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1、 MicroRNAsinRenalCellCarcinoma:DiagnosticImplicationsofSerummiR-1233Levels血清血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义对肾细胞癌诊断意义LenaM.Wulfken1RudolfMoritzCarstenOhlmann,StefanHoldenriederVolkerJung,FrankEdwinHerrmannGiselaWalgenbach-BrunagelBeckerAlexandervonRueckerStefanC.Mullern n肾癌病理类型：肾癌病理类型：n n1 1透明细胞癌透明细胞癌(clear cell
2、 renal carcinoma) (clear cell renal carcinoma) 为最为最常见的类型，占肾细胞癌的常见的类型，占肾细胞癌的70%80%70%80%。n n2 2乳头状癌乳头状癌(papillary carcinoma) (papillary carcinoma) 占肾细胞占肾细胞癌的癌的10%15%10%15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。个类型。 n n3 3嫌色细胞癌嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma) (chromophobe renal carcinoma) 在肾细胞癌中约占在肾细胞癌中约
3、占5%5%。肾癌的类型还包括集。肾癌的类型还包括集合管癌（合管癌（collecting duct carcinomacollecting duct carcinoma）和肾癌未分类）和肾癌未分类（renal cell carcinoma, unclassifiedrenal cell carcinoma, unclassified）。）。 肾癌无论体积大小，约肾癌无论体积大小，约80%的患者早期可无任何症的患者早期可无任何症状，只是在普查和因其他原因作体格检查或状，只是在普查和因其他原因作体格检查或B超检超检查查时才被发现其时才被发现其肾脏肾脏有占位病变或触摸到有占位病变或触摸到腹部包腹部包块
4、块。有些患者肾脏。有些患者肾脏原发癌原发癌灶很小，无泌尿系或肾灶很小，无泌尿系或肾内症状，却首先表现出远处内症状，却首先表现出远处转移癌转移癌的症状。如发的症状。如发现患者腋下、现患者腋下、腹部肿块腹部肿块，为找原发病灶才发现为，为找原发病灶才发现为肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。 但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。已有研究发现在癌细胞中微小已有研究发现在癌细胞中微小RNA表表达水平发达水平发生了改变，因此微小生了改变，因此微小RNA有有可能作为癌症患者的诊断或预后的标可能作为癌症患者的诊断或
5、预后的标志物，我们的研究旨在分析肾细胞癌志物，我们的研究旨在分析肾细胞癌患者循环血清中微小患者循环血清中微小RNA的水平变化。的水平变化。 miRNA是一类长约是一类长约1924nt的非编码单链小的非编码单链小RNA分分子子,在动物中在动物中,绝大多数绝大多数miRNA可以通过与靶基因可以通过与靶基因3UTR区互补结合区互补结合,抑制靶基因翻译成蛋白质抑制靶基因翻译成蛋白质,进进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育,并参与多种疾病过程。并参与多种疾病过程。已有研究证实正常组织和肿瘤组织中已有研究证实正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明表达
6、明显改变显改变.miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式在不同肿瘤中具有特定的表达模式.这些特点也使这些特点也使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标。物学标记和治疗药物作用的靶标。MethodsObjectives：迄今为止，还没有对肾癌患者循环中微小：迄今为止，还没有对肾癌患者循环中微小水平进行研究的报道。我们设计了用低密度芯水平进行研究的报道。我们设计了用低密度芯片（片（TaqManLowDensityArray）技术检测并且用传）技术检测并且用传统的统的real-timePCR在一独立组中证实了最有趣的在一独立组中证实了最有趣的mic
7、roRNAs， Participants：我们收集了肾肿瘤患者的血清，包括：我们收集了肾肿瘤患者的血清，包括肾细胞癌和良性肾肿瘤（大嗜酸粒细胞瘤肾细胞癌和良性肾肿瘤（大嗜酸粒细胞瘤oncocytoma，血管肌脂肪瘤血管肌脂肪瘤Angiomyolipoma），选取了非恶性疾），选取了非恶性疾病的手术患者作为对照组，表，我们收集来自病的手术患者作为对照组，表，我们收集来自、三所大学泌尿外科至、三所大学泌尿外科至这些患者术前的血液样本。这些患者术前的血液样本。从血液样本中分离出血清。从血液样本中分离出血清。Wealsoanalyzedformalin-fixed,paraffinembeddedti
8、ssuefromsixpatientsstoredinthearchivalfilesoftheInstitutfurPathologieattheRNAisolation：提取血清中提取血清中提取病理组织切片中的提取病理组织切片中的 LowDensityArrays：QuantitativeReal-TimePCR：Statisticalmethods：real-timePCR得出的数据用得出的数据用SDSsoftwarev2.4分析，分析，microRNA水平用水平用RQManagerv1.2.1计算出计算出,数据分析用数据分析用DataAssistv2.0，数据统计用数据统计用SPSS1
9、7.软件，软件，microRNA水平的特异水平的特异性、灵敏性用分析，性、灵敏性用分析，ResultsPhase-1:标志物的发现标志物的发现载样缓冲液作用：载样缓冲液作用：1 1）增大样品密度，以确保）增大样品密度，以确保DNADNA均匀进入样品孔内均匀进入样品孔内为了使样品能沉入胶孔，需加入适量的蔗糖、聚蔗糖为了使样品能沉入胶孔，需加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重或甘油以增加比重2 2）使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利）使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利3 3）含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳）含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳动动指示剂指示剂电泳过
10、程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝溴酚蓝( (bromophenolbromophenol blue Bb) blue Bb) 呈蓝紫色，呈蓝紫色，二甲苯青蓝二甲苯青蓝( (xylenexylene cyanolcyanol，XcXc) ) 呈蓝色。呈蓝色。 0.50.5TBETBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp300bp的双链的双链DNADNA相同，二甲苯氰（蓝）则与相同，二甲苯氰（蓝）则与4kbp4kbp的的DNA
11、DNA相同。所以根据分离相同。所以根据分离样品中样品中DNADNA分子的大小，可以参照指示剂分子的大小，可以参照指示剂BbBb和和XcXc的迁移情况决的迁移情况决定是否停止电泳定是否停止电泳 3 3 琼脂糖琼脂糖( ( AgaroseAgarose) )凝胶的制备凝胶的制备 制好的凝胶制好的凝胶水平电泳槽水平电泳槽A A 通常将溴化乙锭通常将溴化乙锭EB (0.5EB (0.5微克毫升，母液微克毫升，母液10mg/ml10mg/ml）) )渗人到凝胶和电泳缓冲液中。渗人到凝胶和电泳缓冲液中。B B 也可使凝胶在不加溴化乙锭时进行电泳，也可使凝胶在不加溴化乙锭时进行电泳， 电泳结束后再柒电泳结束
12、后再柒DNADNA。在室温下将凝胶浸埋在含。在室温下将凝胶浸埋在含溴化乙锭溴化乙锭 (0.5(0.5微克毫升微克毫升) )的电泳缓冲液或水中的电泳缓冲液或水中4545分钟。分钟。 C C 而其他系列染色剂，例如而其他系列染色剂，例如SYBRSYBRGreenGreen，GelRedGelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。，虽然毒性小，但价格昂贵。4 4、 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNA的染色的染色 溴化乙锭溴化乙锭( ( EthidiumEthidium bromide bromide, EB), EB)染色染色 EBEB嵌入嵌入DNADNA碱碱基基对对之之间间, , 会会被被紫外光激紫外
13、光激发发而而放出放出约约600nm600nm的的荧荧光光. . EB EB为为致癌物致癌物，操作操作时务时务必戴上手套必戴上手套!SYBR-Green 染色n nSYBR-GreenSYBR-Green灵敏度比灵敏度比EBEB高高2510025100倍倍n nSYBR-GreenSYBR-Green：荧光染料特异性地掺入：荧光染料特异性地掺入DNADNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中双链后，发射荧光信号，而不掺入链中SYBR-GreenSYBR-Green的不会发射任何荧光信号的不会发射任何荧光信号n nSYBR-GreenSYBR-Green：广泛用于检测琼脂糖和聚：广泛用于检测琼脂糖和
14、聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺凝胶中的RNARNA或单链或单链DNADNA。SYBR-GreenI5353SGSGSGSGSGExcitationEmission5 5、加样、加样6 6 6 6、凝胶成像、凝胶成像、凝胶成像、凝胶成像1 1） 以紫外以紫外光做光做为为光源光源. .2 2）需使用需使用红红或或黄黄色色滤滤光片去除光源干光片去除光源干扰扰. .3 3）操作操作时须时须小心小心EBEB, , 务务必戴上手套必戴上手套. . 估计估计DNA分子量分子量13531078872603310281/2712341941187201234565.605.6072725.205.201181184
15、.704.701941944.404.402342344.204.202812814.004.003103103.003.006036032.352.358728721.901.90107810781.551.5513531353D(cm)D(cm)Size(bpSize(bp) )M123.603.60? ?2.352.35? ?213703702.572.573.603.602 28708702.942.942.352.351 1Y(Y(bpbp) )LogLog1010YYD(cm)D(cm)DNA粗略定量粗略定量20kb20kb12kb12kb10kb10kb6kb6kb1.2kb1.
