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1、太湖水体中藻蓝蛋白的紫外太湖水体中藻蓝蛋白的紫外太湖水体中藻蓝蛋白的紫外太湖水体中藻蓝蛋白的紫外- -可见可见可见可见吸收光谱特征分析吸收光谱特征分析吸收光谱特征分析吸收光谱特征分析01020304结论与讨论结论与讨论结论与讨论结论与讨论实验部分实验部分实验部分实验部分简述简述简述简述光谱特征光谱特征光谱特征光谱特征 紫外紫外-可见分光光度法（可见分光光度法（UV-vis）是目前世界上）是目前世界上历史最悠、使用最多、覆盖面最广的分析方法之一。它历史最悠、使用最多、覆盖面最广的分析方法之一。它已在生命科学、材料科学、环境科学、农业科学、计量已在生命科学、材料科学、环境科学、农业科学、计量科学、
2、食品科学、医疗卫生、化学化工等各个领域的科科学、食品科学、医疗卫生、化学化工等各个领域的科研、生产、教学等工作中得到了非常广泛的应用。它可研、生产、教学等工作中得到了非常广泛的应用。它可作定性定量分析、纯度分析、结构分析；特别在定量分作定性定量分析、纯度分析、结构分析；特别在定量分析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析方法析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析方法。简述简述简述简述 藻蓝蛋白藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）是藻类进行光是藻类进行光合作用的重要辅光色素蛋白之一，由藻蓝胆素合作用的重要辅光色素蛋白之一，由藻蓝胆素（PCB）和脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯）和脱辅
3、基蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯基构成，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的基构成，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的藻胆体中。在环境监测中，特别是蓝藻水华频发的藻胆体中。在环境监测中，特别是蓝藻水华频发的水域，藻蓝蛋白浓度能较好地表征蓝藻生物量，是水域，藻蓝蛋白浓度能较好地表征蓝藻生物量，是水体富营养化及蓝藻水华监测重点关注的指标。紫水体富营养化及蓝藻水华监测重点关注的指标。紫外外-可见分光光度法是藻蓝蛋白浓度定量分析的常可见分光光度法是藻蓝蛋白浓度定量分析的常用方法，其主要依据是藻蓝蛋白用方法，其主要依据是藻蓝蛋白500500700nm700nm的吸收的吸收光谱特性。光谱特性。 由于藻蓝蛋
4、白为胞内蛋白，提纯工艺复杂，当前由于藻蓝蛋白为胞内蛋白，提纯工艺复杂，当前环境监测研究中藻蓝蛋白的提取多以反复冻融、超声环境监测研究中藻蓝蛋白的提取多以反复冻融、超声破碎、化学溶胀等细胞破碎方法为主，藻蓝蛋白浓度破碎、化学溶胀等细胞破碎方法为主，藻蓝蛋白浓度的计算主要沿用的计算主要沿用Bennett、abelson等学者基于单一等学者基于单一藻种纯化光谱建立的经验公式。然而，反复冻融等提藻种纯化光谱建立的经验公式。然而，反复冻融等提取结果的纯化程度不高，获取的藻蓝蛋白吸收光谱常取结果的纯化程度不高，获取的藻蓝蛋白吸收光谱常常受到其他物质组分的影响而与经过硫酸铵盐析、柱常受到其他物质组分的影响而
