通常采用的筛选

179、方法有正筛选系统、负筛选系统和选系统和“绿岛法绿岛法”选择三种。选择三种。1.正选择系统正选择系统正选择系统又称直接筛选系统，是在设计的选择正选择系统又称直接筛选系统，是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，可选用最适培养基并加入一些药物使突变体基，可选用最适培养基并加入一些药物使突变体细胞能正常生长，而其他细胞不能生长，将变异细胞能正常生长，而其他细胞不能生长，

180、将变异了的细胞选择出来。了的细胞选择出来。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。用的体细胞变异体。2.负选择系统负选择系统这是一种很巧妙的筛选法也可叫做负选择法。这是一种很巧妙的筛选法也可叫做负选择法。这种方法是先用特定的培养基使发生遗传变异这种方法是先用特定的培养基使发生遗传变异的细胞停止生长，而正常未发生突变的细胞可的细胞停止生长，而正常未发生突变的细胞可以生长；以生长；这时加入一种可以杀死正在生长的细胞而对不这时加入一种可以杀死正在生长的细胞而对不生长细胞无害的药物（一种能使生长的细胞中生长细胞无害的药物（一种能使生长的细胞

181、中毒死亡的汰选剂），淘汰去这些细胞，然后再毒死亡的汰选剂），淘汰去这些细胞，然后再改变条件，使处于停止生长状态的未杀死的突改变条件，使处于停止生长状态的未杀死的突变细胞重新恢复生长；这样就可以只保留期望变细胞重新恢复生长；这样就可以只保留期望得到的变异细胞。得到的变异细胞。3“绿岛法绿岛法”选择法选择法对于抗病毒突变体抗除草剂突变体的对于抗病毒突变体抗除草剂突变体的筛选，可以采用筛选，可以采用“绿岛法绿岛法”。这种方法最。这种方法最早用于抗除草剂，叶片大面积枯黄，仅有早用于抗除草剂，叶片大面积枯黄，仅有少量抗除草剂突变细胞组织仍保持绿色，少量抗除草剂突变细胞组织仍保持绿色，取这部分材料则成为很

182、小的绿岛，因而形取这部分材料则成为很小的绿岛，因而形象地称之为象地称之为“绿岛法绿岛法”。二、生产植物次生代谢产物二、生产植物次生代谢产物细胞培养物的某些次生化合物含量有的比细胞培养物的某些次生化合物含量有的比植物体高出植物体高出2-5倍。倍。生物转化率高生物转化率高细胞培养物给细胞提供一般情况下植物所细胞培养物给细胞提供一般情况下植物所不具备的底物化合物；不具备的底物化合物；提供植物天然产物的中间体，以期提高天提供植物天然产物的中间体，以期提高天然化合物产量，从而提高次生代谢产物。然化合物产量，从而提高次生代谢产物。（一）植物次生代谢产物的种类（一）植物次生代谢产物的种类从植物提取的有机物包

183、括初生代谢物和次生代从植物提取的有机物包括初生代谢物和次生代谢物两大类。初生代谢物与植物生长、发育、谢物两大类。初生代谢物与植物生长、发育、繁殖直接相关，是植物获得能量的代谢，为植繁殖直接相关，是植物获得能量的代谢，为植物体生存、生长、发育、繁殖提供能量和中间物体生存、生长、发育、繁殖提供能量和中间产物。产物。植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程特异性。

184、次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。次生代谢物是以初生代谢的一称为次生代谢。次生代谢物是以初生代谢的一些中间产物作为原料或前体，进行进一步的代些中间产物作为原料或前体，进行进一步的代谢过程。谢过程。植物次生产物种类植物次生产物种类植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种）万种），根据分子结构不同大致分为：，根据分子结构不同大致分为：1酚类化合物黄酮类单酚类酚类化合物黄酮类单酚类2醌醌类（苯醌萘醌蒽醌）类（苯醌萘醌蒽醌）3萜类化合物三萜皂甙萜类化合物三萜皂甙4甾体皂甙甾体皂甙5单萜倍半萜二萜单萜倍半萜二萜植物次生产物种类植物次生产物种类6含氮化

185、合物生物碱（真生物碱伪含氮化合物生物碱（真生物碱伪生物碱原生物碱）生物碱原生物碱）7胺类（伯仲叔季胺）胺类（伯仲叔季胺）8非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸9生氰甙生氰甙10多炔类有机酸等多炔类有机酸等Production of anthocyanin（三）影响植物组织细胞培养（三）影响植物组织细胞培养生产次生代谢产物的因素生产次生代谢产物的因素1内因内因：细胞的遗传特性；母细胞外植：细胞的遗传特性；母细胞外植体的生理状态体的生理状态2外因外因（1）外植体的选择外植体的选择田间材料取田间材料取样的时间季节取样部位（无菌苗的下胚样的时间季节取样部位（无菌苗的下胚轴子叶真叶等）大小等。接种的外轴子叶真叶

186、等）大小等。接种的外植体不能太小，小于肉眼能见的限度时，植体不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。的大小要适当。（2）高产细胞系的选择高产细胞系的选择建立高产细胞系应注意的问题为以下几方建立高产细胞系应注意的问题为以下几方面：面：选出的细胞系中次生物质的产量是否高于选出的细胞系中次生物质的产量是否高于起源植物；起源植物；继代培养后生物合成能力是否能保持；继代培养后生物合成能力是否能保持；生长是否快速；生长是否快速；材料成本核算等。材料成本核算等。（3）基本培养基的筛选基本培养基的筛选基本培养基的筛选：碳源无机盐类（