16、2kb0.8kb0.8kb1.1.将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中；将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中；2.2.在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解；在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解；3.3.将溶液冷却至将溶液冷却至50-60 50-60 o oC C，再加入溴化乙锭，再加入溴化乙锭 ( (取自贮存在取自贮存在4 4 o oC C避光避光瓶中瓶中500500毫克毫升水中的母液毫克毫升水中的母液) )至终浓度为至终浓度为0.50.5微克毫升；微克毫升；5.5.将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中，并立即插入梳子，使其齿在将琼脂糖溶液灌注入制胶模具
17、中，并立即插入梳子，使其齿在靠近胶一端的位置形成加样的孔格。靠近胶一端的位置形成加样的孔格。6.6.当凝胶完全凝固后当凝胶完全凝固后( (在室温下在室温下3030一一4545分钟分钟) )，小心取出梳子，将，小心取出梳子，将胶安放在电泳槽中；胶安放在电泳槽中；7.7.加恰好足量的电泳缓冲液加恰好足量的电泳缓冲液( (若需要可加若需要可加0.50.5微克毫升的溴化乙微克毫升的溴化乙锭，使胶埋在溶液中深约锭，使胶埋在溶液中深约l l毫米处。毫米处。8 8 . .加样加样样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶孔格中。孔格中。载样缓
18、冲液：通常制成载样缓冲液：通常制成6 6倍的浓缩液，与样品混合后，用微量倍的浓缩液，与样品混合后，用微量移液器加样。移液器加样。 9 9 . .电泳电泳电压：电压：5v/cm5v/cm，DNADNA向正极泳动直至向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶中迁移出适当的距离。中迁移出适当的距离。 10 10 . .检测检测 紫外灯，凝胶成像系统。紫外灯，凝胶成像系统。防止防止EBEB污染！污染！六、聚丙烯酰胺凝胶电泳（六、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidepolyacrylamide gel gel electrophoresis, electrophoresi
19、s, PAGEPAGE） 1 1 1 1、概述、概述、概述、概述1)1)1)1)支持介质：聚丙烯酰胺凝胶支持介质：聚丙烯酰胺凝胶支持介质：聚丙烯酰胺凝胶支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺单体（单体：丙烯酰胺单体（单体：丙烯酰胺单体（单体：丙烯酰胺单体（acrylamideacrylamideacrylamideacrylamide，AcrAcrAcrAcr） 交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：N N N N，N N N N - - - -甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（methylanemethylanemethylanemethylane bisacryl
20、amidebisacrylamidebisacrylamidebisacrylamide，BisBisBisBis） 单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶是目前生化实验室最常用的支持介质是目前生化实验室最常用的支持介质是目前生化实验室最常用的支持介质是目前生化实验室最常用的支持介质CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CHCH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-
21、CHCH2 2-CH-CH- n nCHCH2 2-CH-CH- C=OC=O C=O C=O NHNH2 2 NH NH CHCH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH- n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=OC=O NH NH2 2 NHNH2 2丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr）N,NN,N- -甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（BisBis）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺2 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳分类、聚丙烯酰胺凝胶电泳分类1 1 1 1） 根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续根
22、据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。性聚丙烯酰胺凝胶电泳。性聚丙烯酰胺凝胶电泳。性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 连续性：连续性：连续性：连续性：整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及pHpHpHpH都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分布，简单易行；布，简单易行；布，简单易行；布，简单易
23、行； 不连续性：不连续性：不连续性：不连续性：系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pHpHpHpH和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，能将较稀的样品能将较稀的样品能将较稀的样品能将较稀的样品浓缩浓缩浓缩浓缩成密集的区带，从而提高分辨率。成密集的区带，从而提高分辨率。成密集的区带，从而提高分辨率。成密集的区带，从而提高分辨率。 2 2）根据凝胶溶液和电
24、泳缓冲液对样品构象的）根据凝胶溶液和电泳缓冲液对样品构象的影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。 非变性：非变性：用于双链用于双链DNADNA片段的分离和纯化、有功片段的分离和纯化、有功能蛋白的分离与纯化。能蛋白的分离与纯化。变性：变性：凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试剂或蛋白变性剂剂或蛋白变性剂SDS（如（如SDS-PAGE电泳电泳)的的存在下发生聚合。用途包括单链存在下发生聚合。用途包括单链DNA的分离，的分离，如放射性如放射性DNA探针的分离、探针的分离、DNA测序反应测序反应产物的分析。产物的分析。SDS-PAGE用
25、于蛋白质分子量用于蛋白质分子量的测定。的测定。3 3）根据在样品缓冲系统中是否加入还原剂）根据在样品缓冲系统中是否加入还原剂-巯基乙醇或二硫苏糖醇，可将聚丙烯酰巯基乙醇或二硫苏糖醇，可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为还原电泳和非还原电泳。胺凝胶电泳分为还原电泳和非还原电泳。在前者中蛋白质的二硫键将被破坏，而在在前者中蛋白质的二硫键将被破坏，而在后者中则可以保留。如果蛋白质的二聚体后者中则可以保留。如果蛋白质的二聚体或寡聚体是由链间二硫键来维系的，那么或寡聚体是由链间二硫键来维系的，那么用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合形式。形式。 4 4）根据凝胶形状的不同还可以
26、将聚丙烯酰）根据凝胶形状的不同还可以将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为圆盘电泳和平板电泳。胺凝胶电泳分为圆盘电泳和平板电泳。前者前者指在圆形玻璃管内制胶，电泳后形成的区带指在圆形玻璃管内制胶，电泳后形成的区带为圆盘状；而后者是指凝胶的形状为平板状，为圆盘状；而后者是指凝胶的形状为平板状，有水平和有水平和垂直垂直两种。平板电泳可同时进行多两种。平板电泳可同时进行多个样品的比较，而且还可作双相电泳，分辨个样品的比较，而且还可作双相电泳，分辨率更高。率更高。 3 3、聚丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点、聚丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点（1 1）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好在一定浓度时，
27、凝胶透明，有弹性，机械性能好在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好（2 2）分辨率极高，可分开长度仅相差）分辨率极高，可分开长度仅相差0.10.1的的DNADNA分子，分子，即即1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp（3 3）比琼脂糖凝胶的载样量大，在）比琼脂糖凝胶的载样量大，在1cm 1cm 1mm 1mm的胶孔的胶孔中能上样到中能上样到10g10g的的DNADNA样品，而分辨率并无明显下降样品，而分辨率并无明显下降（4 4）回收的）回收的DNADNA样品纯度极高，可用于要求非常严格样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动物实
28、验，引物合成后的分离纯化的实验，如转基因动物实验，引物合成后的分离纯化（5 5）经常被用作分离蛋白质，且分离效果好。）经常被用作分离蛋白质，且分离效果好。 4 4、PAGE PAGE 的的 聚聚 合合 需要催化剂需要催化剂氧化还原系统作用，使氧化还原系统作用，使AcrAcr单体带有游离基，从而与单体带有游离基，从而与BisBis进行聚合。进行聚合。 （1 1 1 1）化学聚合：）化学聚合：）化学聚合：）化学聚合：AP-TEMEDAP-TEMEDAP-TEMEDAP-TEMED系统系统系统系统 过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺(NH(NH(NH(NH4 4 4 4) ) ) )2 2 2 2S
29、S S S2 2 2 2O O O O8 8 8 8 （Ammonium Ammonium Ammonium Ammonium persulfatepersulfatepersulfatepersulfate，APAPAPAP）作为催化剂，四甲基乙二胺（作为催化剂，四甲基乙二胺（作为催化剂，四甲基乙二胺（作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMEDTEMEDTEMEDTEMED）为加速）为加速）为加速）为加速剂。剂。剂。剂。 APAPAPAP在在在在水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中能能能能产产产产生生生生游游游游离离离离基基基基SOSOSOSO4 4 4 42-2-2-2-，使使使使丙丙丙丙烯烯烯烯酰
30、酰酰酰胺胺胺胺单单单单体体体体的的的的双双双双键键键键打打打打开开开开，活活活活化化化化形形形形成成成成自自自自由由由由基基基基丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺，然然然然后后后后游游游游离离离离AcrAcrAcrAcr和和和和BisBisBisBis作用就能聚合形成凝胶。作用就能聚合形成凝胶。作用就能聚合形成凝胶。作用就能聚合形成凝胶。TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进的游离碱基能促进的游离碱基能促进APAPAPAP形成形成形成形成SOSOSOSO4 4 4 42- 2- 2- 2- 。注意：注意：注意：注意： TEMEDTEMEDTEMEDTEMED量多
31、少都会影响催化作用，量多少都会影响催化作用，量多少都会影响催化作用，量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合须在碱性条件下聚合须在碱性条件下聚合须在碱性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 （2 2）光聚合：核黄素）光聚合：核黄素-TEMED-TEMED系统系统核核核核黄黄黄黄素素素素（ri