5、与经过硫酸铵盐析、柱色谱层析分离的纯化光谱存在差异。吸收光谱是藻蓝色谱层析分离的纯化光谱存在差异。吸收光谱是藻蓝蛋白结构分析、浓度定量计算的基础，对内陆湖泊水蛋白结构分析、浓度定量计算的基础，对内陆湖泊水色遥感反演研究也具有重要意义。色遥感反演研究也具有重要意义。样品采集样品采集1实验方法实验方法2实验部分实验部分 样品采集样品采集 于于2011年年5月月19日、日、7月月30日、日、8月月20日、日、9月月3日、日、11月月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采集日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采集75个水样用于实验分析。个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水
6、生生铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻、的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻、鱼腥藻样品进行实验。鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国）购自美国sigma公司，公司，提纯于螺旋藻。提纯于螺旋藻。 方法方法太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提取使用反复冻融法。首先用取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜玻璃纤维滤膜过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中，
7、过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中，同时加入同时加入0.05mol L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱磷酸盐缓冲液于低温冰箱冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融次。冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融次。解冻的样品以解冻的样品以12000rmin-1-1速度离心速度离心10min，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓冲取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓冲液作为空白对照，使用岛津液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。分光光度计测量吸光度。 对于标准品的配置和测量，对于标准品的配置和测量，sigma公司生产的藻公司生产的藻蓝蛋白标准品蓝蛋白标准品0.5m
8、g，加人，加人25mL磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液使其成为使其成为20mgL-1的标准溶液贮备液，装入棕的标准溶液贮备液，装入棕色瓶中，于色瓶中，于4保存。实验分析时将标准液取出保存。实验分析时将标准液取出并配制为并配制为10mgL-1的标准应用液。以磷酸盐缓的标准应用液。以磷酸盐缓冲液作为空白对照测量吸光度。参照张运林方冲液作为空白对照测量吸光度。参照张运林方法，通过法，通过 GF/F玻璃纤维滤膜过滤水样、测量滤玻璃纤维滤膜过滤水样、测量滤液吸光度，获取有色可溶性有机物（液吸光度，获取有色可溶性有机物（CDOM）的吸收数据，对藻蓝蛋白吸收光谱特征进行辅的吸收数据，对藻蓝蛋白吸收光谱特征进行辅助分
