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1、第九章第九章 维生素生素类药物的分析物的分析 Chapter 9 Analysis of VitaminesVitamine A AVitamine B B1 1Vitamine C CVitamine E E 概述q维生素：生素：维持机体正常代谢必需的一类活性物质维持机体正常代谢必需的一类活性物质q均为人体必须且不能自身合成，结构和生理功能均为人体必须且不能自身合成，结构和生理功能各异各异q目前共目前共3030余种，以大写拉丁字母命名余种，以大写拉丁字母命名q通常按溶解性分为通常按溶解性分为脂溶性脂溶性维生素生素（A、D、E等）等）和和水溶性水溶性维生素生素（B族、族、C族等）族等）第一节第
2、一节 维生素维生素Av2-Cis Neovitamin Aav4-Cis Neovitamin Abv2,4-dicis Neovitamin Acv6-Cis Isovitamin Aav 2,6-dicis Isovitamin Ab维生素维生素A醇醇Retinol (Vit A alcohol)维生素维生素A 醋酸酯醋酸酯 （VA acetate）维生素维生素A 棕榈酸酯棕榈酸酯 (VA polmitate)912345678V it A3V it A1H2O-vit A: 具有共具有共轭多多烯醇醇侧链的的环己己烯具有多种异构体具有多种异构体（新新VA、异异VA）,其生物其生物效价和光谱
3、各有不同效价和光谱各有不同易发生脱氢、脱水、聚合易发生脱氢、脱水、聚合,得到脱氢维生素得到脱氢维生素A（vit A2)、去水维生素去水维生素A（vitA3）、）、鲸醇鲸醇性性质不溶于水，溶于有机溶剂不溶于水，溶于有机溶剂强紫外吸收强紫外吸收， max 325328nm不稳定：易被紫外光裂解，氧、氧化不稳定：易被紫外光裂解，氧、氧化剂等氧化剂等氧化可与可与SbCl3显色显色鉴别1）三氯化锑反应三氯化锑反应条件：无水、无醇条件：无水、无醇2）UVvit A max： 326nm加热后加热后（ vit A3） max: 348、367、389nm3）TLC无醇氯仿无醇氯仿含量表示含量表示I.U.(I
4、nternational Unit)效价效价 (I.U./g)维生素A的含量用生物效价即国际单位（IU/g）来表示1g pure VA acetate 2.907106 I.U. WHOVA acetateVA alcohol Potency (I.U./g) 2.9071063.331064. 效价效价测定定UV（三点校正法）、三三点校正法）、三氯化锑比色法氯化锑比色法、HPLC法法UV（三点校正法）三点校正法）1）前提条件：）前提条件：杂质的吸收在杂质的吸收在310340nm波波长范围内呈一条直线，且随波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；长的增大吸收度减小；物质对光的吸收具有加
5、和性：物质对光的吸收具有加和性：各波长处的吸收度是维生素各波长处的吸收度是维生素A与杂质吸收度的代数和与杂质吸收度的代数和4. 效价测定效价测定UV（三点校正法）、三氯化锑比色法三点校正法）、三氯化锑比色法、HPLC法法UV（三点校正法）三点校正法）第一步：第一步：A的的选择直接用测得的吸收度直接用测得的吸收度A还是校正后的还是校正后的A校？校？选择依据：依据：所选所选A值中杂质的干扰已基本消除值中杂质的干扰已基本消除第二步：求第二步：求注意注意： C为混合样品浓度为混合样品浓度2 2）计算步骤：）计算步骤：第三步：求效价第三步：求效价 参数参数 Vit A (醇) Vit A (醋酸酯) 1
6、 IU 0.300ug 0.344ug 效价标(IU/g) 3.33106 2.907106 (E1cm)标 1820 1530 (异丙醇，325nm) (环己烷中328nm) 1830 19001%换算因数=效价标(E1cm )标1%第四步：第四步：计算算标示量示量3）A值的的选择 第一法：第一法： (直接直接测定法，适用于定法，适用于维生素生素A醋酸醋酸酯) max在在326329nm ?否否第二法测定第二法测定是是A /A328-规定值规定值0.020.02是是用用A328计算计算E计算计算A校正校正3.52(2A328-A316-A340)、否否A校正校正-A328 A328f=用第二