32、boflavinriboflavinriboflavinriboflavin）在在在在光光光光照照照照下下下下（可可可可见见见见光光光光或或或或紫紫紫紫外外外外光光光光）分分分分解解解解，其其其其黄黄黄黄素素素素部部部部分分分分被被被被还还还还原原原原成成成成无无无无色色色色型型型型，但但但但在在在在有有有有氧氧氧氧条条条条件件件件下下下下无无无无色色色色型型型型又又又又被被被被氧氧氧氧化化化化成成成成带带带带有有有有游游游游离离离离基基基基的的的的黄黄黄黄素素素素，其其其其也也也也能能能能使使使使AcrAcrAcrAcr和和和和BisBisBisBis聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。聚合形成凝胶
33、。聚合形成凝胶。注意：注意：注意：注意：分分分分离离离离胶胶胶胶的的的的合合合合成成成成一一一一般般般般采采采采用用用用化化化化学学学学聚聚聚聚合合合合。因因因因为为为为若若若若用用用用光光光光聚聚聚聚合合合合，凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的孔孔孔孔径径径径受受受受光光光光照照照照强强强强度度度度与与与与时时时时间间间间的的的的影影影影响响响响，导导导导致致致致孔孔孔孔径径径径大大大大小不同，从而影响蛋白质的分离。小不同，从而影响蛋白质的分离。小不同，从而影响蛋白质的分离。小不同，从而影响蛋白质的分离。聚合影响因素聚合影响因素n n大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。大气氧能淬灭自由基，阻止多
34、聚体链长的增加。大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。去溶液中溶解的空气。去溶液中溶解的空气。去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖在胶液表面，往往覆盖在胶液表面，往往覆盖在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。n n低温、低低温、低低温、低低温、
35、低pHpHpHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。n n有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。等可抑制聚合反应。等可抑制聚合反应。等可抑制聚合反应。 凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、透明度都取决于透明度都取决于透明度都取决于透明度都取决于凝胶总浓度（凝胶总浓度（凝胶总
36、浓度（凝胶总浓度（T T T T）和和和和AcrAcrAcrAcr与与与与BisBisBisBis两者两者两者两者之比。凝胶总浓度（之比。凝胶总浓度（之比。凝胶总浓度（之比。凝胶总浓度（T T T T）和和和和交联度（交联度（交联度（交联度（C C C C）的计算公的计算公的计算公的计算公式分别为：式分别为：式分别为：式分别为：Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T=X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）C=5 5 5 5、PAGEPAGEPAGEPAGE的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系Acr/BisAcr/Bis：2040 2040
37、 完全透明且有弹性；完全透明且有弹性； 10 10 很脆，易碎，不透明；很脆，易碎，不透明； 100 100 糊状不成形，易破碎。糊状不成形，易破碎。 要制备透明而有弹性的凝胶，要制备透明而有弹性的凝胶，Acr/BisAcr/Bis要控制在要控制在30左右左右。T在在25时，时，Acr/BisAcr/Bis20左右；左右；T在在510时，时，Acr/BisAcr/Bis40左右；左右；T在在1520时，时，Acr/BisAcr/Bis=125200左右。左右。T在在325的范围内，凝胶易发生聚合。的范围内，凝胶易发生聚合。n n标准胶：在总浓度为标准胶：在总浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大
38、的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。效果。n n对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。宜的凝胶浓度。6、分离效应、分离效应 其分离效应包括：其分离效应包括：n n浓缩效应浓缩效应( (不连续系统中不连续系统中) )n n电荷效应电荷效应n n分子筛效应分子筛效应不连续垂直柱状聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应 系统的不连续性表现在以下方面：系统的不连续性表现在以下方面：系统的不连续性表现在以下方面：系统的不连续
39、性表现在以下方面： 1 1 1 1）凝胶由上、下两层凝胶组成）凝胶由上、下两层凝胶组成）凝胶由上、下两层凝胶组成）凝胶由上、下两层凝胶组成n n上层为大孔径的浓缩胶上层为大孔径的浓缩胶上层为大孔径的浓缩胶上层为大孔径的浓缩胶n n下层为小孔径的分离胶下层为小孔径的分离胶下层为小孔径的分离胶下层为小孔径的分离胶 2 2 2 2）缓冲液离子组成、各层凝胶的）缓冲液离子组成、各层凝胶的）缓冲液离子组成、各层凝胶的）缓冲液离子组成、各层凝胶的pHpHpHpH不同不同不同不同n n电极缓冲液为电极缓冲液为电极缓冲液为电极缓冲液为pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3的的的的TrisTrisTrisTr
40、is- - - -甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲液液液液n n浓缩胶为浓缩胶为浓缩胶为浓缩胶为pH6.7pH6.7pH6.7pH6.7的的的的Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液n n分离胶为分离胶为分离胶为分离胶为pH8.9pH8.9pH8.9pH8.9的的的的Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。 3 3 3 3）在电场中形成不连续的电位梯度）在电场中形成不连续的电位梯度）在电场中形成不连续的电位梯度）在电场中形成不连续的电位梯度8.38.38.96.7（1 1）凝胶孔径
41、不连续性：）凝胶孔径不连续性： 在电场作用下，颗粒在大孔胶中在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在阻力大，移动速度减慢。因而在两两层凝胶交界处层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成连续性使样品迁移受阻而压缩成很很窄的区带窄的区带 8.38.38.96.7n nHClHClHClHCl在溶液中解离出在溶液中解离出在溶液中解离出在溶液中解离出ClClClCl- - - -，在电场中迁移率快，在电场中迁移率快，在电场中迁移率快
42、，在电场中迁移率快前导前导前导前导离子或快离子离子或快离子离子或快离子离子或快离子。n n甘氨酸在甘氨酸在甘氨酸在甘氨酸在pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3的电极缓冲液解离出的电极缓冲液解离出的电极缓冲液解离出的电极缓冲液解离出NHNHNHNH2 2 2 2CHCHCHCH2 2 2 2COOCOOCOOCOO- - - -，在，在，在，在电场中迁移率很慢电场中迁移率很慢电场中迁移率很慢电场中迁移率很慢尾随离子或慢离子尾随离子或慢离子尾随离子或慢离子尾随离子或慢离子。n n电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中电泳开始
43、时，在电流的作用下，浓缩胶中ClClClCl- - - -有效泳有效泳有效泳有效泳动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而于其后，而于其后，而于其后，而NHNHNHNH2 2 2 2CHCHCHCH2 2 2 2COOCOOCOOCOO- - - -在最后面。在最后面。在最后面。在最后面。（2 2）缓冲体系离子成分及）缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 ：n n快离子向前移动，而在快离快离子向前移动，而在快离快离子向前移动，而在快离快
44、离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则子原来停留的那部分区域则子原来停留的那部分区域则子原来停留的那部分区域则形成了形成了形成了形成了低离子浓度区低离子浓度区低离子浓度区低离子浓度区，即低，即低，即低，即低导区。导区。导区。导区。n n低导区有低导区有低导区有低导区有较高的电势梯度较高的电势梯度较高的电势梯度较高的电势梯度，迫使蛋白质离子与慢离子在迫使蛋白质离子与慢离子在迫使蛋白质离子与慢离子在迫使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。此区域加速前进。此区域加速前进。此区域加速前进。由于蛋白由于蛋白由于蛋白由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介质样品的有效迁移率恰好介质样品的有效迁移率恰好介质
45、样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也于快、慢离子之间，因此也于快、慢离子之间，因此也于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附就聚集在这个移动的界面附就聚集在这个移动的界面附就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的近，被浓缩形成一个狭小的近，被浓缩形成一个狭小的近，被浓缩形成一个狭小的中间层中间层中间层中间层. . . . 低导区低导区电荷效应电荷效应n n当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分荷多少
46、不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离。白质在凝胶中得以分离。白质在凝胶中得以分离。白质在凝胶中得以分离。 分子筛效应分子筛效应n n分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表一定孔
47、径分离胶时，受阻滞的程度不同而表一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即现出不同的迁移率，此即现出不同的迁移率，此即现出不同的迁移率，此即分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应。n n颗粒小颗粒小颗粒小颗粒小，形状为，形状为，形状为，形状为圆球形圆球形圆球形圆球形的样品分子，通过凝的样品分子，通过凝的样品分子，通过凝的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大颗粒大颗粒大颗粒大，形状不规则形状不规则形状不
48、规则形状不规则的样品分子，通过凝胶的样品分子，通过凝胶的样品分子，通过凝胶的样品分子，通过凝胶的阻力较大，移动慢。的阻力较大，移动慢。的阻力较大，移动慢。的阻力较大，移动慢。 制胶玻璃板制胶玻璃板 SDSSDS（十二万及磺酸钠（十二万及磺酸钠) )是阴离子表面活性剂，是阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成与蛋白质结合形成SDS-SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略略 同时蛋白质在同时蛋白质在SDSSD
49、S作用下结构变得松散，形状作用下结构变得松散，形状趋向一致，趋向一致，因此，排除了蛋白质的电荷和结构差异，因此，排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分分子量子量所决定。所决定。（电荷效应）7 7、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)(SDS-PAGE)蛋白质样品用蛋白质样品用蛋白质样品用蛋白质样品用SDSSDSSDSSDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变处理后亚基的解聚和分子形状的改变处理后亚基的解聚和分子形状的改变处理后亚基的解聚和分子形状的改变SDS-PAGESD