187、大基本培养基的筛选：碳源无机盐类（大量元素微量元素）植物生长调节剂量元素微量元素）植物生长调节剂（激素）前体物质附加物等。培养基（激素）前体物质附加物等。培养基的组成对植物细胞的生长和代谢物质的生的组成对植物细胞的生长和代谢物质的生产影响极大。产影响极大。关于培养基关于培养基典型的培养基有典型的培养基有Murashige-Skoog(MS),Linsmaier-Skoog(LS)，white和和B5等四种。等四种。碳源：通常使用碳源：通常使用23的蔗糖作碳源，也有使的蔗糖作碳源，也有使用葡萄糖或果糖。使用单糖的优点是方便分析测用葡萄糖或果糖。使用单糖的优点是方便分析测定，且有助于细胞生长动力学

188、分析。定，且有助于细胞生长动力学分析。无机盐类：在无机盐中，磷酸根及氮源无机盐类：在无机盐中，磷酸根及氮源(NH4+或或N03-)的含量对细胞的生长与物质生产有明显的的含量对细胞的生长与物质生产有明显的影响。另外，一些金属离子如影响。另外，一些金属离子如Ca2+Cu2+Mg2+等的含量往往也有重要影响。等的含量往往也有重要影响。植物生长调节物质：植物生长调节物质对植物植物生长调节物质：植物生长调节物质对植物细胞的生长和代谢物质生产的影响十分大。它可细胞的生长和代谢物质生产的影响十分大。它可分为两大类：植物生长素类有分为两大类：植物生长素类有2，4D(二氯苯氧二氯苯氧基乙酸基乙酸)IAA(吲哚基

189、醋酸吲哚基醋酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)等，细等，细胞激动素类有胞激动素类有BA(苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)动力精和玉米素。动力精和玉米素。其他因素：植物细胞培养的影响因素还有培养其他因素：植物细胞培养的影响因素还有培养系统内气相组成系统内气相组成(CO2和乙烯含量和乙烯含量)前体物质前体物质氨基酸维生素及诱导剂等。氨基酸维生素及诱导剂等。（4）培养条件培养条件主要有温度主要有温度搅拌搅拌pH值值通气条件通气条件光照光照细胞龄细胞龄接种量接种量培养时间等培养时间等温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。通常，植物细胞培养采用物生成有重要影响。

190、通常，植物细胞培养采用25。搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90120rmin。pH值：通过细胞膜进行的值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞离子传递对细胞的生育环境生理活性来说无疑是重要的。在培的生育环境生理活性来说无疑是重要的。在培养过程中，通常养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一作为一个重要参数被控制在一定范围内。植物细胞培养的适宜定范围内。植物细胞培养的适宜pH值一般为值一般为56。一体化发酵罐一体化发酵罐培养条件自动化控制培养条件自动化控制通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子学因子光：光

191、对植物有着特殊的作用。光照射条件不光：光对植物有着特殊的作用。光照射条件不仅通过光照周期光的质量仅通过光照周期光的质量(即种类波长即种类波长)而且通而且通过光照量过光照量(光强度光强度)的调节来影响植物细胞的生理特的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。研究表明，光调节着细胞中的关性和培养特性。研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。有时却起着阻害作用。细胞龄：在培养过程的不同时期，细细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况生长与物质生产能力差胞的生理状况生长与物质生产能力差异显著。而且，使用

192、不同细胞龄的种细异显著。而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不一样。通常，使用处于对数生长期大不一样。通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。较合适。接种对数生长期细胞接种对数生长期细胞接种量：在植物细胞培养中，接种量也接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。在再次培养中，往往取是一个影响因素。在再次培养中，往往取前次培养液的前次培养液的520作为种液，也以接种作为种液，也以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为细胞湿重为基准，其接种浓度为1550g(湿细胞湿细胞)L。由

193、于接种量对细胞产率及二。由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影响，故应根据次代谢物质的生产有一定影响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。种量。培养时间：不同外植体的悬浮细胞培养物，其培养时间：不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的积累时间各异。同一化合物最大次级代谢产物的积累时间各异。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积。例如，可以在不同外植体的不同生长阶段中累积。例如，有些植物其次生代谢产物在延迟期积累，如曼佗有些植物其次生代谢产物在延迟期积累，如曼佗罗属的托品类生物碱；有些植物其次生代谢产物罗属的托品类生物碱

194、；有些植物其次生代谢产物在对数期积累，如胡罗卜属的肉桂酸烟草属的在对数期积累，如胡罗卜属的肉桂酸烟草属的烟碱及长春花属的利血平；有些植物其次生代谢烟碱及长春花属的利血平；有些植物其次生代谢产物在稳定期大量积累，如紫草的紫草宁碱红产物在稳定期大量积累，如紫草的紫草宁碱红玫瑰的绿原酸等；玫瑰的绿原酸等；（四）（四）提高细胞次生代谢产物的提高细胞次生代谢产物的途径途径1明确植物细胞生长与产物合成的关系；明确植物细胞生长与产物合成的关系；2选择适宜的起始材料；选择适宜的起始材料；3选择合适的培养基成分；选择合适的培养基成分；4激发子的应用激发子的应用5培养技术的选择培养技术的选择（五）植物次生代谢物的

195、分离纯（五）植物次生代谢物的分离纯化化1提取方法提取方法2分离和精制方法分离和精制方法一般常用的分离精制方法有系统溶剂分一般常用的分离精制方法有系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、离法、两相溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、透析法、分馏法、结晶法、层析法等。透析法、分馏法、结晶法、层析法等。例如：液例如：液-液萃取步骤（液萃取步骤（1）溶剂体积为样品溶液的溶剂体积为样品溶液的30303535。振荡几次振荡几次打开活塞打开活塞Gas蒸气逸出（也叫放气）蒸气逸出（也叫放气）液液-液萃取步骤（液萃取步骤（2）絮状物絮状物（乳化）（乳化）有机相有机相水相水相水相和絮状物水相和絮状物静置分层静置分

