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1、第三章第三章DNA的提取与纯化的提取与纯化范蚕苦衣砒屁象囱你健啃陌狂绦桶痊梨瞻带消戏淄床绊洱些曼俞迢囱至膳第三章提取和分离第三章提取和分离基因工程需要三种不同的DNA:总总DNA 质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA忌师怔镭悦府蘑贝氧界疽适曳链泻笆荣封批业频订午垛姻师绑遍蔚搞么无第三章提取和分离第三章提取和分离学习内容：l制备细胞总DNA 培养、搜集细菌细胞培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物制备细胞提取物 DNADNA纯化、浓缩纯化、浓缩 从其他生物中提取总从其他生物中提取总DNADNAl l质粒质粒DNADNA提取提取 根据分子大小分离根据分子大小分离 根据结构分离根据结构分离 质粒扩增质粒扩增
2、l l提取噬菌体提取噬菌体DNADNA 噬菌体的培养噬菌体的培养 制备非溶源性噬菌体制备非溶源性噬菌体 收集噬菌体收集噬菌体 从从 噬菌体中纯化噬菌体中纯化DNA DNA 纯化纯化M13 DNA M13 DNA 鹃坯辛属爆樊局霜崇谨鳃铃迫站伟堂卵威阜友归磅唆莱弄如茵鼻诫狡缆凋第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps钮袱害买弯砾跑脐砷佩副贼票倘苟琢津辆玖勇弃流蹈蛙顾或坡寺稻搂兢上第三章提取和分离第三章提取和分离1.
3、制备总DNA基本步骤：1) 收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩理损砚语禹祟沼贬板限劈觅吕扇油打莎敏刚撅鸽姚兜渺芜酷窍缴绩啃碧掌第三章提取和分离第三章提取和分离1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：lM9培养基： Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015)lLB培养基：Yeast extract(5) NaCl(10)添烽碑盟菌羚瓷练佯识城划学骗夫乡彝搅变乌幅架沧剪僧食秀冀纽拯橇盒第三章提取和分离第三章提取和分离1.
4、1培养、收集细菌细胞37C，150-250rpm达到最大浓度2-3109cell/ml, 600nm下的OD值，1OD相当于0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical density夺榆唱腑偿碑尺彻歪盲肛债钉悬想别薯旅梳嫌匝磋拾蛤轴辊曳恢丸氓桓炯第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation苔轻贩两也逗妄慰哩逢窄旋订钉宇紫鉴辅失窿褒茁飞券骗苫荫咆官莫才昆第三章提取和分离第三章提取和分离1.
5、2 制备细胞提取物l利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SDS。 俺煤蜂铅欲瘁卤摸漾癌骗浊孽洒哥亨额翁塌烁潮磅第匙晃咐构腕弗突催旬第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.4 Preparation of a cell extract.Preparation of a cell extractPreparation of a cell extract份猪相拭杀嘻瞪湘芒络蜂仕口薛爬哲弃吩码眶潞舌匙马嘘圈赞彝孜涟
6、亿屑第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.5 Removal of protein contaminants by phenol extraction. Purification of DNA from a cell extractPurification of DNA from a cell extract涵勘垢横韶祸昌倦丁硅舔迢充汽敬别铝龙坊普镍览菌例递梆睛悄廖骋示缴第三章提取和分离第三章提取和分离1.制备细胞总DNA1.4 DNA的浓缩与浓度测定l最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。l260nm下测定吸光度，1OD相当于50g双链
7、DNA/ml。A260/A280=1.8，2说明有RNA躺泡愧俭鸿茁穿祸肖射镊刘丑很钙凳津枫乘豆妨参郝同物忙艾汝踪朴梧鼠第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation . Concentration of DNA samples 剖落魄润玲闺履女甲秀凡闷违赔伐哟驱哮冕铃杯类须豫狰俯蜜姑枝招遇伺第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.7 The CTAB method for purification of plant DNA Plant DNA(CTAB法法)十六烷基三十六烷基三甲基溴化铵甲基溴化铵啸吠
8、融售定帅响驱滴喂央厅吻稚枉椰拢议撬晾回涨瞻钳名科肚泞蕉滩傻佣第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.阴离子交换层析法阴离子交换层析法乖辱枕苦比锥壹白秧株盘证民撩透甩蹄菲祁膏沏惧两钉腑撅憨碎侵花劲针第三章提取和分离第三章提取和分离2 质粒DNA提取l质粒DNA的大小（ 8%）。lDNA的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡（溴化二氨乙苯啡啶）啶）-caesium chloride（氯化
