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1、人冠状病毒病原学与实验室检测人冠状病毒病原学与实验室检测谭文杰谭文杰中国疾控中心病毒病所病毒病应急技术中心20120929冠状病毒（冠状病毒（coronavirus)概述： 1933年，Baudette等描述了鸡的“哮喘病”，1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒，分离的病毒被鉴定为传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis,IBV); 1951 年，Gledhill等分离出鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus,MHV)； 1965年，Tyrrell和 Bynoe首次在体外用人胎鼻和气管培养方法，从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。
2、1966年， Hamre 和Procknow用人胚肾细胞分离到类似病毒，代表株命名为229E病毒。 1967年，Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43（OC代表 organ culture）。随后证明，OC和229E病毒。 1968年， June Almeida和Tyrrell对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。 1975年，国际病毒命名委员会（International Committee on the Taxonomy of Viruses,ICTV）正式命名了冠状病毒科（
3、coronaviride)致病性：人冠状病毒常引起 1)普通感冒、是轻型感染。 2)腹泻或胃肠炎。3）下呼吸道感染或肺炎X1X2X3X4X5NME20,00130,0000.51.01.52.02.53.04.05.06.09.025,000SRNA 6123kBRNA 5RNA 4RNA 3RNA 28.3 kb4.5 kb3.4 kb2.5 kb1.7 kbSORF 1bORF 1aNMEABC15,00010,00015,00020,00025,00030,000HCoV 基因组与mRNAHCoVs为最大单股正链为最大单股正链RNA病毒，独特的胞浆内非连续性转录模式，易于发病毒，独特的胞
4、浆内非连续性转录模式，易于发生基因组的变异与重组生基因组的变异与重组SARS-CoV 中国大中国大陆 全中国全中国 全世界全世界发病病 5327 发病病 7429 发病病 8096死亡死亡 349 死亡死亡 685 死亡死亡 774涉及世界涉及世界29个国家和地区个国家和地区2002年冬2003年春始发于我国广东，而后蔓延至我国大部分省市，并波及世界29个国家和地区。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，严重急性呼吸综合症是由一种从未引起人类疾病的新型冠状病毒所致，这种新的病毒被命名为SARS-Coronavirus (SARS-CoV)SARS (severe acute respirat
5、ory syndrome)严重急性呼吸综合征严重急性呼吸综合征2121世纪新出现的传染病世纪新出现的传染病 在 SARS-CoV发 现 后 ， 又 有 三 种 新 的 引 起 呼 吸 系 统 疾 病 的HCoV（HCoV-NL63，HCoV-HKU1与HCoV-2012）被相继发现，引起人类呼吸道疾病的HCoV （包括SARS-CoV）已有6种，急需研发这类疾病诊断和鉴别诊断的新技术。继继SARS-CoV后后,新新HCoV病原的发现病原的发现HCoV-2012冠状病毒冠状病毒 NL63 van der Hoek et al., 2004. Nat. Med. 10:368-373最初从一名七月
6、龄的，因发烧、细支气管炎和结膜炎入院的患儿中分离。在Hela和TMK细胞中检测到细胞毒效应CPE。随机扩增，分离出特异性片段，经测序证明是一种新的呼吸道病毒。NL63的特异性RT-PCR检测儿童的 NPA为阳性。回顾性的分析从2002年12月到2003年2月中测序的呼吸道样本中，有7例阳性标本。其中五个患儿是4-6月龄，两个患者,分别是40岁和67岁。冠状病毒冠状病毒 HKU1 Woo et al., 2005. J. Virol. 79:884-895从一名71岁的患有肺炎的老人中分离出来。该患者吸烟，并患有慢性阻塞性肺病。临床症状：发烧，咳嗽，脓性痰，胸肺X光片显示有斑点浸润。常规病毒学检
7、测呈阴性。RT-PCR 确定是一种新的冠状病毒。回顾性筛选400份NPA样本，有一例是阳性，患者是一名35岁的妇女，患有肺炎。定量 RT-PCR： 1.1 x 106 copies/mL北北京京儿儿童童医医院院重重症症下下呼呼吸吸道道感感染染婴婴幼幼儿儿呼呼吸吸道道病病毒毒的的检检测测2008-2010年，采集住院病人鼻咽拭子370份，应用xTAG RVP Panel 试剂盒试剂盒进行多种呼吸道病毒检测。样品检出阳性率：样品检出阳性率：96.22%检测结果表明，感染率较高的病毒分别为：Piconavirus：54.05%RSVB： 46.49%Bocavirus： 33.78%PIV3: 15