50、S-PAGESDS-PAGESDS-PAGE主要用途：主要用途：主要用途：主要用途： 分离蛋白质分离蛋白质分离蛋白质分离蛋白质 蛋白亚基分子质量的测定蛋白亚基分子质量的测定蛋白亚基分子质量的测定蛋白亚基分子质量的测定SDS-PAGE 电泳过程电泳过程（一）试剂配置（一）试剂配置1、30%丙烯酰胺混合液（丙烯酰胺混合液（Acr:Bis为为29:1）：称取丙）：称取丙烯酰胺（烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（及甲叉丙烯酰胺（Bis）1g，用水，用水溶解并稀释至溶解并稀释至100ml，贮，贮棕色瓶棕色瓶中于中于4保存，可用一保存，可用一个月。个月。（Acr和和Bis有神经毒性！）有神经毒性！）2
51、、1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：取缓冲液：取1mol/LHCL溶液溶液48ml、三羟甲基甲烷（、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加水至，加水至80ml使其溶解，调使其溶解，调pH至至8.8，然后用水稀释至，然后用水稀释至100ml，置，置棕棕色瓶色瓶中，中，4贮存。贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：取缓冲液：取1mol/LHCL溶溶液液48ml，Tris5.98g，加水至，加水至80ml，调，调pH6.8，用水稀，用水稀释至释至100ml，置，置棕色瓶棕色瓶中，中，4贮存。贮存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris
52、6g、甘氨酸、甘氨酸28.8g，加水，加水850ml，调，调pH至至8.3，加水到，加水到1000ml，4贮存。用时可做贮存。用时可做10倍稀释。倍稀释。5、10%过硫酸铵（过硫酸铵（AP）6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）称取称取SDS10g，加，加水水100ml使其溶解。使其溶解。（戴好口罩）（戴好口罩）7、四甲基乙二胺（、四甲基乙二胺（TEMED）8、上样缓冲液：取、上样缓冲液：取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液缓冲液6.25ml，蔗糖，蔗糖10g，SDS2.3g，1g/L溴酚蓝溴酚蓝10ml，加，加蒸馏水溶解，混合至蒸馏水溶解，混合至100ml。9、考
53、马斯亮蓝染色试剂、考马斯亮蓝染色试剂考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液：染色液：浓度为浓度为2.5g/L，用甲醇，用甲醇 醋酸醋酸 蒸馏水蒸馏水=5 1 5的溶液配的溶液配制（制（V/V）。）。10、脱色液：取冰醋酸、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇、甲醇5ml，加蒸馏水，加蒸馏水至至100ml。11、样品、样品（二）灌胶（二）灌胶1、先将胶板（、先将胶板（590mm）封好，将配制好的分离胶液）封好，将配制好的分离胶液按配方灌注入胶板内，约按配方灌注入胶板内，约70mm高度（掌握分离胶的高高度（掌握分离胶的高度），度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约（约34mm）
54、。）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约3060min。观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确观察胶和正丁醇之间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内（约水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内（约15mm），插入合适的梳齿，室温下静置约），插入合适的梳齿，室温下静置约3060min。
55、观察胶界面，判断胶是否凝固，准备加样。观察胶界面，判断胶是否凝固，准备加样。（三）样品预处理和加样（三）样品预处理和加样 1 1、取蛋白（如血清）、取蛋白（如血清）0.1ml0.1ml、适量上样缓冲液，混、适量上样缓冲液，混匀，在沸水中煮沸匀，在沸水中煮沸5min5min。 2 2、将胶板放入垂直电泳槽中，夹紧，将、将胶板放入垂直电泳槽中，夹紧，将TrisTris- -甘氨甘氨酸电泳缓冲液加入上、下槽中，电泳缓冲液要盖过酸电泳缓冲液加入上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶板口，然后用微量加样器（或注射器）将适量样胶板口，然后用微量加样器（或注射器）将适量样品加到加样孔内。品加到加样孔内。 （四）电泳
56、（四）电泳上槽接负极，下槽接正极，先调电流为上槽接负极，下槽接正极，先调电流为18mA/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压调至将电压调至20mA/分离胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时处，停止电泳，断开电源。电泳时间约间约1.01.5h。（五）考马斯亮蓝染色：电泳结束后，取出电泳胶（五）考马斯亮蓝染色：电泳结束后，取出电泳胶板。用剥胶器轻轻撬起薄板的一头，一边用水轻冲，板。用剥胶器轻轻撬起薄板的一头，一边用水轻冲，一边拿掉薄板，用细小水流推胶至至大培养皿中。
57、一边拿掉薄板，用细小水流推胶至至大培养皿中。然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用，再用脱色液脱色脱色液脱色12天，至背景无色为止。区带可作定性天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。或定量分析。（六）分子量测定：精确量取并记录染色后、各标志（六）分子量测定：精确量取并记录染色后、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移率。蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移率。通过作图求出目标蛋白分子量。通过作图求出目标蛋白分子量。（七）常用的分子量标准蛋白（七）常用的分子量标准蛋白（七）常用的分子量标准蛋白（七）常用的分子量标准蛋白名称名称来源来源分子量分子量磷酸
58、化酶磷酸化酶B B兔肌肉兔肌肉9740097400牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛牛6620066200卵清蛋白卵清蛋白鸡蛋清鸡蛋清4500045000碳酸酐酶碳酸酐酶牛牛3100031000胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂大豆大豆2150021500溶菌酶溶菌酶鸡蛋清鸡蛋清1440014400凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）凝胶浓度（）凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)KD)KD)1515151512-4312-4312-4312-431010101016-6816-6816-6816-687.57.57.57.536-
59、9436-9436-9436-945.05.05.05.057-21257-21257-21257-212（八）蛋白质电泳结果染色方法（八）蛋白质电泳结果染色方法1 1 1 1）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250R250(coomassie brilliant blue R250R250(coomassie brilliant blue R250R250(coomassie brilliant blue R250，简称简称简称简称CBB R250 ) CBB R250 ) CBB R250 ) CBB R250 )
60、 2 2 2 2）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝G250(G250(G250(G250(简称简称简称简称CBB G250)CBB G250)CBB G250)CBB G250)3 3 3 3）银染色法）银染色法）银染色法）银染色法考马斯亮蓝染色方法最为普遍，灵敏度较高，操作方便考马斯亮蓝染色方法最为普遍，灵敏度较高，操作方便考马斯亮蓝染色方法最为普遍，灵敏度较高，操作方便考马斯亮蓝染色方法最为普遍，灵敏度较高，操作方便银染灵敏度很高，操作繁琐银染灵敏度很高，操作繁琐银染灵敏度很高，操作繁琐银染灵敏度很高，操作繁琐考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250（三苯基甲烷）三苯基甲烷）三苯基甲烷）
61、三苯基甲烷）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250（二甲花青亮蓝）二甲花青亮蓝）二甲花青亮蓝）二甲花青亮蓝）1 1 1 1）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝R250(R250(R250(R250(三苯基甲烷，呈红蓝色三苯基甲烷，呈红蓝色三苯基甲烷，呈红蓝色三苯基甲烷，呈红蓝色) ) ) ) 特点特点特点特点 该染料每分子含有该染料每分子含有该染料每分子含有该染料每分子含有2 2 2 2个个个个SOSOSOSO3 3 3 3H H H H基团，偏酸性，结合在蛋基团，偏酸性，结合在蛋基团，偏酸性，结合在蛋基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上，且染料的苯环与芳香族氨基酸结白质的碱性基团上，且染
62、料的苯环与芳香族氨基酸结白质的碱性基团上，且染料的苯环与芳香族氨基酸结白质的碱性基团上，且染料的苯环与芳香族氨基酸结合，因此多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的合，因此多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的合，因此多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的合，因此多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色。它与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以染色。它与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以染色。它与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以染色。它与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被穿透凝胶，染胶效果好，染
63、色后为红蓝色，且可以被穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。 染色方法染色方法 ：1 1、在、在90ml90ml甲醇：水（甲醇：水（1:11:1，v/vv/v) )和和10ml10ml冰乙酸的混合冰乙酸的混合液中溶解液中溶解0.25g0.25g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250，用滤纸过滤染液以用滤纸过滤染液以除去颗粒状物质除去颗粒状物质。2 2、用至少、用至少5 5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇
64、动的平台上于室温染色平台上于室温染色1h1h以上。以上。3 3、回收染液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇、回收染液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇- -乙酸溶乙酸溶液中，平缓摇动液中，平缓摇动4-8h4-8h进行脱色，更换脱色液三四次。进行脱色，更换脱色液三四次。3 3 3 3）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝G250(G250(G250(G250(二甲花青亮蓝，呈蓝绿色二甲花青亮蓝，呈蓝绿色二甲花青亮蓝，呈蓝绿色二甲花青亮蓝，呈蓝绿色) ) ) )特点特点 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250在游离状态下呈红色，最大在游离状态下呈红色，最大光吸收在光吸收在488nm488nm；染色