196、层激烈振摇激烈振摇1 1 2min2min液液-液萃取步骤（液萃取步骤（3）有机相有机相35次次液液-固萃取主要工艺流程固萃取主要工艺流程固体萃取溶剂振荡（加热）离心/过滤分离欲萃取组分进入溶剂。（一）、萃取过程（一）、萃取过程 溶解和扩散的过程溶解和扩散的过程 分子扩散：分子扩散：固体样品表面/溶剂接解处影响因素：温度、分子大小和液体介质的黏度。对流扩散：对流扩散：远离固体样品表面处的扩散影响因素：流动液体的速度和状态，液体的黏度、样品表面的性质等。 索氏萃取装置和索氏萃取装置和K-D浓缩器浓缩器（二）、萃取装置（二）、萃取装置1-电炉；2-克莱森瓶；3-毛细管；4-螺旋止水夹；5-温度计；

197、6-细铜丝；7-冷凝器；8-接受瓶；9-接收管；10-转动把；11-压力计；12-安全瓶；13-三通管阀门；14-接抽气机减压蒸馏装置示意图减压蒸馏装置示意图水蒸汽蒸馏水蒸汽蒸馏对象：对象：有机物具备条件：具备条件：几乎不溶于水、不会发生化学变化、在100下蒸汽压有大于1.3kPa。盛水量为75液体样品1/3。烧瓶倾斜45o冷凝管：30o 。 水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏装置被蒸馏的材料根本不会加热到比蒸汽的温度还高。净化（纯化）主要工艺净化（纯化）主要工艺样品经萃取被测成分萃取液含有杂质干扰测定。 萃取液适当处理除去杂质纯化。温馨提示温馨提示由于植物品种繁多，成分各异，因此不可由于植物品种繁多，

198、成分各异，因此不可能有千篇一律的提取、分离方法，而是要能有千篇一律的提取、分离方法，而是要将各种方法取长补短，灵活应用。将各种方法取长补短，灵活应用。本章小结本章小结植物细胞培养技术包括单细胞培养悬浮培养以植物细胞培养技术包括单细胞培养悬浮培养以及规模培养。单细胞培养技术包括单细胞分离与及规模培养。单细胞培养技术包括单细胞分离与培养，分离方法有两种：由植物器官分离单细胞；培养，分离方法有两种：由植物器官分离单细胞；由愈伤组织分离单细胞。悬浮培养中继代培养由愈伤组织分离单细胞。悬浮培养中继代培养培养同步化以及影响培养的因素。规模培养中培培养同步化以及影响培养的因素。规模培养中培养体系的建立方法，

199、生物反应器的类型：搅拌式养体系的建立方法，生物反应器的类型：搅拌式生物反应器气泡柱式生物反应器气升式生物生物反应器气泡柱式生物反应器气升式生物反应器。植物细胞培养的应用：筛选突变体生反应器。植物细胞培养的应用：筛选突变体生产植物次生代谢产物。产植物次生代谢产物。复习思考题复习思考题1.植物植物细胞大规模培养有哪些培养系统？细胞大规模培养有哪些培养系统？2.植物细胞突变体通常采用的筛选方法有植物细胞突变体通常采用的筛选方法有哪些？哪些？3.植物细胞规模培养与次生产物生产前景植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题。及需要研究解决的问题。再见！第七章第七章植物基因转化受体系统植物基因

200、转化受体系统本章所讲内容：本章所讲内容：建立植物基因转化受体系统的基本条件；建立植物基因转化受体系统的基本条件；植物基因转化受体系统的类型及其特性；植物基因转化受体系统的类型及其特性；建立植物基因转化受体系统的程序及要求；建立植物基因转化受体系统的程序及要求；建立植物基因转化受体系统过程中的常见问建立植物基因转化受体系统过程中的常见问题及解决方案。题及解决方案。概述：概述：植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来，植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来，构建重组构建重组DNA分子导入受体物种中，筛选出获得目分子导入受体物种中，筛选出获得目标基因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。标基

201、因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。化选择抗生素敏感的再生系统。植物基因转化受体系统应具备的条件：植物基因转化受体系统应具备的条件：（1）高效稳定的再生能力：高频率、高稳定性和）高效稳定的再生能力：高频率、高稳定性和重复性；重复性；（2）较高的遗传稳定性；）较高的遗传稳定性；（3）具有稳定的外植体来源：

202、无菌实生苗；）具有稳定的外植体来源：无菌实生苗；（4）对选择性抗生素敏感：植物受体材料对所选）对选择性抗生素敏感：植物受体材料对所选的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物没有严重的毒性；没有严重的毒性；（5）对农杆菌侵染有敏感性。）对农杆菌侵染有敏感性。第一节第一节植物基因转化受体系统的类型及其特植物基因转化受体系统的类型及其特性性一、愈伤组织再生系统一、愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统。通过分化培养获得再生植株的受体系

203、统。特点：特点：（1）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易于接受外源基因的能力，转化率较高；于接受外源基因的能力，转化率较高；（2）扩繁量大，可获得较多的转化植株；）扩繁量大，可获得较多的转化植株；（3）外植体试材广泛；）外植体试材广泛；（4）该再生系统获得的再生植株无性系变异较大；）该再生系统获得的再生植株无性系变异较大；（5）该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再）该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物；生植株的植物；（6）嵌合体多。）嵌合体多。二、直接分化再生系统二、直接分化再生系统直接分化再生系统是指

204、外植体细胞越过脱分化产生直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。蝴蝶兰腋芽萌发蝴蝶兰腋芽萌发特点：特点：(1)获得再生植株的周期短，操作简单；获得再生植株的周期短，操作简单；(2)体细胞无性系变异小，能较好地保持受体植物的体细胞无性系变异小，能较好地保持受体植物的遗传稳定性；遗传稳定性；(3)更适于无性繁殖的园艺植物，但对茎尖培养困难更适于无性繁殖的园艺植物，但对茎尖培养困难的粮食作物有一定局限性；的粮食作物有一定局限性；(4)其转化频率低于愈伤组织再生系统；其转化频率低于愈伤组织再生系统；(5)直接再