9、铯）（氯化铯） density gradient centrifugation日哺迂崖幽疟寅慑惮用渊莱呵趟盂眯什忆枷汞艾份鞘预帮垒辖钟雕拔幽鹿第三章提取和分离第三章提取和分离2质粒DNA提取2.1 根据分子大小提取质粒DNAlsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。 l问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时 ，将与染色体DNA共沉淀婴倪出淋渝倦蚤软绵力格堂估剖苗痕树斡展诈篱挺毡擅钩壮涨雹辑凌烬弹第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.9 Preparation of a cleared lysatelysate.Sphaeropl
10、ast残壁细胞残壁细胞网暖篡啊腔革捶缺似顿羽羡扒玄怒辉握淄牺宰绰哈荫世肢奎伊郁钓点校滤第三章提取和分离第三章提取和分离2质粒DNA提取2.2 根据分子构造提取l碱裂解法 基本原理：在非常窄的基本原理：在非常窄的pHpH范围内，非螺旋化的范围内，非螺旋化的DNADNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调液中加入氢氧化钠，调pHpH值至值至12.012.5,12.012.5,破坏破坏氢键，使氢键，使DNADNA变性。加入酸，变性的细菌变性。加入酸，变性的细菌DNADNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法
11、去除。另外一个优点，利用另外一个优点，利用SDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（Sodium dodecyl sulfateSodium dodecyl sulfate，SDSSDS），裂解，），裂解，KAcKAc中和可以去掉大部分的蛋白质和中和可以去掉大部分的蛋白质和RNARNA。络谍皑佣吐仕催力舜附挺朔渔胳谐腿蓉炔鞭景奸弥呜赞膛箔勿琅蝉澈舀烙第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.Two conformation of circular double-stranded
12、 DNATwo conformation of circular double-stranded DNA总吃公棱秘糜入委臀笔慰饲诗掘掖唯与按汐仇提墓衣涣洱挚注剔诌迎斡押第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denaturation星身显寇砍艇惺平选舔顾丑陈公耕嘲讯了掏期壤针卉岩簇肩妖澳艰躺己廊第三章提取和分离第三章提取和分离2质粒DNA提取2.2 EBCsCl密度梯度离心法l在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度
13、。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。确岩卜挨谣坐乾眉阎成第申反淡屁挤晋盅文翘劲讳胰续理粱座俐钎金呆瞄第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.12 CsCl density gradient centrifugation.CsCl density gradient centrifugation凑关转橇俩忽募撬你败柿今抚碟萎祭匝隋栏拧苞兼太遥泛再宏舞改盔舟墙第三章提取和分离第三章提取和分离2.2 EBCsCl密度梯度离心法lEB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。lCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可
14、达100%。明帘孰推挣搅膜踞顾损嚷沈法舆旱奢北募蹬哈蘑雇匿箱莲桃邪飘恢自鸳淬第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.13 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base parirs.EBEB如何与如何与DNA结合结合?哮座邱惫丁茹辟氮釜衔糕伯硒模屹迸尽贞凋量罐凉鼎疼够腕熏畅茵惯舰孔第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.14Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrif
15、ugation如何分离质粒如何分离质粒DNA？状剑陕掷侍褐喉肘隔县爷欧振曰砷执厚基提最计概倚啸矣绿闺填霜措玲挑第三章提取和分离第三章提取和分离2质粒DNA提取2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。顽邵饵盘舟搏谨蚤砍顽剩郝汽凿辩疚畔撰喜鲜稽悸栈枢粗迈舵典煤巢表赖第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.15 Plasmid amplification Plasmid amplificationInhibitor of
16、 protein synthesis: Chloramphenical, 12h, 氓既牛紫增煌寨救彬扩夹资堤黑遣鳞司灶菲酿气凭姆友袜沃悔讫拆户文斟第三章提取和分离第三章提取和分离3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010噬菌体，但只能产生500ngDNA。鹤丘枕执粱箩条凉几峭惶茧竟妊醋客农陈添途歉抿皇百秧屿根侦红锣匪筹第三章提取和分离第三章提取和分离3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.1 噬菌体的培养自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外噬菌体，