65、灵敏度不如；染色灵敏度不如R250,R250,但与蛋但与蛋白质的结合反应十分迅速，当与蛋白质结合后白质的结合反应十分迅速，当与蛋白质结合后变为青色，变为青色，结合物在结合物在595nm595nm波长下有最大光吸波长下有最大光吸收。收。其光吸收值与蛋白质含量在一定范围内成其光吸收值与蛋白质含量在一定范围内成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。正比，因此可用于蛋白质的定量测定。G250G250也也可染胶，但染色过程慢且染色后背景高，脱色可染胶，但染色过程慢且染色后背景高，脱色困难。困难。 注意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基注意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此酸的含量不
66、同，因此G250用于不同蛋白质测定用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。，以减少这方面的偏差。4 4）银染色法）银染色法 此法较此法较CBB R250CBB R250灵敏灵敏100-1000100-1000倍，能检测倍，能检测0.1-1.0ng0.1-1.0ng蛋白与多肽，采用银盐对电泳条蛋白与多肽，采用银盐对电泳条带进行染色，一类使用银铵溶液；另一类带进行染色，一类使用银铵溶液；另一类使用硝酸盐。使用硝酸盐。1 1、搪瓷盘中倒入、搪瓷盘中倒入2000ml2000ml左
67、右左右70%70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定中，摇床上固定15min15min。3 3、190ml190ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入3.6%3.6%的的NaOH4.2mlNaOH4.2ml、20%AgNO20%AgNO3 33.6ml3.6ml、氨水、氨水2ml2ml混匀配成染色液。倒入染色液，染色混匀配成染色液。倒入染色液，染色30min30min。2、回收乙醇（可重复用、回收乙醇（可重复用3-5次），蒸馏水洗次），蒸馏水洗2遍，每遍遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净。尽可能把水倒净。4、倒掉染色液，蒸馏水洗、倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍遍，每遍2
68、-3min，尽可能把水倒净。，尽可能把水倒净。5 5、200ml200ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入1%1%柠檬酸钠柠檬酸钠1ml1ml，甲醛，甲醛100ul100ul混匀配成混匀配成显色液。倒入显色液显色至清晰。显色液。倒入显色液显色至清晰。6、倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗、倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍。遍。二.二.分子杂交分子杂交（molecular hybridizationmolecular hybridization）三.三.( (一一) ) 种类种类 1. 1. 按其分子种类划分按其分子种类划分 1 1） DNADNA杂交杂交探针为探针为DNADNA或或RNA RNA 2
69、 2） RNARNA杂交杂交探针为探针为DNADNA或或cDNAcDNA 3 3） 蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补的核核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补的核酸单链在一定的条件下酸单链在一定的条件下( (适宜的温度及离子强度等适宜的温度及离子强度等) )可可按碱基互补原则退火形成双链，具有高度特异性按碱基互补原则退火形成双链，具有高度特异性 。待测核酸序列及探针待测核酸序列及探针1 1）待测核酸序列：基因片段，基因组）待测核酸序列：基因片段，基因组DNADNA和细胞总和细胞总RNARNA。2 2）探针：用于检测的已知核酸片段称之
70、为探针）探针：用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)(probe)探针：探针： 为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性同标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性同位素，近年来也发展了一些非放射性标记物如位素，近年来也发展了一些非放射性标记物如地高辛、地高辛、生物素生物素等。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。等。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。 地高辛地高辛(Digoxigenin,DIG)一种从洋地黄类植物（毛地黄一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（和毛花毛地黄）中提取的类固
71、醇（Steroid）物质）物质，由于，由于洋地黄植物的花和叶片在自然界中的洋地黄植物的花和叶片在自然界中的唯一来源唯一来源，因此抗，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要异性标记的需要生物素生物素-亲合素系统亲合素系统(biotin-avidinsystem，BAS)生物素可以与生物素可以与亲和素亲和素、链霉亲和素链霉亲和素结合非常紧密结合非常紧密,比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的荧光或者二抗检测
72、。荧光或者二抗检测。蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体2. 2. 按样品制备过程划分按样品制备过程划分 1 1） 原位杂交原位杂交(in situ hybridization)(in situ hybridization) i. i. 原位菌落杂交原位菌落杂交：DNADNA探针与菌落探针与菌落DNADNA的杂的杂交。交。 ii. ii. 原位噬菌斑杂交原位噬菌斑杂交： DNADNA探针与探针与噬菌斑噬菌斑DNADNA的杂交。的杂交。 iii. iii. 原位细胞杂交原位细胞杂交：cDNAcDNA与细胞中的与细胞中的RNARNA杂交杂交 iv. iv. 原位组织块杂交：原位组织块杂
73、交：DNADNA探针与染色体探针与染色体DNADNA杂杂交。交。 以上都是以上都是原位裂解细胞，不需要分离原位裂解细胞，不需要分离DNADNA，RNARNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的定的DNADNA、RNARNA或蛋白质序列。或蛋白质序列。2 2）斑点杂交）斑点杂交(dot hybridization)(dot hybridization) 先分离先分离DNADNA，RNARNA或蛋白质，然后将样品液直接点或蛋白质，然后将样品液直接点在固
74、体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。3 3）转移杂交或印迹杂交）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization)(blotting hybridization) 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的到一定的固相支持物固相支持物上，然后与存在于液相中标记的上，然后与存在于液相中标记的探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。杂交方法。最常用的几种固相支持物最常用的几种固相支持物硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜(Nitrocellul
75、ose filter, (Nitrocellulose filter, NCF)NCF)可与三类大分子结合，但是不能结合小分子可与三类大分子结合，但是不能结合小分子DNADNA，RNARNA和蛋白质（和蛋白质（20,00020,000）尼龙膜尼龙膜尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物它有尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰，这特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰，这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。膜的膜的膜的膜的选择选择
76、选择选择尼龙膜尼龙膜尼龙膜尼龙膜硝酸纤硝酸纤硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜维素膜维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格便宜价格便宜价格便宜价格便宜特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜：（尼龙膜： 480480480480 g/cmg/cmg/cmg/cm2
77、2 2 2 ；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80808080 g/cmg/cmg/cmg/cm2 2 2 2 ）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度需要更大的机械强度( (三三) )分子杂交的一般程序分子杂交的一般程序 1) DNA1) DNA和和RNARNA的杂交的杂交 制备制备DNADNA或或RNARNA样品样品与固定基质结合与固定基质结合8080真空固定真空固定预杂交预杂交加入标记探针杂交加入标记探针杂交洗涤洗涤
78、放射自显影或显色反应。放射自显影或显色反应。 2 2）蛋白质的免疫分析）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品制备蛋白质样品与固定基质结合与固定基质结合常温空气中固定常温空气中固定封闭剂封闭封闭剂封闭 一抗反应一抗反应洗涤洗涤二抗二抗- -酶偶联物反应酶偶联物反应洗涤洗涤显显色反应（色反应（EIAEIA） 或或 一抗放射标记物一抗放射标记物洗涤洗涤放射自显影（放射自显影（RIARIA） （四）（四）（四）（四） 常见几种核酸分子杂交技术常见几种核酸分子杂交技术常见几种核酸分子杂交技术常见几种核酸分子杂交技术 1 1 1 1）Southern blotting Southern blotting So
79、uthern blotting Southern blotting ：1975197519751975年由年由年由年由E.SouthernE.SouthernE.SouthernE.Southern首先首先首先首先设计出来的一种用于检测设计出来的一种用于检测设计出来的一种用于检测设计出来的一种用于检测DNADNADNADNA样品中特异序列及其位置样品中特异序列及其位置样品中特异序列及其位置样品中特异序列及其位置的技术。的技术。的技术。的技术。2)Western blotting2)Western blotting杂杂交交杂交对象是蛋白质，是通过抗原抗体的免疫反应，从杂交对象是蛋白质，是通过抗原
80、抗体的免疫反应，从混合样品中检测出特异的目的蛋白。混合样品中检测出特异的目的蛋白。1 1先将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，先将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，2 2 然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。2 2 用待测目标蛋白的抗体（一抗）与固相膜上的蛋用待测目标蛋白的抗体（一抗）与固相膜上的蛋白质相互作用。白质相互作用。3 3 经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的第二抗与经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的第二抗与第一抗反应后的固相膜作用，如果一抗能与目标蛋第一抗反应后的固相膜作用，如果一抗能与目标蛋白结合，则二抗可以和第一抗结合，那么