205、生系统同样出现较多的嵌台体。直接再生系统同样出现较多的嵌台体。三、原生质体再生系统三、原生质体再生系统特点：特点：(1)原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直接高效地摄取外源接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核；或遗传物质，甚至细胞核；(2)通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；(3)原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转

206、化和鉴定；同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；(4)该受体系统可适用于各种转化系统；该受体系统可适用于各种转化系统；(5)细胞无性系的变异更为强烈，即遗传稳定性更差；细胞无性系的变异更为强烈，即遗传稳定性更差；(6)原生质体培养周期长、难度大、再生频率低，其原生质体培养周期长、难度大、再生频率低，其局限性也较大。局限性也较大。四、胚状体再生系统四、胚状体再生系统胚胚发发育育特点：特点：(1)胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，转化胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，转化率和转化效率都很高；率和转化效率都很高；(2)胚状体的发生多数是单细胞起源，因此转化获得的转基胚状体的发生多数

207、是单细胞起源，因此转化获得的转基因植株嵌合体少；因植株嵌合体少；(3)胚状体具有两极性，减少了不定芽发育途径中比较困难胚状体具有两极性，减少了不定芽发育途径中比较困难的一个环节的一个环节生根培养；生根培养；(4)利用转基因的胚状体可以生产人工种子；利用转基因的胚状体可以生产人工种子；(5)体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异小、胚体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异小、胚的结构完整、成苗快、数量大等许多优点，有利于转基因植的结构完整、成苗快、数量大等许多优点，有利于转基因植株的生产和推广。株的生产和推广。五、生殖细胞受体系统五、生殖细胞受体系统利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花

208、粉粒、卵细胞为利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也称之为种质系统。称之为种质系统。两个途径：一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单两个途径：一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，进一步分化发倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化受体系统；二育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行

209、基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）取下花蕾（镜检）预培养数天预培养数天取花药取花药分离分离花粉花粉特点：特点：(1)由于以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，由于以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，因此具有更强的接受外源因此具有更强的接受外源DNA的潜能；的潜能；(2)由于受体细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐由于受体细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性的影响，大大缩短了复杂的选育纯化过程；性的影响，大大缩短了复杂的选育纯化过程；(3)利用植物自身的授粉过程操作方便、简单；利用植物自身的授

210、粉过程操作方便、简单；(4)利用该受体系统进行转化受到季节的限制，只能利用该受体系统进行转化受到季节的限制，只能在短暂的开花期内进行，无性繁殖的植物不宜采用。在短暂的开花期内进行，无性繁殖的植物不宜采用。第二节第二节植物基因转化受体系统建立的程序植物基因转化受体系统建立的程序外植体的选择制备外植体的选择制备高频再生系统的建立高频再生系统的建立抗菌素的敏感性试验抗菌素的敏感性试验农杆菌的敏感性试验农杆菌的敏感性试验(以农杆菌介导转化的以农杆菌介导转化的植物植物)一、高频再生系统的建立一、高频再生系统的建立高频再生系统必须具有四个条件：高频再生系统必须具有四个条件：外植体的组织细胞具有再生愈伤组织

211、和完整植株外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力，而且最好是外植体能直接分化芽；的能力，而且最好是外植体能直接分化芽；芽的分化率高，能达到芽的分化率高，能达到90以上；以上；易于离体培养，具有高度可重复性；易于离体培养，具有高度可重复性；体细胞无性系变异小。体细胞无性系变异小。1、外植体的选择、外植体的选择(1)选择幼年型的外植体；选择幼年型的外植体；(2)选择增殖能力强的外植体和萌动期的外植选择增殖能力强的外植体和萌动期的外植体：如复壮的性细胞、花粉管的二倍体细胞体：如复壮的性细胞、花粉管的二倍体细胞；(3)选择具有强再生能力基因型的外植体：选选择具有强再生能力基因型的外植体：选择

212、未分化或分化程度较轻的组织作为外植体择未分化或分化程度较轻的组织作为外植体使用使用，外植体的再生能力是受染色体上的基，外植体的再生能力是受染色体上的基因所调控因所调控；(4)选择遗传稳定性好的外植体：顶端分生组织选择遗传稳定性好的外植体：顶端分生组织和形成层中的初生形成层细胞、胚细胞等；和形成层中的初生形成层细胞、胚细胞等；（5）外植体的选择与受体系统类型的）外植体的选择与受体系统类型的匹配。匹配。2、培养基的选择、培养基的选择(1)基本培养基类型及其特点：基本培养基类型及其特点：第一类：含盐量较高的培养基：第一类：含盐量较高的培养基：MLS培养基培养基(LinsmaierandSkoog，1

213、965)、BL培养基培养基(BrownandLawrence，1968)、BM培养基培养基(Button，1975)及及ER培养基培养基(Eriksson，1965)等。等。S培养基培养基(MurashigeandSkoog，1962)；第二类：硝酸钾含量较高的培养基：第二类：硝酸钾含量较高的培养基：B5培养基培养基(Gamborgetal，1968)、N6培养基培养基(朱至清等，朱至清等，1975)、SH培养基培养基(SckenkandHildebrandt，1972)等等；第三类：中等无机盐含量的培养基：第三类：中等无机盐含量的培养基：H培养基培养基(BourginandNitsch，19

214、67)、Nitseh(1969)培养培养基、基、Miller(1963)培养基和培养基和Blaydes(1966)培养基等培养基等；第四类：低无机盐含量的培养基：怀特（第四类：低无机盐含量的培养基：怀特（White1943)培养基、培养基、WS培养基培养基(WolterandSkoog，1966)、HE培养基（培养基（Hel1er，1953)、改良、改良Nitsch(1951)培养基及培养基及HB培养基培养基(HollyandBaker，1963)等。等。(2)基本培养基的选择基本培养基的选择1)植物的营养特性植物的营养特性2)选择原则选择原则3)激素的选择原则激素的选择原则选择原则选择原则：

