2第二章微生物发酵产酶

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1、Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物发酵产酶制作：郑穗平酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from Aspergil

2、lusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew exampleContents of chapter 21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物3、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生产过程的动力学GoGoGoGo5、动植物细胞培养产酶，自学2.1 酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法则- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白质的生物合成- Translation4、酶生物合成的调节- RegulationGoGoGoGo下一节下一节本章目录Reverse

3、transcription1、中心法则-Central Dogma nReplication Replication 复制复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。nTranscription Transcription 转录转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。nTranslation Translation 翻译翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。nReverse translation Reverse translation 逆转录逆

4、转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。本节目录2、RNA的生物合成(转录)- Transcription细胞内RNA的生物功能(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。 (2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。

5、(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点1 1、转录的不对称性转录的不对称性：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二条链中仅有的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链反义链 antisenseantisense strand strand（无意义链，负链）：（无意义链，负链）：在在RNARNA的转录中，的转录中，用作模板的用作模板的DNADNA链称为反义链。链称为反义链。有义链有义链 coding strandcoding strand（编码链，正链）：（编码链，正链）：在在

6、RNARNA的转录中，不的转录中，不作为模板的作为模板的DNADNA链称为有义链。链称为有义链。2 2、转录所需酶：、转录所需酶：依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶又称为转录酶，是以又称为转录酶，是以DNADNA为模板的一类为模板的一类RNARNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1 1种种RNARNA聚合酶催化所有聚合酶催化所有RNARNA的生物合成。而在真核生物中的生物合成。而在真核生物中RNARNA聚合酶有聚合酶有3 3种种，分别为，分别为RNARNA聚合酶

7、聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚合酶聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4 41010个，亚基种类有个，亚基种类有4 46 6种。种。 转录过程n起始位点的识别起始位点的识别 recognitionrecognitionn转录起始转录起始 initiationinitiationn链的延伸链的延伸 elongationelongationn转录终止转录终止 terminationterminationn转录后加工转录后加工 modificationmodificationThe E. coli RNA polymerase holoenz

8、yme consists ofsix subunits: a2 s.Possible catalytic subunitsPromoterspecificityEnzyme assembly,Enzyme assembly,Enzyme assembly,Enzyme assembly,promoter recognition,promoter recognition,promoter recognition,promoter recognition,activator bindingactivator bindingactivator bindingactivator bindingRole

9、 unknownRole unknownRole unknownRole unknown(not needed (not needed (not needed (not needed in vitroin vitroin vitroin vitro) ) ) )36.5 36.5 kDakDa151151 15515511 11 kDakDa(32-90 (32-90 kDakDa) )本节目录3、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译翻译: : 以以RNARNA中中mRNAmRNA为模板为模板, ,按照其按照其 核苷酸顺序所组成的密码指核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程

10、导蛋白质的合成的过程. .mRNAmRNA蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template)nmRNAmRNA是带有是带有DNADNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。n以以mRNAmRNA为模板为模板, ,合成一定结构的多肽链的过程合成一定结构的多肽链的过程( (翻译翻译) )，就，就是将是将mRNAmRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。的氨基酸排列顺序

11、。蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codonnmRNAmRNA分子中分子中, ,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为氨基酸或其它信息，称为密码子密码子或或三联密码三联密码。n四种核苷酸编成三联体可形成四种核苷酸编成三联体可形成4 43 3个即个即6464个密码子。其中：个密码子。其中：n一个起始密码一个起始密码: : AUGAUGn三个终止密码三个终止密码: : UAA UGA UAGUAA UGA UAGn多数氨基酸拥有多数氨基酸拥有 2-42-4个密码个密码蛋白质合成的几个要素- 转运RNA

12、 (transporter)ntRNAtRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。ntRNAtRNA有特异性，至少有有特异性，至少有2020种以上。每种种以上。每种tRNAtRNA的反密码环顶端均的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的有由三个核苷酸组成的反密码反密码，能与，能与mRNAmRNA上相应的密码互补结上相应的密码互补结合。合。酪酪5 55 53 3AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密码反密码mRNA密码密码( (codoncodon) )与反密码与反密码( (anticodonanticodon) )的碱基

13、配对的碱基配对蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosomen核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶n其他辅助因子其他辅助因子n工具酶工具酶蛋白质的合成过程n肽链合成的起始肽链合成的起始 initiationn肽链合成的延伸肽链合成的延伸 elongationn肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放 termination and releasen合成多肽的输送和加工合成多肽的输送和加工 transpo