81、二抗连接白结合，则二抗可以和第一抗结合，那么二抗连接的标记酶与显色底物反应呈现颜色，从而可以确定的标记酶与显色底物反应呈现颜色，从而可以确定固相膜上目标蛋白的位置及分子质量大小。固相膜上目标蛋白的位置及分子质量大小。WesternBlot一般流程一般流程n n蛋白样品的制备蛋白样品的制备蛋白样品的制备蛋白样品的制备（定量）（定量）（定量）（定量）n nSDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色转膜转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲将凝胶和固相基质
82、象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转液湿润滤纸之间，电转101030min30min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转移装置的缓冲液中，电转45min45min或过夜。或过夜。 转膜后检测转膜后检测n n丽春红丽春红S S染色染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。素滤膜，换水几次。封闭封闭n n脱脂奶粉（脱脂奶粉（5 5）n nBSABSAn nWestern Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提膜封闭液（生物试剂公司提供）
83、供）一抗、二抗孵育n n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以据滤膜面积以据滤膜面积以据滤膜面积以0.1ml/cm20.1ml/cm20.1ml/cm20.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜的量加入加入一抗溶液与滤膜的量加入加入一抗溶液与滤膜的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。温育。温育。温育。37373737，1 1 1 1小时，小时，小时，小时，4 4 4 4 过夜。过夜。过夜。过夜。n n倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶液，用倒掉一抗溶
84、液，用倒掉一抗溶液，用PBSPBSPBSPBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜漂洗液滤膜漂洗液滤膜3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次10min10min10min10min。n n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37,137,137,137,1小时，小时，小时，小时，4 4 4 4 过夜。过夜。过夜。过夜。n n倒掉二抗溶液，用倒掉二抗溶液，用倒掉二抗溶液，用倒掉二抗溶液，用PBSPBSPBSPBS漂洗液滤膜漂洗液滤膜漂洗液滤膜漂洗液滤膜3 3 3 3次，每次次，每
85、次次，每次次，每次10min10min10min10min。二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（辣根过氧化物酶法（HRPHRP）碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶法（APAP）化学发光法（化学发光法（ECL)ECL)ECL是指酶催化底物发荧光，荧光可使是指酶催化底物发荧光，荧光可使X光片曝光片曝光光,检测的下限可达到检测的下限可达到pg水平水平)三、三、DNADNA核苷酸序列的测序核苷酸序列的测序1 Sanger1 Sanger的双脱氧终止法的双脱氧终止法2 2 MaxamMaxam-Gilbert -Gilbert 化学修饰法化学修饰法3 DNA3 DNA序列的自动化分析序列的自动化
86、分析测序技术的建立测序技术的建立 DNADNA测序测序即即核酸核酸DNADNA分子一级结构的测定，是现代分子生分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术物学一项重要的技术。 19631963年，年，SangerSangerSangerSanger第一次完成胰岛素第一次完成胰岛素5151个氨基酸个氨基酸的序列测定的序列测定 70 70年代后期，年代后期，SangerSangerSangerSanger和和MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，等人又建立了核酸序列测定的方法，SangerSanger双脱氧双脱氧链链终止法和终止法和MaxamMa
87、xam-Gilbert-Gilbert化学裂解法将核酸序化学裂解法将核酸序列测定技术推进到列测定技术推进到“直读直读”阶段，使核酸序列测定阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。序列。O碱基碱基CPOHH12345O碱基碱基CPOHH12345OH脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接1 1、 SangerSanger的双脱氧终止法的双脱氧终止法O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPOHH12345H2O脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接
88、O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸? n n在在在在PCRPCRPCRPCR时加入扩增终止剂，比如时加入扩增终止剂，比如时加入扩增终止剂，比如时加入扩增终止剂，比如ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTPddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTPddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTPddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP（相应于（相应于（相应于（相应于4 4 4 4种碱基）种碱基）种碱基）种碱基）n n双脱氧核苷酸的两个作用：双脱氧核苷酸的两个作用：双脱氧核苷酸的两个作用：双脱氧核苷酸的两个作用：n n可以当作正常
89、碱基参与复制可以当作正常碱基参与复制可以当作正常碱基参与复制可以当作正常碱基参与复制n n一旦链入一旦链入一旦链入一旦链入DNADNADNADNA中，其后就不能再继续连接中，其后就不能再继续连接中，其后就不能再继续连接中，其后就不能再继续连接n n电泳电泳电泳电泳n n谁终止，碱基就是谁谁终止，碱基就是谁谁终止，碱基就是谁谁终止，碱基就是谁n n此方法获此方法获此方法获此方法获1974197419741974年的年的年的年的NobelNobelNobelNobel奖奖奖奖ATGCGGTACCAT53测序模板5四四套套反反应应体体系系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddA
90、TP2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP TA5TACGCCA5TACGCCATGGTATACTACGCTACGCC第一套反应第二套反应ACGTATGGTACCGCATTACCATGGCGTA模板互模板互补序列补序列待测序列待测序列Sanger法测序产物的平法测序产物的平均链长取决于均链长取决于ddNTP与与dNTP的比例，比例高的比例，比例高时，得到较短的产物时，得到较短的产物直读碱基序列直读碱基序列手工测序结果手工测序结果2 2、
91、 MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert化学裂解法化学裂解法 化学裂解化学裂解法是法是MaxamMaxam和和GilbertGilbert等人等人19771977年年创建的，用来测定创建的，用来测定DNADNA序列。化学法是用化学序列。化学法是用化学试剂在试剂在A A、G G、C C、T T处特定地裂解处特定地裂解DNADNA片段，产片段，产生一簇各种长度的短链，经过生一簇各种长度的短链，经过PAGEPAGE胶电泳后，胶电泳后，可以直接读出可以直接读出DNADNA的顺序。的顺序。 化学裂解法测序的原理化学裂解法测序的原理1 1、将标记、将标记DNADNA分为分为G G、A+GA+
92、G、C+TC+T、C 4C 4个反应体系个反应体系2 2、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNADNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNADNA片段片段的混合物的混合物3 3、电泳分离，得到互相错落的梯形图谱，即可读出、电泳分离，得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNADNA序列序列碱基特异性化学切割反应：碱基特异性化学切割反应：碱基特异性化学切割反应：碱基特异性化学切割反应：n n硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（硫酸
93、二甲酯（DMS DMS DMS DMS ）：使）：使）：使）：使DNADNADNADNA分子中鸟嘌呤（分子中鸟嘌呤（分子中鸟嘌呤（分子中鸟嘌呤（G G G G）上的）上的）上的）上的N N N N7 7 7 7原子甲基化。原子甲基化。原子甲基化。原子甲基化。n n肼：使肼：使肼：使肼：使DNADNADNADNA分子中胸腺嘧啶（分子中胸腺嘧啶（分子中胸腺嘧啶（分子中胸腺嘧啶（T T T T）和胞嘧啶（）和胞嘧啶（）和胞嘧啶（）和胞嘧啶（C C C C）的嘧）的嘧）的嘧）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只啶环断裂；但高盐条件下，只啶环断裂；但高盐条件下，只啶环断裂；但高盐条件下，只C C C C断裂，
94、而不与断裂，而不与断裂，而不与断裂，而不与T T T T反应。反应。反应。反应。n n哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。n n 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。碱基。碱基。碱基。G
95、 G反应：反应：DMSDMS使使G G在中性和高温条件下脱落。在中性和高温条件下脱落。G+AG+A反应：酸性条件（如甲酸）可使反应：酸性条件（如甲酸）可使A A和和G G嘌呤环嘌呤环上的上的N N原子质子化，利用哌啶使原子质子化，利用哌啶使A A、G G脱落。脱落。T+CT+C反应：肼（低盐）反应：肼（低盐）C C反应：肼（高盐）反应：肼（高盐）测定测定DNADNA长度长度250bp250bp。化学裂解法测序的原理示意图化学裂解法测序的原理示意图原理原理 基于基于 Sanger Sanger 双脱氧链终止法的原理，双脱氧链终止法的原理，只不过用四种不同的荧光染料分别标记只不过用四种不同的荧光染
96、料分别标记 ddATPddATP、ddTTPddTTP、ddCTPddCTP、ddGTPddGTP ，延伸中，延伸中的的 DNA DNA 互补链分别终止于不同荧光标记互补链分别终止于不同荧光标记的的 ddATPddATP、ddTTPddTTP、ddCTPddCTP、ddGTPddGTP 。这四。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，荧光，因而每一种荧光代表一种碱基因而每一种荧光代表一种碱基。 3 3 、DNADNA序列的自动化分析序列的自动化分析荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。除核苷酸序列文本
97、文件外，全自动测序仪还提供曲线图。四四 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction ，PCRPCR） 1 1、基本原理：基于、基本原理：基于DNADNA的半保留复制的半保留复制，两条链，两条链都可以作为模板。在体内，都可以作为模板。在体内，DNADNA复制是周期性复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；的，所以基因扩增的数量有限；PCRPCR技术在体技术在体外利用人工合成的引物，再加上外利用人工合成的引物，再
98、加上DNADNA聚合酶和聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使使DNADNA不断位于变性、复性和合成的循环中，不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增达到扩增DNADNA的目的。的目的。PCRPCR概念的提出概念的提出19831983，KaryKary Mullis Mullis MullisMullis最初使用的最初使用的DNADNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶 I I 的的KlenowKlenow片段，不耐高温片段，不耐高温。thermus aquaticusTaqTaq DNA DNA多聚酶多聚酶的发