215、同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；类型基本相同；同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同；同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同；植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性；植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性；MS培养基是大多数植物的通用培养基；培养基是大多数植物的通用培养基；无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参数；数；有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化

216、不大；有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大；蔗糖浓度不可忽视，应该在确定基本培养基类型后研究最适的蔗糖浓度；蔗糖浓度不可忽视，应该在确定基本培养基类型后研究最适的蔗糖浓度；提高磷酸根的水平可以抵消提高磷酸根的水平可以抵消IAA对芽的抑制作用，促进芽的分化；对芽的抑制作用，促进芽的分化；水解酪蛋白能加强激动素诱导分化作用，特别当有高水平的水解酪蛋白能加强激动素诱导分化作用，特别当有高水平的IAA时更为显著，时更为显著，酪氨酸可以相当有效地代替水解酪蛋白的作用。酪氨酸可以相当有效地代替水解酪蛋白的作用。二、抗生素敏感性试验二、抗生素敏感性试验使用抗生素的目的：使用抗生素的目的：一是抑制

217、农杆菌生长；一是抑制农杆菌生长；二是筛选转化细胞。二是筛选转化细胞。三、农杆菌的敏感性试验及菌种的选择三、农杆菌的敏感性试验及菌种的选择原理：利用野生型农杆菌能在外植体组织中原理：利用野生型农杆菌能在外植体组织中形成肿瘤形成肿瘤(或发根或发根)。根据肿瘤的诱导率、发生。根据肿瘤的诱导率、发生时间及生长状态可确定其敏感程度。时间及生长状态可确定其敏感程度。操作程序：把常用的菌株接种在固体琼脂平操作程序：把常用的菌株接种在固体琼脂平板或液体培养基中。用牙签挑取菌体，穿刺板或液体培养基中。用牙签挑取菌体，穿刺受体植物组织中。受体植物组织中。第三节第三节植物基因转化受体系统建立中常遇的问题植物基因转化

218、受体系统建立中常遇的问题一、试管苗的玻璃化现象一、试管苗的玻璃化现象w症状：试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或症状：试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状，植株矮小肿胀，叶片呈浅半透明的水浸状，植株矮小肿胀，叶片呈浅绿色或黄绿色，叶片增厚而狭长，有时基部绿色或黄绿色，叶片增厚而狭长，有时基部较宽，叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易破碎。较宽，叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易破碎。叶表面缺少角质层和蜡质或蜡质发育不全。叶表面缺少角质层和蜡质或蜡质发育不全。茎短、粗、扁平、节间很短或几乎没有节间。茎短、粗、扁平、节间很短或几乎没有节间。生理上的变化：生理上的变化：结构：茎尖分生细胞较小、结构简单，缺结构：

219、茎尖分生细胞较小、结构简单，缺少具正常功能的输导组织，叶片只有海绵少具正常功能的输导组织，叶片只有海绵组织，气孔的保卫细胞功能失调等。组织，气孔的保卫细胞功能失调等。生理生化：细胞含水过多，还原糖、蔗糖、生理生化：细胞含水过多，还原糖、蔗糖、K2+、Ca2+、Cl等含量增高，而木质素、叶等含量增高，而木质素、叶绿素、蛋白质、绿素、蛋白质、Fe3+、Cu2+的含量降低。的含量降低。解决措施：解决措施：(1)利用固体培养基，增加琼脂浓度，造成细胞吸水阻遏；利用固体培养基，增加琼脂浓度，造成细胞吸水阻遏；(2)提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，造成水分胁迫；提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，造成水分

220、胁迫；(3)改变培养基中一些激素浓度和一些元素的含量；改变培养基中一些激素浓度和一些元素的含量；(4)增加自然光照；增加自然光照；(5)控制温度，适当低温处理；控制温度，适当低温处理；(6)改善培养容器内的通风换气条件。改善培养容器内的通风换气条件。二、培养物的褐化二、培养物的褐化褐变机理褐变机理：酶促褐变和非酶促褐变：酶促褐变和非酶促褐变酶促褐变：酶促褐变：PPO酚类氧化物酚类氧化物醌醌+水水非酶促聚合非酶促聚合深色物质深色物质毒害毒害影响因素：影响因素：（1）基因型的影响基因型的影响：不同种植物、同种植物不同：不同种植物、同种植物不同类型、不同品种存在很大差异类型、不同品种存在很大差异；（

221、2）外植体部位及生理状态的影响：幼龄材料）外植体部位及生理状态的影响：幼龄材料、早春或秋季取材早春或秋季取材；（3）培养基成分及培养条件的影响）培养基成分及培养条件的影响：低盐：低盐、激素、激素、低低pH、低、低CO2等；等；（4）材料转移时间的影响材料转移时间的影响：缩短时间。：缩短时间。解决措施：解决措施：（1)外植体的取材；外植体的取材；（2）外植体的预处理：）外植体的预处理：流水冲洗流水冲洗外植体外植体52的冰的冰箱内低温处箱内低温处理理1224h消毒消毒接种在只含有接种在只含有蔗糖的琼脂培蔗糖的琼脂培养基中培养养基中培养57d01漂漂白粉溶液浸白粉溶液浸泡泡10min取出外植体取出外

222、植体接种接种（3）培养基中加入褐变抑制剂和吸附剂：褐变抑制）培养基中加入褐变抑制剂和吸附剂：褐变抑制剂包括抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯剂包括抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（烷酮（PVP）等，吸附剂包括二氧化硫、亚硫酸盐、）等，吸附剂包括二氧化硫、亚硫酸盐、氯化钠等氯化钠等;（4）选择最佳培养基和培养条件：无机盐成分、选择最佳培养基和培养条件：无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、蔗糖浓度、激素水平、pH值及培养基状态、类型、值及培养基状态、类型、光照、温度；光照、温度；（5）多次连续转移培养）多次连续转移培养。三、白化苗的产生三、白化苗的产生产生原因：产生原因：内部因素：供体植