8、.41%Adenovirus： 12.97%HMPV： 8.65%IFVA： 7.03%HCoVs： 6.76%xTAG Respiratory Viral Panel Version1 (RVP呼吸道病毒检测试剂盒)产品基于Luminex开放式结构平台，将xTAG 技术与xMAP 技术有效融为一体，可快速准确检测多种呼吸道病毒。已或美国FDA 批准临床应用l发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律病原谱病原谱年龄分布年龄分布发热呼吸道症候群病毒病原原谱的时间趋势发热呼吸道症候群病毒病原原谱的时间趋势2012中东出现的新型冠状病毒中东出现的新型冠状病毒近日，
9、一名曾前往沙特旅游的卡塔尔男子被确认感染了一种新型冠状病毒，也一度被媒体称为类似SARS病毒。目前这名男子正在英国接受治疗，生命垂危。其肺部组织提取的病毒与此前沙特曾出现的一个死亡病例相比，基因排序相似度为99.5%。两人的临床表现都是急性重症呼吸道感染合并急性肾衰竭。目前在全球只确认了这两个病例。还没有证据表明该病毒能够在人与人之间进行传播。新的冠状病毒和引起非典(严重急性呼吸系统综合征)的冠状病毒不同。Fig. Phylogenetic analysis based on 1a gene of coronaviruses and the new novel coronavirus基于已知序
10、列的基于已知序列的系统发生分析系统发生分析213London1与Bat-CoV-HKU5序列比对比对结果显示，London1与HKU5的相似性83.2%London1与Bat-CoV-HKU4序列比对比对结果显示，London1与HKU4的相似性82.7%Examples of bats and birds from which novel coronaviruses were discovered. Chinese horseshoe bat (Rhinolophus sinicus) (panel A), from which bat-SARS-CoV and bat-CoV HKU2 w
11、ere discovered; Lesser bamboo bat (Tylonycteris pachypus) (panel B), from which bat-CoV HKU4 was discovered; Leschenaults rousette (Rousettus lechenaulti) (panel C), from which bat-CoV HKU9 was discovered;A model of coronavirus evolutionA model of coronavirus evolutionCoVs in bats are the hypothesiz
12、ed gene pool of group 1 and group 2 CoVs and CoVs in birds are the hypothesized gene pool of group 3 CoVs.急性呼吸道感染诊断急性呼吸道感染诊断临床诊断非特异性实验室检测X-光检测特异性实验室检测呼吸道及血清样本用来:抗原检测病毒分离核酸扩增病毒分离病毒分离: 金标准金标准抗原检测抗原检测: 迅速，敏感迅速，敏感血清学抗体检测：血清学抗体检测：IgM检测检测; IgG检测检测:需要两个样本需要两个样本 中和试验中和试验核酸检测：核酸检测： 快速敏感快速敏感病毒诊断学病毒诊断学 潜伏期潜伏期
13、1-121-12 天天, ,平均平均 5-65-6 天天, ,潜伏期内无传染潜伏期内无传染性性, 发病发病 即有传染性即有传染性 若将一个传染周期定在若将一个传染周期定在 5-6 天天(平均潜伏期平均潜伏期), 发病发病 5 天内能确诊病人天内能确诊病人, 则可能将疫情有效控制在则可能将疫情有效控制在 2 代代病人以内病人以内实验室检测在实验室检测在SARS诊断中的重要作用诊断中的重要作用BSL-3 1 1SARSSARS诊断分类与标准诊断分类与标准（1 1）疑疑似似病病例例：对对于于缺缺乏乏明明确确流流行行病病学学依依据据，但但具具备备其其它它SARSSARS支支持持证证据据者者，如如临临床
14、床表表现现和和肺肺X X线线变变化化等等，可可以以作作为为疑疑似似病病例例，需需进进一一步步进进行行流流行行病病学学追追访访，并并安安排排病病原原及及血血清清学学检检查查以以求求印印证证。对对于于有有流流行行病病学学依依据据，有临床症状，但尚无肺部有临床症状，但尚无肺部X X线影像学变化者，也线影像学变化者，也应作为疑似病例。应作为疑似病例。（2 2）临临床床诊诊断断病病例例：对对于于有有SARSSARS流流行行病病学学依依据据、相相应应临临床床表表现现和和肺肺部部X X线线影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出SARSSARS临床诊断。临床诊断。
15、（3 3）确确定定诊诊断断：在在疑疑似似和和临临床床诊诊断断的的基基础础上上，若若分分泌泌物物或或血血清清SARS-CoV SARS-CoV RNARNA检检测测阳阳性性，或或血血清清（或或血血浆浆）SARS-CoVSARS-CoV特特异异性性N N蛋蛋白白抗抗原原检检测测阳阳性性，或或血血清清SARS-CoVSARS-CoV抗抗体体阳阳转转，或或抗抗体体滴滴度度4 4倍倍及及以以上上增增高高，则则可可做做出出确确定诊断。定诊断。SARSSARS的诊断标准的诊断标准呼吸道样本呼吸道样本拭子或抽吸物鼻咽拭子气管、支气管深部灌洗，肺泡灌洗液样本转移液SARSSARS实验室检测方法一览表实验室检测方