99、现的发现19881988年年Saiki Saiki 等从温等从温泉中分离的一株水生泉中分离的一株水生嗜热杆菌嗜热杆菌( (thermusthermus aquaticusaquaticus) ) 中提取到中提取到一种耐热一种耐热DNADNA聚合酶。聚合酶。热稳定的聚合酶对简热稳定的聚合酶对简化化PCRPCR过程非常重要。过程非常重要。此酶具有以下特点：此酶具有以下特点： 耐高温，耐高温， 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。增反应后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度增加了扩增长度(
100、2.0Kb)(2.0Kb)。 在在19891989年，年，ScienceScience将将PCRPCR中的中的TaqTaq DNADNA聚合酶命名为当年的风云分子聚合酶命名为当年的风云分子。2 2、PCRPCR技术的过程技术的过程反复进行三步骤的循环过程：热变性反复进行三步骤的循环过程：热变性退火退火引引物延伸物延伸1）热变性：基因组）热变性：基因组DNA在在95度下加热度下加热5分，双螺旋结分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。构被热变性解链为两股单链。2）退火：将反应混合物降温至）退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述摄氏度，引物与上述单链单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，
101、上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模形成模板板引物复合物引物复合物。3 3）引物延伸：在）引物延伸：在DNADNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，从为原料，从引物引物33端开始，沿着端开始，沿着5353的方向，按照模板链的的方向，按照模板链的序列，合成一条新序列，合成一条新DNADNA链，其序列与模板序列互补。链，其序列与模板序列互补。 经上述变性经上述变性-退火退火-引物延伸这一循环，双引物延伸这一循环，双链链DNADNA拷贝数增加一倍。进行拷贝数增加一倍。进行n n次循环，拷贝数将增加次循环，拷贝数将增加2 2的的n n次方倍，如进行次方倍，如进行25302530
102、个循环，拷贝数即扩增上百个循环，拷贝数即扩增上百万倍。万倍。 模板：单链或双链模板：单链或双链DNADNA 引物：引物：16-30 16-30 bpbp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 DNADNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷酸底物：四种脱氧三磷酸核苷酸 （dNTPdNTP: : dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP、dGTPdGTP) ) MgMg2+2+： DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂PCRPCR基本要素基本要素9496949694969496 30303030 -3-3-3-3 预变性（使模板预变性（使模板预变性（
103、使模板预变性（使模板DNADNADNADNA充分变性）充分变性）充分变性）充分变性）94949494 30303030 变性变性变性变性50-6050-6050-6050-60 30303030 -1-1-1-1 复性（使引物与模复性（使引物与模复性（使引物与模复性（使引物与模板充分退火）板充分退火）板充分退火）板充分退火）72727272 n n n n ( ( ( (按按按按1 1 1 1 扩增扩增扩增扩增1kb1kb1kb1kb计算）延伸计算）延伸计算）延伸计算）延伸 72727272 3-73-73-73-7 总的延伸（使产总的延伸（使产总的延伸（使产总的延伸（使产物延伸完整）物延伸完
104、整）物延伸完整）物延伸完整）4-104-104-104-10 保存保存保存保存 25-25-3535个循个循环环PCR反应程序反应程序3 3、PCRPCR过程中注意事项过程中注意事项 ：1 1 1 1）复性和延伸）复性和延伸）复性和延伸）复性和延伸温度温度温度温度 复性的温度是复性的温度是复性的温度是复性的温度是 PCR PCR PCR PCR 扩增是否顺利的关键因素，通扩增是否顺利的关键因素，通扩增是否顺利的关键因素，通扩增是否顺利的关键因素，通常在常在常在常在 50-60 50-60 50-60 50-60 之间。具体的温度主要由引物的之间。具体的温度主要由引物的之间。具体的温度主要由引物
105、的之间。具体的温度主要由引物的 Tm Tm Tm Tm 值决定（低于值决定（低于值决定（低于值决定（低于Tm Tm Tm Tm 值值值值2-3 2-3 2-3 2-3 ）。）。）。）。 延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为 72 72 72 72 。如果复性的温。如果复性的温。如果复性的温。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法度，变成二步法度，变成二步法度，变成二步法 PCR P
106、CR PCR PCR 。2 2 2 2）反应）反应）反应）反应时间时间时间时间 变性一般使用变性一般使用变性一般使用变性一般使用 30 30 30 30 秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的 G+C G+C G+C G+C 含量含量含量含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有复性时间有复性时间有复性时间有 30 30 30 30 秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。 延伸时
107、间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 1kb 1kb 1kb 用用用用 1 1 1 1 分钟来保证充足的时间。分钟来保证充足的时间。分钟来保证充足的时间。分钟来保证充足的时间。 3 3 3 3）循环）循环）循环）循环次数次数次数次数 循环数通常为循环数通常为循环数通常为循环数通常为 2525252535353535 次。次。次。次。 平台效应（平台效应（平台效应（平台效应（plateau effectplateau effectplateau effectplateau eff
108、ect）：）：）：）：PCR PCR PCR PCR 扩增过程后期扩增过程后期扩增过程后期扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTPdNTPdNTPdNTP 和和和和 DNA DNA DNA DNA 聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出
109、现，产生的焦磷酸会出现，产生的焦磷酸会出现，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。度扩增产物变性不彻底。度扩增产物变性不彻底。度扩增产物变性不彻底。 4 4）引物设计的一般原则）引物设计的一般原则）引物设计的一般原则）引物设计的一般原则 长度：至
110、少长度：至少 16bp 16bp ，通常为，通常为 18-30bp18-30bp。 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链温度：两个引物之间的 Tm Tm 值差异最好在值差异最好在 2-5 2-5 。 对于小于对于小于 20 20 个碱基的引物其个碱基的引物其 Tm Tm 值可用简易公式计算，即值可用简易公式计算，即 Tm=4Tm=4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T）。）。 对于对于 20-70 20-70 个核苷酸的引物可用个核苷酸的引物可用 以下公式计算。以下公式计算。
111、 Tm=81.5+16.6Tm=81.5+16.6（1gK+1gK+）+0.41+0.41（G+CG+C）%-%-（675/N675/N）N N 表示引物的核苷酸数目，表示引物的核苷酸数目， K+ K+ 表示单价离子即钾离子表示单价离子即钾离子的浓度的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 33端）。端）。 G+C G+C 含量：尽量控制在含量：尽量控制在 40% 40% 至至 60% 60% 之间，之间， 4 4 种碱基的分布应种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续
112、排列，以及 T T 在在 3 3 末末 端的重复排列。端的重复排列。 引物的引物的 3 3 末端最好是末端最好是 G G 或或 C C ，但不要，但不要 GC GC 连排。连排。6 6 限制性酶切位点之前加保护碱基限制性酶切位点之前加保护碱基总体积总体积总体积总体积 50-100 50-100 50-100 50-100 l l l l 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 dNTPdNTPdNTPdNTP（底物）（底物）（底物）（底物） 引物引物引物引物 模板模板模板模板 DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 4 4、反应体系、反应体系注意：最后加入注意：最后加入注意：最后加入注意：最后加入
113、 DNADNA聚合酶，防止非特异性扩增聚合酶，防止非特异性扩增聚合酶，防止非特异性扩增聚合酶，防止非特异性扩增 缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的pHpHpHpH值和值和值和值和DNADNADNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂10mM 10mM 10mM 10mM TrisHClTrisHClTrisHClTrisHCl （ pH8.3-9.0pH8.3-9.0pH8.3-9.0pH8.3-9.0），），），），1.5mM1.5mM1.5mM1.5mM MgMgClCl2 2， 50mM K50mM K+ + dNTPdNT
114、PdNTPdNTP（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的 4 4 4 4 种种种种 dNTPdNTPdNTPdNTP，终浓度一，终浓度一，终浓度一，终浓度一般为般为般为般为 200mM200mM200mM200mM（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），dNTPdNTPdNTPdNTP 的浓度会影响扩增的的浓度会影响扩增的的浓度会影响扩增的的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。产量、特异性和忠实性。产量、特异性和忠实性。产量、特异性和忠实性。 引物：引物：引物：引物： 1 1 1 1M/LM/LM/LM/L 模板：模板
115、：模板：模板：单、双链单、双链单、双链单、双链DNADNADNADNA均可。均可。均可。均可。 模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响模板的数量会直接影响扩增的效果。扩增的效果。扩增的效果。扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性模板浓度过高会导致反应的非特异性模板浓度过高会导致反应的非特异性模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。增加。增加。增加。DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶：最常用的是最常用的是最常用的是最常用的是TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶，最适反应聚合酶，最适反应聚合酶，最适反应聚合酶，最适反应温度温度温度温