223、株的基因型、花药和花粉内部因素：供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态；本身的状态；外部因素：低温预处理、培养基成分、生长外部因素：低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等，织转分化时间等，解决措施：以小麦花药培养为例解决措施：以小麦花药培养为例（1）采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时期处于）采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗；单核中晚期的幼穗；（2）幼穗）幼穗4低温离体预处理低温离体预处理24h；（3）脱分化培养一般在暗室进行，）脱分化培养一般在暗室进行，29培养培养（4）脱分化培

224、养基用）脱分化培养基用2.0mg/L的的2，4-D与与0.5mg/L的的KT或或6-BA配合使用；配合使用；（5）诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由）诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11%蔗糖蔗糖改为改为9%蔗糖蔗糖+2%麦芽糖；麦芽糖；（6）出愈后提早进行转分化培养。）出愈后提早进行转分化培养。四、试管苗的移栽成活率四、试管苗的移栽成活率保持保持90100的湿度；的湿度；利于气体交换的进行；利于气体交换的进行；移栽时剪掉少量叶片；移栽时剪掉少量叶片；移栽时的基质：珍珠岩和草木灰移栽时的基质：珍珠岩和草木灰2：1；介质、盆钵应预先消毒介质、盆钵应预先消毒。五、影响受体系统转化效率的因

225、素五、影响受体系统转化效率的因素1、农杆菌菌株、农杆菌菌株（1）农杆菌菌株类型）农杆菌菌株类型农杆碱型（琥珀碱型）菌株（如农杆碱型（琥珀碱型）菌株（如A281）胭脂碱型）胭脂碱型菌株（菌株（C58）章鱼碱型菌株）章鱼碱型菌株(Ach5，LBA4404)。（2）农杆菌菌株的侵染活力）农杆菌菌株的侵染活力对数生长期的菌株，即对数生长期的菌株，即0.31.8OD范围（范围（1.0OD1109cells/ml）u2、外植体的类型和生理状态：发育早期（幼、外植体的类型和生理状态：发育早期（幼年期）的组织细胞年期）的组织细胞；u3、外植体的预培养、外植体的预培养：23d，可以促进细胞，可以促进细胞分裂；可

226、以起到驯化的作用；有利于外植体分裂；可以起到驯化的作用；有利于外植体与培养基平整接触与培养基平整接触；4、外植体的接种及共培养外植体的接种及共培养外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。到外植体的侵染转化部位。共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程：一般共培养时间为程：一般共培养时间为3d；采用低盐培养；采用低盐培养基，多数共培养基中能够加入基，多数共培养基中能够加入AS和单糖类和单糖类化学诱导物，并加入较高含量的生长素类化学诱导物，并加入较高含量的生长素类（如（如2，4-D）激素。）激素。接种时间为接

227、种时间为130min，接种菌液浓度为，接种菌液浓度为0.31.5OD外植体种类外植体种类接种时间接种时间/min接种菌液浓度接种菌液浓度/OD小麦未成熟胚和胚小麦未成熟胚和胚性愈伤组织性愈伤组织600.51.0水稻胚性愈伤组织水稻胚性愈伤组织151.01.5玉米未成熟胚玉米未成熟胚101.0棉花下胚轴棉花下胚轴130.30.6大豆子叶节大豆子叶节10300.30.65、转化细胞的选择培养和转化植株再生、转化细胞的选择培养和转化植株再生（1）转化细胞的选择：一种是植株先再生后进行）转化细胞的选择：一种是植株先再生后进行选择，其弊端是嵌合体严重，假转化体多，后期选择，其弊端是嵌合体严重，假转化体多

228、，后期选择困难；另一种是先选择后再生，即在转化后选择困难；另一种是先选择后再生，即在转化后愈伤组织诱导或不定芽分化培养时就进行选择，愈伤组织诱导或不定芽分化培养时就进行选择，这种方法所获得的再生植株嵌合体少，假转化体这种方法所获得的再生植株嵌合体少，假转化体比例低。比例低。（2）转化植株再生。）转化植株再生。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型第二节第二节 试管保存试管保存第三节第三节 超低温保存超低温保存 本章主要介绍植物种质离体保存的类型与特点、离体保存方法的原理与程序。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 知识目标：知识

229、目标：了解种质资源在育种中的地位了解植物种质离体保存的类型与特点掌握离体保存方法的原理与程序了解超低温保存的特点与方法能力目标能力目标：能掌握植物种质超低温保存技术第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型一、概念种 质：是决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。种 质 库：是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体的不同基因所组成。又称基因库。种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统称为种质资源或遗传资源。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型二、种质保存

230、的意义 随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型三、种质保存的方法按照保存的具体方法 , 品种资源的保存可分为：种植保存藏贮保存试管保存基因文库保存。 第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型1、 种植保存 为

231、了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力 , 并不断补充其数量 , 品种资源材抖须每隔一定时间播种一次 , 即种植保存。2、 贮藏保存 用控制贮藏条件 ( 主要是温度和湿度 ) 的方法 , 来保持品种资源种子的生活力。 长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥 , 通过控制种子周围环境中的温湿度 , 迫使种子处于代谢作用的最低限度。 贮藏保存种质资源采用种质库 , 种质库分三种：长期库、中期库和短期库。 第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第一节第一节 植物种质资源保存类型植物种质资源保存类型3基因文库保存 利用DNA重组技术，将种质材料的总DNA或染色体所有片断随机连接到载体上

