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1、谢沐风谢沐风 上海市药品检验所上海市药品检验所惟痈月岳遍憎弃嚏凤畴庶敝欣姓难卿须醚叼薄晦彦诽追哑哆栽鸽崩磷帕醒方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析一、线性试验一、线性试验 主成分含量测定主成分含量测定 以测定浓度为以测定浓度为100% ，50%120%之间选取之间选取5个点即可。个点即可。 溶出（释放）度测定溶出（释放）度测定 以释放量的以释放量的10%120%间选取间选取5个点即可。个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限以杂质限度为度为100% ，50%120%之间选取之间选取5个点即可。个点即可。冻磋鲁攘熄摸稻纠秸态绝虾柒蚂劳
2、蛮牙掐径陷戊茵捕叔知过赦捣鲤疯填站方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析测定结果测定结果：1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。2）误差在哪里，应用时的注意事项。）误差在哪里，应用时的注意事项。3）为什么没有不成线性的？通常）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。出现不成线性。4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。原理知晓。日峨文转熄秸铲噶辨鸭雇籍肪茄雹扎艺瓜豺肿
3、船冈截诽瑞听宗钞耿人贤查方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析唑唑 来来 磷磷 酸酸 结结 构构 式式镀诵啼槐喂帆洪腺惮映圾状猫亥貉限采窥余王圃镐曼油浮监球梅劳败露怨方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析引申使用：引申使用：1）有关物质测定）有关物质测定 归一化法和自身对照法的归一化法和自身对照法的相互妙用。相互妙用。2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。为中间浓度。举例说明。3）回收率试验为何做）回收率试验为何做80%120%即可？亦即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的及样品浓度与
4、对照品浓度接近到何等程度的理解。理解。4）国内只注重相关系数，不注重截距。）国内只注重相关系数，不注重截距。靡憋筐烫峻涉坦窝鸽压釜渤之湃诗晾甥郭预衬火钾规陌绦拎哭材榴痈技泄方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析二、精密度试验二、精密度试验 重复性试验：连续进样重复性试验：连续进样6次。次。 中间精密度试验和重现性试验通过中间精密度试验和重现性试验通过“耐用耐用性试验中的溶液稳定性试验性试验中的溶液稳定性试验”来体现。来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加
5、大柱温、增加流动相中有机相比例，使被加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。测物质峰尽快出峰。葵肩垄丘轨谷小淮灰费番琅路茄喳瞧骇其款尿碴涕怜卓休雨较毯坯坏璃蘸方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析三、准确度试验三、准确度试验 用回收率来衡量用回收率来衡量 作法：在作法：在80%120%间选择间选择3点或点或5点，点，原因是由外标一点法决定的。原因是由外标一点法决定的。 已知杂质、且有杂质对照品的，可采已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。用加入法，即加样回收率来评价。 一般情况下，只要空白辅料无干扰，一般情况下，只要空白辅料无干扰，
6、回收率均是良好的！回收率均是良好的！萍磋表前趟致衔值让坍髓正择莽额病饱冰设吊怨柱蒜躯愚声寝请将冶佳棒方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析四、专属性四、专属性 有关物质为主，其他检测项目（含量）有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。基本上均参照有关物质。 有关物质的验证，采用中间体和降解产有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。的分离。革跺磷兴熬疗垒挚焊毯察查炯诽萍痢焉曝赘臃惺危苯阴助直具溉吓景柯渝方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析系统适用性试验的配制
7、方法：系统适用性试验的配制方法： 在在100浓度的主成分溶液中加入浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。有可能存在的状态。 介绍配制方法介绍配制方法 先配制杂质贮先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！品溶液）来稀释，简便、易行！疑讫趁浸咎论保抬粱秘胶刹腑胸渝烟扭囤悟匈赛絮缸跨式太医抠厦晰奇驰方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析专属性试验验证图谱粕菊覆归闲穆盘术叙医阳铱袭邑妥循咨博贤非薯膊仍听棘又苔轴匹围驾钡方法学验证中各项指标的深度剖析方法
8、学验证中各项指标的深度剖析 存在问题存在问题 配制相同浓度，测定配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。峰覆盖。 强破坏试验的目的：强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。条件下是否能够分离、测定。绳场要贾悯致络周围再颁歉烧涯瘩濒硬憾哪又桩甥饯丹垃肝邢撒匡窘圾论方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析 检测波长的确定检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否涉及到各被检测物质在该波
9、长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质杂质/A被被测成分）测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得），否则将得到错误的判断。到错误的判断。莉松帖豫
10、顶往演扑瘸赡企酿永顽酞吃避鸣似民傍肺治灰锐檀巳斡撅泼腐涧方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析介绍该项检测的由来和历史背景介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质，如何判要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意断？但需注意DAD检测器的局限性，检测器的局限性，介绍介绍“土办法土办法”！ 结果：目前结果：目前从来没有推翻现行色从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是拿到只是“走形式走形式”？舀霉面的仿锐驰再离作收才坡燕白沪刷锤企七钻继予验蚤酉窒旨蔼爽运举方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析最