7、法测定用第二法测定用用A A校正计算校正计算用用A328A328计算计算用第二法测定用第二法测定-15% -3% 0 3%-15% -3% 0 3%第二法：（皂化法，适用于第二法：（皂化法，适用于维生素生素A醇醇）第一法无法消除杂质干扰时用此法第一法无法消除杂质干扰时用此法 max在在323327nm ?否否分离纯化后测定分离纯化后测定是是A300/A3270.730.73计算计算A校正校正 6.815A325-2.555A310-4.260A334 、是是A校正校正-A325 A325f=否否分离纯化后测定分离纯化后测定用用A A校正计算校正计算用用A325A325计算计算 -3% 0 3%
8、-3% 0 3%用用A A校正计算校正计算讨论v维生素A醋酸酯的吸光度校正公式是用直线方程式法推导而来的，维生素A醇的吸光度校正公式是用相似三角形法推导而来的；v采用三点校正法，除其中一个点是在吸收峰波长处测得外，其它两点分别在吸收峰两侧的波长处测定，因此要求仪器波长准确；v中国药典（2005年版）收载的维生素A、维生素A胶丸、维生素AD胶丸、维生素AD滴剂均采用本法测定含量。例：维生素例：维生素AD胶丸的测定胶丸的测定已知：已知：w=0.1827g， 0.07985，标示量标示量10000IU，V=50ml，稀释倍数稀释倍数D50/2251） max在在326329nm以内，第一法计算以内，
9、第一法计算2）计算各波长与计算各波长与A328比值比值3） 340nm、360nm处差值超过规定的处差值超过规定的0.020.02，需计需计算校正吸收度算校正吸收度A校正校正 A校正校正3.52(2A328-A316-A340)0.6374） A校正校正与与A328比较比较： A校正校正-A328 A328 应以应以A校正校正计算计算 -3.925）计算计算 A校正校正/Cl= A校正校正/(w/VD) =61.876)计算效价及标示量计算效价及标示量 效价效价 1900117553IU/g 标示量效价标示量效价 /标示量标示量93.9Vit B1 盐酸硫胺Thiamine Hydrochlo
10、ride第二节第二节 Vit B1氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接成的季铵类化合物基连接成的季铵类化合物结构特点与鉴别结构特点与鉴别v噻噻唑环在唑环在碱性介质中可被高铁氰化钾等氧化剂氧化，碱性介质中可被高铁氰化钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的然后与嘧啶环上的-NH2缩合生成缩合生成具有荧光的硫色素具有荧光的硫色素，后者后者易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光，该反应又称，该反应又称为为硫色素荧光反应。为维生素硫色素荧光反应。为维生素B1所特有。所特有。 2. 性性质1）溶解性（）溶解性（盐酸酸盐）：易溶于水，溶液显酸性易溶于水，溶液显酸性2）硫
11、色素反）硫色素反应（特征反（特征反应）：）：噻唑环在碱性介质中可噻唑环在碱性介质中可被高铁氰化钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的被高铁氰化钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的-NH2缩合生成缩合生成具有荧光的硫色素具有荧光的硫色素，后者，后者易溶于异丁易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光醇中显强烈的蓝色荧光，该反应又称为，该反应又称为硫色素荧光硫色素荧光反应。为维生素反应。为维生素B1所特有所特有 NaOHH2O环化cyclization O2H硫色素硫色素 Thiochrome溶于丁醇，显蓝色荧光溶于丁醇，显蓝色荧光 be soluble in butanol and produce blue fluo
12、rescence3）生成沉淀反应）生成沉淀反应v分子结构中含有杂环，易与生物碱沉淀剂分子结构中含有杂环，易与生物碱沉淀剂 (碘化铋钾、碘化铋钾、碘化汞钾、苦味酸等碘化汞钾、苦味酸等)，硅钨酸，雷氏盐等作用形成组，硅钨酸，雷氏盐等作用形成组成恒定的沉淀。成恒定的沉淀。v 维生素维生素B1在碱性加热条件下反应放出在碱性加热条件下反应放出H2S，与，与Pb(Ac)2试液形成黑色试液形成黑色PbS4)紫外吸收特征：246nm的波长处测定吸光度，吸收系数为406436；5) 氯化物特性：本品为盐酸盐，其水溶液呈氯化物的鉴别反应；3. 鉴别1）硫色素反硫色素反应vit B1 醇层显蓝色荧光醇层显蓝色荧光（