232、，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个DNA片断的克隆系。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第二节第二节 试管保存试管保存一、常温下试管保存一、常温下试管保存 可利用试管苗继代培养保存，但需要经常更换培养基。二、常温抑制生长保存二、常温抑制生长保存为了延缓继代时间，可在培养基中添加长抑制剂或提高渗透压等。低温调控生长保存低温调控生长保存在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。一般植物可调到19，热带亚热带植物调至1020。四、常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合四、常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合 培养基中添加生长抑制剂或提高渗透压，培

233、养温度降低，使继代时间延长。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 一、超低温保存的基本原理和主要环节 在液氮中（-196），几乎所有的细胞代谢活动停止，仅保存细胞的活力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。 超低温保存比较复杂，哪一步操作不当，都会使细胞受伤害，失去再生能力。 注：超低温通常指低于一 80 的低温，保存介质或容器有干冰(一 79)、超低温冰箱(-80-150 )、液氮(-196)和液氮蒸气相(-140)等，其中液氮最常用。 第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术(一)超

234、低温保存主要步骤:1、保存材料的选择 花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。2、冷冻前材料预处理 为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处理。 预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸，在接近零度下培养数日。 第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术3、添加冷冻防护剂 为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。常用的冷冻防护剂有：二甲基亚砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。 4、材料冷冻的方法材料冷冻保存的原理：冷冻时，细胞外的溶液水分子，

235、先形成冰晶中心，而冰晶形成的速度与溶液成分、降温速度有关。一般在-20-60范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到-140时完全停止增长。 第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术冷冻处理方法（1）快速冷冻将植物材料从0 或者其它预处理温度直接投入液氮中保存的方法。降温速度为1000 /min。植物体内的水分在降温冷冻过程中，从-10-140范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到-140时完全停止增长，关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，不能形成致死的冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。第八章植物种质资源

236、的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术冷冻处理（2）慢速冷冻法 将植物材料从0 或者其它预处理温度以降温速度为12 /min从起始温度降到-100 ，稳定1h后投入液氮中保存或以此降温速度降至-196 。 在这种降温速度下，细胞内水分有充分的时间不断渗入到细胞外结冰，使细胞内水分减少到最底限度，避免细胞内结冰第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术冷冻处理（3）预冷冻法投入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法两步冷冻：慢速冷冻至-40 ，停留一段时间，快速冷冻。 逐级冷冻：材料通过不同温度等级

237、降温至-40 ，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。 （4）干燥冷冻将材料置于2729 烘箱内降低植物含水量，在投入液氮中保存。此法可以防止材料冻死。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术5材料保存 -196液氮冰箱中或液氮罐中保存。 6保存材料解冻 解冻速度是解冻技术关键，一般在37的热水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。 （1）快速解冻法 保存材料直接投入到3740 水浴中进行解冻的方法。-50-10 是再结冰的温度区 （2）慢速解冻 先置于0 解冻，在逐渐升温至室温。可以

238、使水分慢慢渗入细胞内。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术7保存材料复苏培养 保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。 然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再生植株。第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 第三节第三节 超低温保存超低温保存 二、超低温保存技术(二) 影响超低温保存效果的主要因素及调控措施。 1材料的基本特性2预培养和低温锻炼3冰冻保护剂的应用4化冻方法5再培养第八章植物种质资源的保存植物种质资源的保存 复习思考题复习思考题1植物离体超低温保存的概念。2植物材料超低温保存的细胞

239、学基础。3超低温保存的方法及其技术要点。4影响超低温保存效果的主要因素及调控措施。第三章、细胞工程实验室设置与基本技术第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第一节 动物细胞体外培养的设备器具与体外培养用液第二节 动物细胞的体外培养生长特征第三节 细胞培养的基本方法与过程动物细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。培养所用的设备器具除与微生物细胞、植物细胞培养所需的常规设备器具外，还有其需要的特殊设备器具。其分离培养的技术方法也与微生物细胞、植物细胞培养有较大的差别，因此本章主要介绍细胞培养所需的主要设备仪器、器具以及细胞培养的基本原理及技术，并

240、进一步列举了几类常见细胞的分离培养方法。第四节 几种常见动物细胞培养第一节动物细胞体外培养的设备器具与体外培养用液 详见第三章 一、体外细胞培养所用器具的无菌处理体外细胞培养所用器具的无菌处理 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术二、体外培养用液体外培养用液 水：细胞培养用水必须经过23次玻璃器皿蒸馏或者用离子交换树脂处理的水 平衡盐溶液：主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第九章 动物细胞培养的基本知识与技术配液时的注意事项1需用新鲜的三蒸水或去离

241、子水，按规定的先后顺序配制，称量要准确，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等，切勿搞错。2物质的纯度 纯度高的物质配制成的溶液质量高，因此在配液选用时要注意。常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种类型。3物质的可溶性 很多用于培养用液的化学物质都很难溶解，在配制时必须设法使其溶解。如磷酸钙在碱性溶液中几乎难于溶解，因此在制备磷酸缓冲液时，需将CaCl2及磷酸氢二钠单溶后再混合，临时用NaHCO3调pH至弱碱性，以避免沉淀析出。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术4物质的不稳定性 不少物质性质不稳定，高温高压下易破坏。如葡萄糖只能在115下维持1520分钟，若超温葡萄

242、糖就会破坏。5贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术1pH调节液（1）碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌或高压蒸气灭菌，分装小瓶中，密封，4冰箱保存。市售有5%10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液调节之。（2）Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为1015mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH

243、至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4冰箱保存。或直接购买市售成 品。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术2.消化液：（1）胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如前面的D-Hanks），因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后可以再调至pH7.5，也可不调。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术1和025胰蛋白酶溶液的配制方法： 将

244、DHanks液用56NaHC03调至PH7.2左右。 称取胰酶粉末l克于烧杯中，选用少许平衡盐溶液调成糊状，再补足至100mL，搅拌均匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。 选用滤纸过滤，再用滤器滤过除菌，分装小瓶，置低温冰箱保存备用。 临用时将其用DHanks液稀释成025的胰蛋白酶溶液第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（2）EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。 第九章 动物细胞培养的基