16、法一览表实验室检测方法一览表实验室检测方法一览表常用检测方法常用检测方法 检测所需时间检测所需时间 检测结果的解释及意义检测结果的解释及意义病毒核蛋白（病毒核蛋白（N）抗）抗原原ELISA检测检测 小时小时发发病病1-10天天（3-5天天敏敏感感）的的血血清清样样品品，阳阳性性有有诊诊断断意意义义。此此方方法比较敏感，用于早期诊断，方法稳定，受样品质量影响小。法比较敏感，用于早期诊断，方法稳定，受样品质量影响小。 病毒核酸实时病毒核酸实时PCR检检测测 小时小时发发病病期期3-10天天的的咽咽、肛肛拭拭子子及及血血清清样样品品，多多样样品品阳阳性性有有诊诊断断意意义义。此此方方法法用用于于早早
17、期期诊诊断断，方方法法较较稳稳定定，比比较较敏敏感感，但但受受样样品品质质量量影响大。影响大。病毒核酸常规病毒核酸常规PCR检检测测 小时小时同同上上，可可用用于于核核酸酸序序列列测测定定，核核酸酸测测序序有有诊诊断断意意义义。此此方方法法用用于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。 IgG和和IgM的的ELISA和和荧光检测荧光检测 小时小时发发病病10天天左左右右的的血血清清才才能能检检出出，4倍倍升升高高或或阳阳转转有有诊诊断断意意义义。此此方法用于中晚期诊断，方法较稳定。方法用于中晚期诊断，方法较稳定。 中和抗体的检测
18、中和抗体的检测3-5天天发发病病10-22天天血血清清能能够够检检出出，4倍倍升升高高有有诊诊断断意意义义。此此方方法法用用于于中中晚期诊断，方法较稳定。晚期诊断，方法较稳定。 病毒分离病毒分离5-10天天发病发病1-10天，咽肛拭子及血清样品，阳性有诊断意义。此方法天，咽肛拭子及血清样品，阳性有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，爱样品影响大。用于中晚期诊断，爱样品影响大。SARSSARS网络实验室检测内容与方法建议网络实验室检测内容与方法建议网络实验室检测内容与方法建议网络实验室检测内容与方法建议诊断时期诊断时期 内内 容容 方方 法法 标标 本本 早期诊断血清抗原 ELISA, PCR 血清
19、，鼻咽拭子发病 5 天以内 病毒核酸中期诊断病毒核酸 PCR, ELISA血清，鼻咽拭子发病10天以内 血清抗原 IFA, NT 粪便，肛拭，尿IgM, IgG & NAb晚期诊断 IgM, IgG & NAb ELISA, NT 血清，鼻咽拭子发病10天以上病毒核酸 PCR, IFA 粪便，肛拭，尿血清抗原 建议对不明原因重症肺炎常规进行血清建议对不明原因重症肺炎常规进行血清SARS-CoV N蛋白检测蛋白检测 HCoV（2012） 实验室检测实验室检测近期曾往中东地区，出现上呼吸道感染后，如果症状加重，或呼吸困难，建议立刻就诊并进行实验室检测。WHO发布了临时病例定义来帮助各国加强针对这种
20、新病毒的健康保护措施。基于目前发现的病例，分为“正在调查中的病人”、“可能病例”和“确诊病例”。病例的分类基于临床、流行病学和实验室检测指标。目前可进行分子检测（PCR与荧光定量PCR）London1_novel_CoV_2012_nsp12(partial)TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATCAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAA
21、CATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT (208 nt)lpartial nucleotide sequence of the viral polymerase (nsp12)系统发生分析系统发生分析HPA公布的结果，2012-9-25GenBank BLAST 比对结果1.2.London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列与与核苷酸序列与与SARS-CoV-Tor2 株相应区株相应区段同源性为段同源性为73.6%引物设计与应用起止位起止位点点引物对引物对引物序列引物序列(5-3)片段大片段大小小（bp）备注备注7208F-1R-1TG
22、CTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTACCCATAAGATGCGGATTATCAACA20126134F-2R-2ACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCTAGTACCAATGACGCAAGTCGCTCC10949荧光探针TZ1CTAATCGCCAGTACCATCAGTaqMan探针60荧光探针TZ2AGCACAATGACTAATCGCCATaqMan探针基于上述引物探针，我们已建立常规PCR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1; nested PCR: F-1,R-2； PCR片段127bp)两种荧光定量PCR方
23、法（ F-1,R-2，TZ1；或 F-2,R-2，TZ2)与其他人冠状病毒无交叉反应；可初步用于新型冠状病毒（2012）的实验室检测。引物设计与应用2引物对引物对引物序列引物序列(5-3)片段大小片段大小（bp）备注备注HKU4-f1HKU4-r1GACTAATCGTCAATATCACCACCCATTAAATGTGGACTC150Bat-CoV-HKU4检测HKU4-f2ACACCAGAAGAAGAAGAAGAC135（HKU4-r1合用）Bat-CoV-HKU4检测HKU5-f1HKU5-r1GACTGTTGCCGCAGAAACGATCACCCATCAAGTGAGGATTA185Bat-Co