13、硫色素硫色素） 荧光消失荧光消失2）沉淀反）沉淀反应 与与K2HgI4、KI-I、硅钨酸等硅钨酸等3）硝酸硝酸铅反反应 vitB1+NaOH Na2S PbS4 4）氯化物反化物反应 NaOH K3Fe(CN)6O正丁醇H+OH-Pb2+1）非水滴定法）非水滴定法 Vit B1+2HClO4 Vit B12HClO4 溶剂：溶剂：HAc，加，加Hg(Ac)2 T.S. 指示剂：喹哪啶红指示剂：喹哪啶红- -亚甲蓝混合指示剂亚甲蓝混合指示剂 终点：天蓝色，振摇终点：天蓝色，振摇30s30s不褪色不褪色2）UV维生素生素B1分子具有共分子具有共轭双双键结构，在紫外区有吸收。构，在紫外区有吸收。中国
14、中国药典典维生素生素B1片片剂和注射和注射剂含量的含量的测定定含量含量测定定3 3）硫色素荧光法）硫色素荧光法 原理：原理：vit B1 测定荧测定荧光光 （激发波长激发波长365nm，检测波长检测波长435nm） 方法方法： NaOH K3Fe(CN)6O异丁醇对照液对照液+ NaOH + 铁氰化钾铁氰化钾 + 异丁醇异丁醇 S + NaOH + 异丁醇异丁醇 d供试液供试液+ NaOH + 铁氰化钾铁氰化钾 + 异丁醇异丁醇 A + NaOH + 异丁醇异丁醇 b计算计算：特点特点： （1）灵敏度高，专属性强，代谢产物不干扰，）灵敏度高，专属性强，代谢产物不干扰，适用于体液分析适用于体液分
15、析 （2）非定量反应，只在一定条件下形成的硫色）非定量反应，只在一定条件下形成的硫色素与素与维生素生素B1浓度成正比，度成正比，操作繁琐，干扰因素操作繁琐，干扰因素多多第三第三节 Vit C612345v结构构v 又称又称L-抗坏血酸抗坏血酸v 结构与糖构与糖类相似相似v2.性性质和和鉴别v1）溶解性：易溶于水，水溶液酸性；乙醇中微溶；）溶解性：易溶于水，水溶液酸性；乙醇中微溶；三三氯甲甲烷或乙或乙醚中不溶中不溶v2）还原性（二原性（二烯醇基）：醇基）： 可被氧化成二可被氧化成二酮基基L-抗坏血酸抗坏血酸 L-去氢抗坏血酸去氢抗坏血酸 L-二酮古罗糖酸二酮古罗糖酸L-ascorbic acid
16、 L-dehydroascorbic acid L-anhydroascorbic acid 有生物活性有生物活性 有生物活性有生物活性 无生物活性无生物活性with biological activity with biological activity without biological activity 3）酸性：）酸性：C-3 pKa 4.17，C-2 pKa 11.57 通常显一元酸，可通常显一元酸，可与与Na2CO3成盐成盐4）水解性（内）水解性（内酯环）：）：强碱中水解开环强碱中水解开环5）旋光性：旋光性：6）糖）糖类性性质：vit C 蓝色色三氯醋酸或盐酸吡咯H2O50blu
17、e-3H2O糠醛furfural-CO2戊糖pentaose糖的反应糖的反应7）紫外吸收特性共轭双键，其稀盐酸溶液243nm中性、碱性265nm Fehling试剂试剂 Cu2O（红色）红色） （碱性酒石酸铜）（碱性酒石酸铜） AgNO3 Ag ( (黑色沉淀黑色沉淀) ) 2,6- -二氯靛酚二氯靛酚 酚亚胺酚亚胺( (褪色褪色) ) KMnO4 MnO2( (褪色褪色) ) 亚甲蓝亚甲蓝 ( (褪色褪色) )Vit C +含量含量Assay 碘量法碘量法原理：维生素原理：维生素C在醋酸酸性条件下，可被碘定量氧化在醋酸酸性条件下，可被碘定量氧化 淀粉指示剂淀粉指示剂测定注意事项：测定注意事项
18、：稀醋酸：酸性条件稀醋酸：酸性条件vit C被空气中被空气中O2氧化慢氧化慢 新沸过的冷水：减少水中氧的影响新沸过的冷水：减少水中氧的影响 立即滴定：避免被立即滴定：避免被O2氧化氧化 注射液中有注射液中有NaHSO3，可加入丙酮消除其干扰，可加入丙酮消除其干扰自身指示终点：滴定至溶液显红色自身指示终点：滴定至溶液显红色 注意事项：注意事项： 快速滴定：避免其他还原性物质干扰快速滴定：避免其他还原性物质干扰 方法专属性比碘量法高但需经常标定方法专属性比碘量法高但需经常标定2,6-2,6-二氯靛酚二氯靛酚高效液相色高效液相色谱法法v色谱条件： 色谱柱：ODS(4.6mm200mm,5m)； 流动