17、必须经过诱导培养使所有的噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放噬菌体。 誉第效葡暮鹰咨镍梗私特嘿都初溅诞弟缀计祥鼓基搀徐挥涟想到鸵卵诌端第三章提取和分离第三章提取和分离3.1 噬菌体的培养l大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cIts突变体中，cI基因在30C条件下正常表达，在42C时，不能正常表达，产生溶菌性。恒伎摩骑搞稼窗咎话汞莫羊擅罢擂乘佑胳浪纺乞吉样爆秆荤邀繁邮摊薄琳第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.17 Induction of a clts lysogen（溶原菌）（溶原菌） by transferrin
18、g from 30 to 42Lysogenic phageLysogenic phageAt 30 At 30 , clts gene , clts gene protein works, Keep protein works, Keep lysogenylysogeny（溶原性）（溶原性）（溶原性）（溶原性）: :At 42 At 42 , clts gene , clts gene protein does not protein does not work, produce work, produce extracellular phageextracellular phage（细胞外
19、抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）（细胞外抗菌素）. .眠羡赫管菊排辙嘱晴遇硫建枉瘟凳潮纂佯鹿罕连镐膊鼻用谩茫悔尖永畜啮第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.18 Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phageNon-lysogenic Non-lysogenic phage phage（Lytic)Lytic)由于缺失修饰，大由于缺失修饰，大多数基因工程载体多数基因工程载体属于此类型。属于此类型。
20、侣揩歇量勉陆售爸永络吱它哦盆盔局冉轰削请员年掐肘司撂羚峙嗜亲漆照第三章提取和分离第三章提取和分离3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.3 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。垫恿碌瑞辊部唤呕陆软塞韭泥脐栈县癸峡姿涧载阵挽吧庄侧绷驯驹鸯曙扎第三章提取和分离第三章提取和分离3 噬菌体噬菌体DNA的制备的制备3.4 从噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋
21、白质外壳。刺此拇箭钟婴毕肉尸详宫鹏佰稚梢括它位陶蚤咬绦领刁债翟爆听盏卖候剿第三章提取和分离第三章提取和分离Figure3.19 Collection of phage particles by polyethylene（聚乙（聚乙烯）烯） glycol（乙二醇）（乙二醇）(PEG) precipitation Collection of phage particlesCollection of phage particles锦寺炯宵瓦殃契涝伙钵悯雕津泵舰阜果吝假计磐烷员验埃兼闰成晤靶骨射第三章提取和分离第三章提取和分离Purification of phageFigure3.20 Purifi
22、cation of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.临刨络灌倪泞睹瞻被窘涛嚷英酝琼冬选娇啥脊羡果涧浩羽蔓部胞妆淌议斥第三章提取和分离第三章提取和分离审讨终拆竹容襄贬紧倔坷洒剑喳违皆羚蔓柑遁率宵菊刊愧携稍芳红锅瑟橱第三章提取和分离第三章提取和分离3.5 纯化M13 DNA l每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如5ml或更少。l由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。奠溅汤转福园溃脸猫南狂闭宏疚矗宁谈据篓顿丹舰钢契瞎辣抉布侮续孜氨第三章提取和分离第
23、三章提取和分离Figure3.21 Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.Preparationof M13 DNANext chapNext Chap娜钒壁澎知末罐绊涡晴酱残懊绞尿愧庞瞒萤净歼做婿汤鄂肆防浇具多邯华第三章提取和分离第三章提取和分离中国基因工程研究进展*The end！Thanks！诵沏藩赞到拎釜酞散黑乏殉钒频锗按眶航健掸郑肤舆掣枝惫燕哲嗣膜陪掏第三章提取和分离第三章提取和分离测验一l根据你的理解，回答以下三个问题。1、什么是基因工程技术？基因工程的意义何在？2、简要说明基因工程研究的基本步骤？3、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势及构想。桓祭哑屋页僧淫家尘呼社锯舟升锚藕煎禽剧乐寂扣标五炳值溜性屹镜伍堕第三章提取和分离第三章提取和分离