9、析。助分析。藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征01单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征02太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征03光谱特征光谱特征光谱特征光谱特征 由由图可知，藻可知，藻蓝蛋白蛋白标准品准品250800nm紫外紫外-可可见光范光范围共有三个吸收共有三个吸收谱带：250300,300450和和500700。主吸收峰位于。主吸收峰位于620
10、nm，由藻，由藻蓝胆素中的胆素中的四吡咯四吡咯环引起，引起，为藻藻蓝蛋白的特有吸收特征。蛋白的特有吸收特征。250300nm的吸收峰出的吸收峰出现在在278nm处，源于蛋白中，源于蛋白中芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。300450nm的吸收峰位于的吸收峰位于345nm，主要由蛋白中二，主要由蛋白中二硫硫键的吸收引起。的吸收引起。标准品的准品的278，345和和620nm的峰的峰值比比约为2:1:5。图2中，中，铜绿微囊藻、微囊藻、鱼腥藻藻腥藻藻蓝蛋白吸收光蛋白吸收光谱在与在与标准品准品对应的三个的三个谱带上有上有类似的吸收峰。由于藻种似的
11、吸收峰。由于藻种差异和提取差异和提取纯度的影响，度的影响，单一藻种的吸收峰出一藻种的吸收峰出现位置位置和峰和峰值比与比与标准品存在差异。准品存在差异。铜绿微囊藻藻微囊藻藻蓝蛋白的蛋白的三个吸收峰位于三个吸收峰位于255，336，619nm，峰，峰值比比约为7:3:4；鱼腥藻腥藻则出出现在在259，340，614nm，峰，峰值比比约为5：1:3。此外，。此外，铜绿微囊藻和微囊藻和鱼腥藻腥藻300450nm 的吸的吸收收谱型不同。型不同。铜绿微囊藻微囊藻300350nm出出现吸收峰，吸收峰，350450nm的吸光度的吸光度值递减；减；鱼腥藻腥藻340nm峰两端的峰两端的吸光度吸光度值递减，但峰型不
12、减，但峰型不对称。称。根据待根据待测溶液溶液500700的吸收峰个数，可将太湖水的吸收峰个数，可将太湖水体中藻体中藻蓝蛋白的吸收光蛋白的吸收光谱划分划分为无峰型、无峰型、单峰型、峰型、双峰型三双峰型三类（图）。各吸收）。各吸收谱类型包括的型包括的样点点数量和日期数量和日期见表。表。第一第一类是无峰型，即是无峰型，即500700nm间变化平化平缓，620nm附近未附近未检测到藻到藻蓝蛋白的吸收特征。推蛋白的吸收特征。推测其原因是其原因是该光光谱形形态的水的水样多采集于春、秋季多采集于春、秋季（表（表1），水），水样中浮游藻中浮游藻类生物量小、生物量小、蓝藻所占藻所占比例低，致使待比例低，致使待测
13、溶液的藻溶液的藻蓝蛋白含量微少蛋白含量微少难以以检出。根据出。根据300450nm的吸收差异，无峰型又可的吸收差异，无峰型又可划分划分为无峰无峰和无峰和无峰两个两个亚类。无峰。无峰仅260nm附附近出近出现吸收峰，吸收峰，250800nm的的谱型更接近于水型更接近于水样的的CDOM吸收吸收谱（图4）。无峰）。无峰在在260和和330nm处均具吸收峰，均具吸收峰，说明待明待测溶液中其他可溶性蛋白溶液中其他可溶性蛋白的含量的含量较高。高。第二第二类为单峰型，峰型，620nm附近出附近出现藻藻蓝蛋白的特征蛋白的特征吸收峰，光吸收峰，光谱形形态与与标准品、准品、铜绿微囊藻、微囊藻、鱼腥藻腥藻接近。但是
14、由于藻种差异和提取接近。但是由于藻种差异和提取纯度的影响，吸收度的影响，吸收峰的位置和峰峰的位置和峰值比与比与标准品、准品、单一藻种不同。一藻种不同。单峰峰型光型光谱的主吸收峰出的主吸收峰出现在在260nm附近，次吸收峰位附近，次吸收峰位于于330nm左右，左右，260，330，620nm的平均峰的平均峰值比比约为11:4:1。单峰型光峰型光谱300450nm的吸收的吸收谱型与型与铜绿微囊藻接近：微囊藻接近：300350nm 出出现吸收峰，吸收峰，300450nm的吸光度的吸光度值递减。减。第三第三类为双峰型，即在双峰型，即在620nm 藻藻蓝蛋白特征吸收蛋白特征吸收峰的右峰的右侧约670nm