19、相：5mmol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH2.5）； 流速：1.0ml/min； 柱温：20； 检测波长：254nm专属性、线性、精密度与准确度、回收率与稳定性考察 日内RSD8.33% 日间RSD 4.36%第五节第五节 Vit ER1R2Vit E，生育酚醋酸酯，生育酚醋酸酯(dl-Tocopheryl Acetate) R1 R2 Synthetic Product content(%) Natural Product content(%)-Tocopheryl -CH3-CH3 52.0 68.0-Tocopheryl -CH3 -H 9.3 22.0-Tocopheryl -H-C
20、H3 28.0 5.0-Tocopheryl -H -H 10.7 5.0一、性一、性质及及鉴别1）溶解性：微黄色或黄色透明粘稠液体，）溶解性：微黄色或黄色透明粘稠液体，溶于乙醚、石油醚等溶于乙醚、石油醚等溶剂，不溶于水溶剂，不溶于水2）水解性（）水解性（酯键）：苯）：苯环上乙上乙酰化酚化酚羟基，基，酸酸/ /碱加热水解成生碱加热水解成生育酚育酚3）还原性（酚原性（酚羟基）：基）： 生育酚被光、氧氧化成生育醌生育酚被光、氧氧化成生育醌 硝酸反应：硝酸反应：vit E 生育红（橙红）生育红（橙红） 三氯化铁反应：三氯化铁反应： vit E 生育酚生育酚 生育醌生育醌+Fe2+ 红色红色4）UV：
21、max 284nm无水乙醇HNO3OKOHFe3+联吡啶v薄层色谱法： 硅胶G薄层板上，以环己烷-乙醚（4:1）为展开剂，展开1015min，晾干，喷浓硫酸显色，根据Rf定性鉴别。二、杂质检查：二、杂质检查：v酸度：检查制备过程中引入的游离醋酸方法： 取乙醇与乙醚各15mL，置锥形瓶中，加酚酞指示液0.5mL，滴加NaOH滴定液（0.1mol/L）至微显粉红色，加本品1.0g溶解后，用NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，不得过0.5mL.二、杂质检查：二、杂质检查： 游离生育酚的检查：游离生育酚的检查： 取取Vit E 0.1 g，加无水乙醇，加无水乙醇5 ml溶解后，加二苯胺溶解后，加二
22、苯胺T.S.1滴，用硫酸鈰滴定液滴，用硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸滴定，消耗硫酸鈰滴定液鈰滴定液(0.01mol/L)不得过不得过1.0 ml。 利用游离酚的还原性检查利用游离酚的还原性检查 指示剂：二苯胺（亮黄指示剂：二苯胺（亮黄灰紫）灰紫）固定液Stationary phase：5% SE30柱温Column temperature：5510检测器Detector：FID内标Internal standard：十六酸十六醇酯鈰量法(%) GC(%) 97.91 83.53 97.99 82.51 98.48 85.0914.54VE24.40IS VE丸剂GC法 VE(
23、纯品)测得量the amount determined (mg) 17.22 17.15加入量the amount added (mg) 17.3回收率recovery (%) 99.54 99.13Vit E (Chp 2005) System Suitability Tests SST以硅酮以硅酮(OV-17)(OV-17)为固定为固定相，涂布浓度为相，涂布浓度为2%2%；柱；柱温为温为265265，理论板数，理论板数按按V VE E峰计算，应不低于峰计算，应不低于500500，V VE E峰与内标峰的峰与内标峰的分离度应大于分离度应大于2 2。内标内标：正三十二烷：正三十二烷校正因子测定
24、校正因子测定v 取取正三十二正三十二烷适量，加正已适量，加正已烷溶解并稀溶解并稀释成每成每1ml中中含含1.0g的溶液，的溶液，摇匀，作匀，作为内内标溶液。另取溶液。另取Vit E对照品照品约20mg，精密称定，置棕色具塞，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精形瓶中，精密加入内密加入内标溶液溶液10ml，密塞，振，密塞，振摇使溶解；取使溶解；取13l注入气相色注入气相色谱仪，计算校正因子算校正因子测定法测定法Assayv取本品取本品约20mg，精密称定，精密称定，置棕色具塞置棕色具塞锥形瓶形瓶中，精密加入内中，精密加入内标溶液溶液10ml，密塞，振，密塞，振摇使溶使溶解；取解；取13l注入气相色注入气相色谱仪，测定，定，计算，即算，即得。得。