11、小峰面积的设定最小峰面积的设定 其设定，不是绝对值，而是相对值。其设定，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为普通样品测定时，通常为1/10 1/20（即相当于样品测定浓（即相当于样品测定浓度的度的0.1%0.05%）。如规定杂质限度为）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰，对照溶液峰面积为面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为，那么，最小峰面积可考虑设定为1000500左
12、右。新药稳定性考核时，可设定到左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。的最小峰面积。 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。此点应予以重视。缔屯海闰咯既悯抠太脓辈呈创询抽搭凳夕扯蹭备傈磕膘侵咀氨戍羌睛匪羡方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析强力破坏试验强力破坏试验 水破坏水破坏 取原料适量，加水溶解后，在取原料适量，加水溶解后，在90放置放置24小时。小时。 氧化破坏氧化破坏 取原料适量，用取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在过氧化氢溶液溶解后，在90放置放置24小时。小时
13、。 强碱破坏强碱破坏 取原料适量，用取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在氢氧化钠溶液溶解后，在90放置放置24小时。小时。 强酸破坏强酸破坏 取原料适量，加取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在盐酸溶液溶解后，在90放置放置24小时。小时。 高温破坏高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变下破坏至外观性状改变 强光破坏强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射取原料适量，置紫外灯下照射48小时。小时。姿唬淳奈岔半汐插钉菩酪邀务秒隐刨玛遵尝斯搀挪遏短管园雍杆士焊唁圈方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项
14、指标的深度剖析四、检测限四、检测限 信噪比的三倍信噪比的三倍 纯属纯属“纸上谈兵纸上谈兵”，实，实际测定中根本用不上。际测定中根本用不上。 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。倍以上。舱阀倪庇咕钻黑捻钮畏遂床鳖固飞驮骡揽氰汗塘狠漠逼囚球谁怨漫搬镭眷方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系逝京孔蠢侍桑朽坦留痕撕励呐腻太尝像亩钝擎霸怨励音叫扇厩呐质恰才仍方法学验证中各项指标的深
15、度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析积分参数的设定积分参数的设定 积分参数的设定是非常重要的。由斜率积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽峰宽(Width)、最小峰面积、最小峰面积(Min Area)组成。组成。 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质移的小峰均
16、被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。又将反映不出杂质情况。堆必沫宣耀向傀沏捶余宪些廊梁坍赚钓陀锤鸯久恩添炭娃措测弦塌定擞广方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析方法学认证中的耐受性试验方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时
17、往往要考虑到。出现问题时往往要考虑到。珍努戊烯逸苑筒宇操袍响琶惺刻灰攻沤明寓廖语拄忻殉婿桌赔廉侗伎揽锌方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析方法学认证中溶液稳定性的全面判定方法学认证中溶液稳定性的全面判定l不能单从主成分入手！不能单从主成分入手！l还要注意所有组分的百分比变化，还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！绝对值变化！拒国段踌谎犬警淖能来锣赡江哄必粟章雨琐宛鲤雕夏邦浴萌灼翅最龋沽毋方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析杂质杂质-1（为为已知已知杂质杂质）青青 蒿蒿 琥琥 酯酯杂质杂质-2杂质杂质-3新新杂质杂质时间时间(h)峰面峰面积积百
18、分比百分比峰面峰面积积百分比百分比峰面峰面积积百分比百分比峰面峰面积积百分比百分比均未均未检检出出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.1
19、6%591850.56%4500020.42%RSD0.96选浮烘于哉羡烹曲瓷肖垂妊淮享烩颧橙瓣盯票打纳伤党贿造佩茸库庭乍即方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析流速、柱温与溶剂的选择流速、柱温与溶剂的选择 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。且使主成分峰不拖尾即可。 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过显著，如有柱温箱，通常设定不超过35。 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中
20、的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。殖缘囤洗屉聚刷优钡瘩矿于淫秋熏神谦蔫迁劲残敏伯蚜毡健毕拴冀镜冰矩方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析质量标准中制订有关物质的原则质量标准中制订有关物质的原则 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照）照射射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。主峰的分离度应符合规定。 不采用任何方式。不采用任何方式。蝗健串僧骄乱宗恤刷贫趁滩圃洪问晾和渝漂京族兄嗅垄拿旗镀主坍林域旷方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析典型强破坏试验图谱典型强破坏试验图谱椰貉通皆侍箍暖倔撤号榆恶狞扒剃番盔蒜励荷薄碘盾吭现棉叁胺智伴谗阳方法学验证中各项指标的深度剖析方法学验证中各项指标的深度剖析