14、rt and modificationn蛋白质分子的折叠蛋白质分子的折叠 folding氨基酸活化生成氨酰-tRNA 原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）的参与下，核糖体30 S亚基，fMet- tRNAF ，mRNA和50 S 亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括5个步骤：（1）30 S亚基与起始因子IF3 结合；（2）30 S亚基与mRNA结合，形成30 S-IF3-mRNA复合物；（3）fMet- tRNAF 与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet- tRNAF -IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的参与下，fMet- tRN

15、AF-IF2-GTP与30 S-IF3-mRNA结合生成30 S起始复合物。在此30 S起始复合物中，fMet- tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；（5）50 S亚基与上述30 S起始复合物结合，形成完整的70 S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖体形成时，fMet- tRNAF 位于70 S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。 蛋白质合成起始进进位位转转位位成肽成肽合成终止高效率的蛋白质合成体系n蛋白质的空间结构如何形成？n功能与结构如何统一？n体外、体内的结构如何变化？n蛋白质分

16、子设计及蛋白质工程的需要蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要n越来越多的基因工程产物需要复性复活越来越多的基因工程产物需要复性复活, , 要求蛋白质折叠要求蛋白质折叠的理论及技术的指导的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。蛋白质的折叠本节目录4、酶生物合成的调节 (regulation)n基因水平的表达控制q酶含量的调节酶含量的调节n操纵子（操纵子（operonoperon）：是一组功能上相关，受同一调控区）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。控制的基因组成的一个遗传单位。A BEX底物水平底物水平的调节的调节酶水平酶水平的调

17、节的调节 酶活性的调节酶活性的调节酶含量的调节酶含量的调节酶的定位调节酶的定位调节辅助因辅助因子调节子调节生长发育的不同时期生长发育的不同时期外界环境变化外界环境变化酶合成酶合成与分解速度的变化与分解速度的变化（基因表达调控）（基因表达调控）产物调节产物调节细胞内酶的调控模式n酶酶在在细细胞胞内内的的含含量量取取决决于于酶酶的的合合成成速速度度和和分分解解速速度度。细细胞胞根根据据自自身身活活动动需需要要，严严格格控控制制细细胞胞内内各各种种酶酶的的合合理理含含量量，从而对各种生物化学过程进行调控。从而对各种生物化学过程进行调控。n酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种

18、类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的基因表达的调控主要在转录水平上进行。调控主要在转录水平上进行。酶合成诱导的现象Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验： 1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； 2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失； 3.表明菌体生物合成的经济原则：需要

19、时才合成。 本世纪三十年代，本世纪三十年代，H.KarstromH.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶诱导酶与组成酶某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导酶合成的诱导。能诱。能诱导酶合成的物质叫导酶合成的物质叫诱导物诱导物。被诱导合成的酶叫。被诱导合成的酶叫诱导酶诱导酶。酶合成阻遏的现象Jacob and Monod的工作：实验： 1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖

20、的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； 2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫合成的酶叫阻遏酶阻遏酶。乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构诱导机制诱导机制调节

21、基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基因不能表达基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）色氨酸操纵子（酶的阻遏） -阻遏物和操纵基因的调节阻遏物和操纵基因的调节细菌乳糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制( (降解物阻遏降解物阻遏) )调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ la

22、cYlacACAPcAMPCAP-CAP-cAMPcAMP复合物复合物mRNAmRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则cAMPcAMP的浓度降低，的浓度降低， CAP-CAP-cAMPcAMP复合物减少，不能与启动子结合，故复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应过去称葡萄糖效应本节目录2.2 常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production基本要求：n不是致病

23、菌n发酵周期短,产酶量高n不易变异退化n最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。n对医药和食品用酶,还应考虑安全性：n凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!n由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。n非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。下一节下一节本章目录(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。n形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。nEscherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。

24、n大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。n应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等(2) 醋酸杆菌（AcetobacterAcetobacter） n菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。n应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体） (3)枯草枯草芽孢杆菌（Bacillus Bacillus subtilissubtilis）

25、n直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。n枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。(4) 根霉(Rhizopus) n分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 n根霉因有假根（根霉因有假根（RhizoidRhizoid）而得名）而得名（假根的功能是在培养基上固着，（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。并吸收营养）。n分布于土壤、空气中，常见于淀粉分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。蔬菜的腐烂。n代表种：代表种：米根霉（

26、米根霉（R.oryzaeR.oryzae) )黑根霉黑根霉( (R.nigricanR.nigrican) )等。等。n应用：应用：根霉能产生一些酶类，如淀根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。这些酶类的菌种。在酿酒工业上常在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。酸、延胡索酸等有机酸。(6)曲霉(Aspergillus) n分类：多数属于子囊菌亚门，分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。少数属于半知菌亚门。n分布：广泛分布于土壤、空气分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，