116、度75757575。PfuPfuPfuPfu DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶：是目前使用最广泛的具：是目前使用最广泛的具：是目前使用最广泛的具：是目前使用最广泛的具有有有有 3 3 3 3 -5-5-5-5 外切活性的外切活性的外切活性的外切活性的 PCR PCR PCR PCR 酶，目前为止酶，目前为止酶，目前为止酶，目前为止错配率错配率错配率错配率最低最低最低最低的高温的高温的高温的高温DNADNADNADNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降聚合酶。酶量增加使反应特异性下降聚合酶。酶量增加使反应特异性下降聚合酶。酶量增加使反应特异性下降; ; ; ;酶量过少影响反应产量。
117、酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。5 5、PCRPCR产物的克隆产物的克隆1 1 1 1添加限制性酶切位点添加限制性酶切位点添加限制性酶切位点添加限制性酶切位点 1 1 1 1）通过引物设计引入酶切位点）通过引物设计引入酶切位点）通过引物设计引入酶切位点）通过引物设计引入酶切位点 2 2 2 2）酶切位点应加在引物的）酶切位点应加在引物的）酶切位点应加在引物的）酶切位点应加在引物的5 5 5 5 端端端端 3 3 3 3）添加的酶切位点在扩增的）添加的酶切位点在扩增的）添加的酶切位点在扩增的）添加的酶切位点在扩增的DNADNADNADNA片断内部是否存在片断内部
118、是否存在片断内部是否存在片断内部是否存在 4 4 4 4）由于添加的酶切位点位于）由于添加的酶切位点位于）由于添加的酶切位点位于）由于添加的酶切位点位于DNADNADNADNA片断的末端，因此片断的末端，因此片断的末端，因此片断的末端，因此必须考虑末端长度对切割的影响。必须考虑末端长度对切割的影响。必须考虑末端长度对切割的影响。必须考虑末端长度对切割的影响。E HE H2 2T/A T/A 克隆克隆1 1）PCRPCR产物：产物： 主要适用于主要适用于TaqTaq DNA DNA聚合酶扩增产物。聚合酶扩增产物。 TaqTaq DNADNA聚合酶具有末端转移酶的活性，聚合酶具有末端转移酶的活性，
119、可在可在DNADNA片断的片断的3 3末端添加一个核苷酸，末端添加一个核苷酸，通常为通常为A A。55A33A2 2）T-T-载体载体pMD18-TVector是一种高效克隆是一种高效克隆PCR产物的专用载产物的专用载体。本载体由体。本载体由pUC18载体改建而成，在载体改建而成，在pUC18载体载体的多克隆位点处的的多克隆位点处的XbaI和和SalI识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在进行酶切反应后，再在两侧的两侧的3端添加端添加“T”而成。而成。载体特点：将普通的载体特点：将普通的克隆载体切成线状，并使之克隆载体切成线状，并使
120、之33末端含有一个突出碱末端含有一个突出碱基基T.T.可以大大提高可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。产物的连接、克隆效率。6 6 6 6、PCRPCRPCRPCR技术的特点技术的特点技术的特点技术的特点a a a a 高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性bb特异性特异性特异性特异性c c c c 操作简便易行操作简便易行操作简便易行操作简便易行dd用途广泛用途广泛用途广泛用途广泛生命学科生命学科生命学科生命学科医学工程医学工程医学工程医学工程遗传工程遗传工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断疾病诊断疾病诊断法医学法医学法医学法医学考古学考古学考古学考古学1 1) ) ) ) 长
121、片段长片段长片段长片段DNADNADNADNA的的的的PCRPCRPCRPCR扩增扩增扩增扩增 常规常规常规常规PCRPCRPCRPCR长度为长度为长度为长度为2kb2kb2kb2kb以下，长片段以下，长片段以下，长片段以下，长片段PCRPCRPCRPCR扩增存在的问扩增存在的问扩增存在的问扩增存在的问题；题；题；题；（1 1 1 1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低；）随着扩增片段的延长，扩增效率降低；）随着扩增片段的延长，扩增效率降低；）随着扩增片段的延长，扩增效率降低；（2 2 2 2）高温会损坏模板）高温会损坏模板）高温会损坏模板）高温会损坏模板DNADNADNADNA和和和和PCRP
122、CRPCRPCR产物；产物；产物；产物；（3 3 3 3）长片段）长片段）长片段）长片段DNADNADNADNA分子的变性比短片段困难，分子的变性比短片段困难，分子的变性比短片段困难，分子的变性比短片段困难，DNADNADNADNA聚聚聚聚合酶与模板合酶与模板合酶与模板合酶与模板DNADNADNADNA的趋近和接合变得困难。的趋近和接合变得困难。的趋近和接合变得困难。的趋近和接合变得困难。7 7、PCRPCR的类型的类型改进方法：改进方法： 采用混合采用混合采用混合采用混合DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 主体使用扩增效率高，延伸能力强的主体使用扩增效率高，延伸能力强的主体使用
123、扩增效率高，延伸能力强的主体使用扩增效率高，延伸能力强的TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶；少量使用具有聚合酶；少量使用具有聚合酶；少量使用具有聚合酶；少量使用具有3 3 3 35 5 5 5外切酶活性的外切酶活性的外切酶活性的外切酶活性的高温高温高温高温DNADNADNADNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。 购买商品化的长片段扩增酶。购买商品化的长片段扩增酶。购买商品化的长片段扩增酶。购买商品化的长片段扩增酶。 2)2)与反转录与反转录PCRPCR RT-PCRRT
124、-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):又称又称反转录反转录PCR, PCR, 是以反转录的是以反转录的cDNAcDNA作模板所进行的作模板所进行的PCRPCR，可对基因的表达和序列多态性分析。可对基因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶逆转录酶反转录反转录 T T TnTcDNA第一链第一链mRNA3)3)实时定量实时定量PCR( real-time PCR)PCR( real-time PCR)常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPC
125、R扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析定量定量PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量及定性分进行定量及定性分析析原理：原理：实时荧光定量实时荧光定量PCR技术，是指在技术，是指在PCR反应体系中反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。量分析的方法。定量曲线定量曲线 荧光定量定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：扩增曲线可以分成三个阶段：1）荧光背景信号阶段
126、（基线期）荧光背景信号阶段（基线期）在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。我们无法判断产物量的变化。2）荧光信号指数扩增阶段（对数期）荧光信号指数扩增阶段（对数期）只有在荧光信号指数扩增阶段，只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。段进行定量分析。3）平台期）平台期扩增产物已不再呈指数级的增加。扩增产物已不再呈指数级的增加。域值（域值（threshold）：将荧光信号由本底进入指数）：将
127、荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。一般荧光域值的设置是一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的基线（背景）荧光信号的标准偏差的标准偏差的10倍。倍。Ct值（值（Cyclethreshold）：荧光信号达到域值所）：荧光信号达到域值所对应的循环次数称为对应的循环次数称为Ct值。值。Ct值与模板起始拷贝值与模板起始拷贝数的负对数成线性关系，数的负对数成线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，Ct值值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐
128、曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代标代Ct值。值。荧光定量荧光定量PCR所使用的荧光化学物质可分为两种：所使用的荧光化学物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。荧光探针和荧光染料。SYBRSYBR荧光染料（荧光染料（ SYBR green )SYBR green )TaqManTaqMan 探针探针荧光标记方式荧光标记方式SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产产物的增加完全同步
129、。物的增加完全同步。TaqManTaqMan荧光探针荧光探针 ：PCRPCR扩增时在加入一对引物的同扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；淬灭基团吸收；PCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5533外切酶外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可
130、接收到荧光信号，基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条即每扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与了荧光信号的累积与PCRPCR产物形成完全同步产物形成完全同步。 TaqManTaqMan 探针探针工作原理工作原理五五 研究研究DNADNA与蛋白质及蛋白与蛋白之间相互与蛋白质及蛋白与蛋白之间相互作用的方法作用的方法凝胶阻滞试验（凝胶阻滞试验（gel retardation assay):gel retardation assay):DNaseIDNaseI 足迹试验（足迹试验（footprintingfootprint
131、ing assay): assay):免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术(Co-IP)(Co-IP) 凝胶阻滞试验（凝胶阻滞试验（gel retardation assay):gel retardation assay):当特定的当特定的DNADNA片段同细胞提取物混合后，若在凝胶片段同细胞提取物混合后，若在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它已同提取物中电泳中的移动距离变小了，就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。 DNaseIDNaseI 足迹试验（足迹试验（footprintingfootprinting assay): assay):当当
132、DNADNA片段与相应的序列特异性片段与相应的序列特异性DNADNA结合蛋白结合蛋白结合后，结合后，DNADNA结合蛋白可保护相应的结合蛋白可保护相应的DNADNA序列序列不受不受DNaseDNase攻击，因而在放射自显影图谱攻击，因而在放射自显影图谱上，上，DNADNA梯度条带梯度条带(DNA ladder)(DNA ladder)在相应于在相应于DNADNA结合蛋白的结合区中断，从而形成一空白区，结合蛋白的结合区中断，从而形成一空白区，恰似蛋白质在恰似蛋白质在DNADNA上留下的足迹，故称足迹上留下的足迹，故称足迹法法免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术(Co-IP)(Co-IP)将将靶靶蛋蛋白白抗抗体体连连接接到到固固体体基基质质上上，再再将将可可能能与与靶靶蛋蛋白白发发生生相相互互作作用用的的待待筛筛选选蛋蛋白白加加入入反反应应体体系系中中，用用低低离离心心力力沉沉淀淀或或微微膜膜过过滤滤法法在在固固体体基基质质和和抗抗体体的的共共同同作作用用下下将将蛋蛋白白复复合合物物沉沉淀淀到到试试管的底部或微膜上。管的底部或微膜上。免疫共沉淀免疫共沉淀示意图示意图 六、细菌的转化六、细菌的转化