15、处出出现了另一个吸收峰，同了另一个吸收峰，同时在在300450nm出出现吸收肩。按照吸光度的高低吸收肩。按照吸光度的高低顺序，双峰型光序，双峰型光谱的主吸收峰出的主吸收峰出现在在260nm附近，附近，次吸收峰位于次吸收峰位于330nm左右，三个吸收峰左右，三个吸收峰260，330，620nm的平均峰的平均峰值比比约为10:5:1。从。从图1来看，来看，双峰型光双峰型光谱670nm附近的吸收附近的吸收谱带与藻与藻蓝蛋白、蛋白、别藻藻蓝蛋白的吸收具有重叠。蛋白的吸收具有重叠。太湖藻太湖藻蓝蛋白的主吸收峰出蛋白的主吸收峰出现在在260nm附近，紫附近，紫外波段至外波段至蓝波段的吸光度波段的吸光度值呈
16、呈现衰减（衰减（图3），与），与标准品（准品（图1）和）和Bennett、abelson研究中的研究中的纯化化光光谱不同。究其原因是受待不同。究其原因是受待测溶液中其他含苯丙溶液中其他含苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的可溶性蛋白影响。氨酸、色氨酸、酪氨酸的可溶性蛋白影响。蓝藻藻细胞由众多可溶性蛋白构成，藻胞由众多可溶性蛋白构成，藻蓝蛋白、蛋白、别藻藻蓝蛋白等藻胆蛋白蛋白等藻胆蛋白约占占蓝藻可溶性蛋白的藻可溶性蛋白的4060。研究中使用的反复研究中使用的反复冻融法是水融法是水环境境监测中常用的中常用的藻藻蓝蛋白提取方法，能有效地破碎藻体蛋白提取方法，能有效地破碎藻体细胞，使胞，使藻胆体内的藻藻胆体内的
17、藻蓝蛋白溶出。但其分离、蛋白溶出。但其分离、纯化能力化能力有限，不足以将藻有限，不足以将藻蓝蛋白与其他可溶性蛋白分离蛋白与其他可溶性蛋白分离完全。完全。 根据水根据水样的的 CDOM 吸收数据吸收数据(图4)，太湖藻，太湖藻蓝蛋白紫外波段至蛋白紫外波段至蓝波段的吸收波段的吸收还可能受到可能受到CDOM 的影响的影响.CDOM 是由富里酸、腐是由富里酸、腐殖酸、芳殖酸、芳烃聚合物等一系列物聚合物等一系列物质组成的水溶性物成的水溶性物质，由藻，由藻类、细菌、水生植物等有机体的降解菌、水生植物等有机体的降解产生，在紫外和生，在紫外和蓝光区具有光区具有强强吸收。吸收。本研究采用本研究采用滤膜膜过滤方式
18、分离藻体，而方式分离藻体，而CDOM 存在于存在于过滤除去除去的水的水样中。但是，反复中。但是，反复冻融法属于机械破碎，在藻融法属于机械破碎，在藻蓝蛋白提取的蛋白提取的同同时会形成大量有机碎屑。会形成大量有机碎屑。这些有机碎屑在多次的反复些有机碎屑在多次的反复冻融提取融提取中会慢慢腐中会慢慢腐烂分解，分解，释放出放出CDOM 。图3(a)中中,太湖无峰太湖无峰型光型光谱在在300450nm未未观测到蛋白中二硫到蛋白中二硫键的吸收峰，的吸收峰，250800nm 的的 吸吸 收收 谱 型型 与与 标 准准 品品 不不 同同 而而 接接 近近 于于CDOM ,进一步一步说明反复明反复冻融法提取的藻融
19、法提取的藻蓝蛋白溶液中存在蛋白溶液中存在CDOM组分；并且分；并且对于无峰于无峰而而言，言，CDOM 的吸收可能掩盖了二硫的吸收可能掩盖了二硫键300450nm的吸收信息。的吸收信息。 由由图2和和图3可知，太湖水体藻可知，太湖水体藻蓝蛋白吸收光蛋白吸收光谱的次吸收的次吸收峰位于峰位于330nm左右，左右，单一藻种一藻种则出出现在在620nm附近。附近。产生生该差异的原因可能有以下两种：一是太湖水体中藻体多以差异的原因可能有以下两种：一是太湖水体中藻体多以群体群体态形式聚集并形成包裹体，包裹体表面附有由果胶酸、形式聚集并形成包裹体，包裹体表面附有由果胶酸、粘多糖等构成的群体胶鞘。群体胶鞘粘多糖