245、本知识与技术（3）胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术3抗生素溶液 为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100g 。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术三、培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基天然培养基天然培养基有血清、血浆、和

246、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、

247、铁蛋白等）多种金属离子激素促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞第九章 动物细胞培养的基本知识与技术无血清培养基的主要研制策略：在基础

248、培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。

249、 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟血清的消毒：过滤除菌第九章 动物细胞培养的基本知识与技术完全培养基的组成：完全培养基的组成：基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100卑位毫升第九章 动物细胞培养的基本知识与技术配制方法： 在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5的双

250、蒸水。 在室温（20到30）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。 水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。 加NaHCO3到培养基中。 用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3。培养基在过滤前要保持密封。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第二节动物细胞的体外培养生长特征 一、贴附生长1、贴壁依赖型细胞该类细胞生长时，需要附着于某些适量电荷的固体或半固体的支持物表面，细胞依靠自身分泌

251、的或培养液提供的粘附因子，在支持物表面贴附伸展，生长繁殖。大多数细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞，都属于这一类型。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术2、贴壁非依赖型细胞这类细胞无需贴附于支持物表面，可在培养液中悬浮生长，细胞呈球形。例如，杂交瘤细胞（hybridomacell）、血液内的淋巴细胞和某些产生干扰素的转化细胞，如Namalwa细胞等。细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大，生长时间长,能繁殖出大量细胞，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术3、兼性贴壁细胞这类细胞既可以贴附于支持物表面上生长，但在一定条件

252、上，也可在培养液中悬浮生长。如常用的中国仓鼠卵巢（Chinesehamsterovary，CHO）细胞，小鼠L929细胞。当它们贴附于支持物表面上生长时，呈上皮或成纤维形态；悬浮于培养液中时，则呈球形。同时细胞也可相互支持贴附在一起生长。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术二、生长的接触抑制及密度依赖性二、生长的接触抑制及密度依赖性 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞都需要在一定的基质上贴附和伸展后才能生长增殖。细胞在基质表面的贴附机制与电荷和钙镁离子的作用，以及许多粘附因子如胶原、纤维结合蛋白的作用有关。当细胞在基质表面分裂增殖，并与邻细胞相互接触逐渐融合成片时，细胞即停止增殖。此时

253、，若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再增加。该现象又称为接触抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，此现象随之消失，细胞可多层生长，细胞密度可明显增加。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第三节 细胞培养的基本方法与过程 一、原代培养基本原理一、原代培养基本原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 二、原代培养步骤二、原代培养步骤（一）取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细

254、胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，取材的基本要求和注意事项如下：（1）取材要注意新鲜和保鲜（2）取材应严格无菌第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（6）原代细胞取材时要同

255、时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（二）细胞分离技术1悬浮细胞的分离方法2实体组织材料的分离方法 （1）机械分散法（2）消化分离法 酶消化分离法：常采用胰蛋白酶和胶原酶，此外，链霉蛋白酶、胃胶原酶、透明质酸酶、粘蛋白酶、蜗牛酶和分散酶(dispase)都可作为消化液，但价格昂贵，保存困难，故较少使用，只在获取某类特殊细胞情况下使用。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术非酶消化法（EDTA消化法）EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配

256、成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（三）原代细胞的培养方法1组织块培养法第九章 动物细胞培养的基本知识与技术2消化培养法第九章 动物细胞培养的基本知识与技术3悬浮细胞培养法第九章 动物细胞培养的基本知识与技术三、细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有

257、3种。1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术2半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术贴壁生长细胞传代方法：1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3

258、吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7将后者放入培养箱中培养。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术四、细胞的纯化和克隆四、细胞的纯化和克隆（一）细胞的纯化细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。（二）细胞的克隆化细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体

259、称为细胞株。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术具体克隆方法如下：1毛细管法2有限稀释法3平皿克隆分离法4软琼脂克隆分离法 5单细胞显微操作法第九章 动物细胞培养的基本知识与技术五、细胞的冻存与复苏五、细胞的冻存与复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术 有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分如下： 包含10甘油的完全培养基， 包含10二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基， 包含5 0 细胞条件培养基和50含有10甘油的新鲜培养基，或 50 细胞条件培养基和50

260、含有10二甲基亚砜的新鲜培养基。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术以1107到5107细胞/mL密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5107到1107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。 分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。 细胞以1/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70到-90的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术细胞复苏方法：（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分

261、钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术六、细胞计数及活力测定（一）细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（二）培养细胞活力测定苔盼蓝染色：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力四唑盐（MTT）比色法：四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正

262、比。再用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验。操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果。第九章 动物细胞培养的基本知识与技术七、细胞的分裂指数测定七、细胞的分裂指数测定体外培养细胞生

263、长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术八、细胞周期的测定八、细胞周期的测定细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术九、细胞培养的污染和检测九、细胞培养的污染和检测细

264、胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（一）污染途径1空气2器材3操作4血清5组织样本第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（二）污染对培养细胞的影响及污染的检测 1细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 3支原体污染对细胞影响及污染物的检测 4细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（三）污染的预防1器皿准备中的预防2开始操作前的预防。 3过程中的预防4其他预防第九章 动物细胞培养的基本知识与技术（四）污染的排除1抗生素排除法2加温除菌3动物体内接种4与巨噬细胞共培养第九章 动物细胞培养的基本知识与技术第四节第四节 几种常见动物细胞培养几种常见动物细胞培养一、上皮类细胞培养二、结缔组织类细胞培养三、肌组织类细胞的培养四、人胚肾细胞的培养五、神经组织细胞培养六、神经胶质细胞培养七、肿瘤细胞的培养第九章 动物细胞培养的基本知识与技术