27、可引起食物、谷物和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。生致癌性的黄曲霉毒素。n代表种：代表种：黑曲霉黑曲霉Asp. NigerAsp. Niger、黄曲霉黄曲霉Asp.flavusAsp.flavusn应用：应用：是制酱、酿酒、制醋的是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。产糖化饲料的菌种。回本节2.3 酶的发酵工艺条件与控制 T

28、he fermentation principles and its control of enzyme production1、培养基2、发酵条件及控制- Transcription3、提高产酶的措施- TranslationGoGoGo下一节下一节本章目录1、培养基各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求n1、选择适宜的营养物质n2、营养物的浓度及配比合适n3、物理、化学条件适宜n4、经济节约n5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子

29、、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（培养基（mediummedium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生

30、命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机

31、制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化镁、铁等元素的化合物。合物。 氮源氮源无机盐无机

32、盐需要注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，

33、麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子种生长因子 实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LBLB培养基；培养基；自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养

34、基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；n枯草杆菌枯草杆菌BF7658-BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398中性蛋白酶发酵培养基中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。n黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。n地衣芽孢杆菌地衣

35、芽孢杆菌27092709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。n黑曲霉黑曲霉AS 3.350AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 n游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。n桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,

36、硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。n黑曲霉黑曲霉AS3.396AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl

37、缓冲液配制)回本节2 2、发酵条件及控制、发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长pHpH值的控制值的控制细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值往往有所不同。细胞生产值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适某种酶的最适pHpH值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpH值。值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过

38、程中，通过控制培养基有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。 通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。温度的控制温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 枯草杆菌的最适生长温度为3437黑曲霉的最适生长温度为2832 溶解氧的控制溶解氧的控制在酶的发酵生产过

39、程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。调节通气量调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质 控制溶解氧方法回本节3、提高酶产量的措施提高酶产量的措施 添加诱导物添加诱导物对于诱导酶

40、的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的分解

41、代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除使阻遏解除。 添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透

42、过性，有利于胞表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂，如吐温（吐温（TweenTween）、特里顿特里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 添加产酶促进剂添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质可以促进产酶、但是

43、作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度进剂的种类和浓度。 回本节2.4 2.4 酶生产过程的动力学酶生产过程的动力学1、酶生物合成的模式2、酶生产过程中细胞生长动力学3、酶生产过程中产酶动力学GoGoGo本章目录1 1、酶生物合成的模式、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程

44、一般经历调整期、生长期、其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等平衡期和衰退期等4 4个阶段个阶段 通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型延续合成型，中期合成型中期合成型和滞后合成型。滞后合成型。 同步合成型同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型生长偶联型。 属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，

45、有部分诱导酶也按照大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。此种模式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度 活细胞浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度延续合成型延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。酶还可以延续合成一段较长时间。 属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸

46、或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物 中期合成型中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。 例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无

47、机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样， 在细胞生长的开始阶段, 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间， 培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30 min左右，所以当细胞进入平衡期后， 酶的生物合成随着停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml滞后合成型滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为合成并大量积累。又称为非生长偶联型非生长

48、偶联型。许多水解酶的生物合成都属于许多水解酶的生物合成都属于这一类型。这一类型。 属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素D 对产

49、酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml3022不加加入不加加入理想的酶合成模式理想的酶合成模式n酶所对应的酶所对应的mRNAmRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。n在酶的

50、发酵生产中， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延最理想的合成模式应是延续合成型续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。n对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程其他合成模式的酶，可以通过基因工程 细胞工程等先进技术细胞工程等先进技术, ,选育得到优良选育得到优良的菌株的菌株, , 并通过工艺条件的优化控制并通过工艺条件的优化控制, , 使他们的生物合成模式更加接近于延续合使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型成型。n其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应

51、的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量延迟其生物合成停止的时间。 回本节2 2、酶生产过程中细胞生长动力学酶生产过程中细胞生长动力学n细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。 n细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德法国

52、的莫诺德( (MonodMonod) )首首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。 在培养过程中，在培养过程中， 细胞生长速率与细细胞生长速率与细胞浓度成正比胞浓度成正比 假设培养基中只有一种限制性基质，而不存假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，在其他生长限制因素时，为这种限制性基质为这种限制性基质浓度的函数。浓度的函数。KS 为莫诺德常数，为莫诺德常数， 是指比生长速率达到最是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。大比生长速率一半时的限制性基质浓度。回本节限制性基质的物料平衡式限制性基质的物料平衡式莫诺德方程是基

53、本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式3 3、产酶动力学、产酶动力学 n产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律响规律。n产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学非结构动力学。n也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学微观产酶动力学或称为结构动力学结构动力学。在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。细胞浓度以及细胞产酶模式有关。 与生长相关与生长部分相关与生长无关回本节常用的几种模型常用的几种模型