20、等构成的群体胶鞘。群体胶鞘类似于藻体似于藻体细胞外壳，胞外壳，其存在会增加藻其存在会增加藻蓝蛋白提取的蛋白提取的难度，使得太湖藻度，使得太湖藻蓝蛋白待蛋白待测溶液的提取溶液的提取纯度低于度低于单一藻种。第二种可能是受到其他一藻种。第二种可能是受到其他非非蓝藻藻门藻种的影响。太湖是多藻种共存的湖泊水体，水藻种的影响。太湖是多藻种共存的湖泊水体，水体中除了体中除了蓝藻外，藻外，还会存在会存在诸如斜生如斜生栅藻、梅尼小藻、梅尼小环藻等藻等的其他非的其他非蓝藻藻门藻种。藻种。这些非些非蓝藻藻门藻种藻种虽不含藻不含藻蓝蛋白，蛋白，但其但其细胞体本身也由众多可溶性蛋白胞体本身也由众多可溶性蛋白质构成；在反
21、复构成；在反复冻融融提取提取过程中，它程中，它们也会也会发生降解并生降解并产生生CDOM，致使太湖，致使太湖藻藻蓝蛋白紫外波段至蛋白紫外波段至蓝波段的吸收增波段的吸收增强强。 研究表明，在以反复研究表明，在以反复冻融、超声波破碎、融、超声波破碎、氯化化钙自溶等自溶等细胞破碎方法提取出极大螺旋藻、胞破碎方法提取出极大螺旋藻、蓝隐藻、藻、钝顶节旋藻旋藻中的藻中的藻蓝蛋白蛋白时，位于，位于类囊体膜上的叶囊体膜上的叶绿素复合蛋白也素复合蛋白也会随之脱落共存于待会随之脱落共存于待测液中，并液中，并对其其300450和和500700nm谱带的吸收的吸收产生不同程度的干生不同程度的干扰。图3（d）中，双峰型
22、光中，双峰型光谱在在670nm附近具有吸收峰，同附近具有吸收峰，同时在在300450nm出出现吸收肩，吸收肩，谱型与上述研究型与上述研究类似，表明具似，表明具备双峰型光双峰型光谱形形态的藻的藻蓝蛋白待蛋白待测溶液中存在叶溶液中存在叶绿素复素复合蛋白合蛋白组分。分。 藻藻蓝蛋白的分光光度法定量主要依据藻蛋白的分光光度法定量主要依据藻蓝蛋白在蛋白在500700nm的吸收光的吸收光谱特性。特性。Bennett公式中藻公式中藻蓝蛋白的特征波蛋白的特征波长为615nm，别藻藻蓝蛋白蛋白为652nm；abelson公式中分公式中分别为620和和650nm。图3（a）和（）和（b）中，无峰）中，无峰和无峰和
23、无峰光光谱在在500700nm的吸收平的吸收平缓，615与与620nm和和652与与650nm的吸收的吸收无可分性。无可分性。显然，在此情况下使用上述公式然，在此情况下使用上述公式对无峰型无峰型样品品进行定量具有局限性。行定量具有局限性。图3（d）中，双峰型光）中，双峰型光谱620nm附近的附近的藻藻蓝蛋白吸收特征明蛋白吸收特征明显，但由于待，但由于待测溶液中叶溶液中叶绿素复合蛋白素复合蛋白的影响，的影响，670nm附近附近还具有吸收峰，且具有吸收峰，且该吸收峰与藻吸收峰与藻蓝蛋白、蛋白、别藻藻蓝蛋白的吸收峰重叠。因此，今后蛋白的吸收峰重叠。因此，今后还需要开展更多的需要开展更多的对比比实验工
24、作来分析叶工作来分析叶绿素复合蛋白素复合蛋白对太湖藻太湖藻蓝蛋白蛋白浓度度测定定的影响，以的影响，以进一步提高水体藻一步提高水体藻蓝蛋白蛋白浓度度测定的准确性。定的准确性。结论结论结论结论根据根据500700nm的吸收峰个数，太湖水体中藻的吸收峰个数，太湖水体中藻蓝蛋白的吸收光蛋白的吸收光谱形形态可划分可划分为无峰型、无峰型、单峰型、双峰型三峰型、双峰型三类。（1）无峰型光）无峰型光谱620nm附近无藻附近无藻蓝蛋白的特蛋白的特征吸收峰出征吸收峰出现。根据。根据300450nm的吸收差异，的吸收差异，又可分又可分为无峰无峰和无峰和无峰两个两个亚类。（2）单峰型光峰型光谱具有明具有明显的藻的藻蓝蛋白吸收特蛋白吸收特征。受藻种差异和提取征。受藻种差异和提取纯度的影响，各吸收度的影响，各吸收峰的出峰的出现位置和峰位置和峰值比与比与标准品、准品、单一藻种一藻种不同。不同。（3）双峰型光）双峰型光谱兼具藻兼具藻蓝蛋白和叶蛋白和叶绿素复合素复合蛋白的吸收特征。蛋白的吸收特征。