24、V-HKU5检测HKU5-f1HKU5-r2GTGAGGATTATCAACATCCTTATAC170Bat-CoV-HKU5检测基于对London-1 Novel Coronavirus 已知序列与Bat-CoV-HKU多株序列比对，我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分别用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特异性检测。巢式巢式PCRPCR普通普通PCRPCRPCRPCR产物电泳或测序产物电泳或测序逆转录，获得逆转录，获得cDNAcDNA核酸提取核酸提取 荧光定量荧光定量PCRPCR 鼻咽拭子标本鼻咽拭子标本PCRPCR检测检测实验方案实验方案核酸核酸(基因基因
25、)检测检测基因扩增基因扩增(PCR) 靶序列模板DNA35个循环个循环340亿亿 拷贝拷贝标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒 可以确定存在感染可以确定存在感染PCR产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验冠状病毒检测通用引物对冠状病毒检测通用引物对: : Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-RV (5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3)Cor-RV (5-TCRCAYTT
26、DGGRTARTCCCA-3)冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit; QIAGEN) a 50 l reaction volume containing 10 L RNA-extract, 10 l 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 2 l dNTP mix (final concentration of 400 M of each dNTP), 1.8 l QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix (a combination of Omniscri
27、pt and Sensiscript reverse transcriptase and Hot-StarTaq DNA polymerase), 4 M of each primer, and RNase-free water to 50 l. The reaction was carried out with an initial reverse transcription step at 50C for 30min, followed by PCR activation at 95C for 15 min, 50 cycles of amplification (30 sec at 94
28、C; 30 sec at 48C; 1min at 72C), and a final extension step at 72C for 10min定量定量 PCR，TaqMan体系体系ABI 公司首先推出公司首先推出(PRISM 7000系列系列) 。实时检测实时检测: 每个循环都会产生与每个循环都会产生与PCR产物产物成正比的荧光物质成正比的荧光物质定量定量RT- PCR检测检测试剂盒：试剂盒：Real-Time One-Step RT-PCR Master Mix Real-Time One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems). 25
29、-L 25-L 反应体系含：反应体系含：12.5 L of 2X Master Mix, 0.625 L of the 40X MultiScribe and RNase Inhibitor mix, 0.25 L of 10 M probe, 0.25 L each of 50 M forward and reverse primers, 6.125 L of nuclease-free water, and 5 L of nucleic acid extract反应条件：反应条件：30 min at 48C （反转录）, 10 min at 95C ； 45 cycles of 15 s
30、at 95C and 1 min at 60C.对照设置：对照设置：HCoV 阳性模板；2个阴性模板（核酸提取开始）；无模板对照（PCR-扩增步骤）. 阳性结果判读阳性结果判读: :对照成立条件下， CT 45 cycles后续工作后续工作代获得全基因组序列后，进行进一步分析与引物优化设计验证，研制更好的分子检测试剂表达纯化结构抗原，制备单克隆抗体，研制免疫学检测试剂结合感染病例及相关样品，确定实验室检测规程。 SARS是否会再次出现？是否会再次出现？ ?研究表明，SARS-CoV是动物中SARS样冠状病毒在反复与人接触中跨种属突变后产生的。但对其原始宿主、中间宿主，以及如何跨种属突变造成人间流行尚不十分清楚，SARS再次出现的威胁依然存在！病毒病应急技术中心简介病毒病应急技术中心简介 位于昌平区中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所新址主楼5层西侧，总面积约为700平方米，含常规分子生物学、细胞培养、血清学及BSL-1、BSL-2及BSL-3（主楼6层）等病原研究实验室. 卫生部SARS 参比实验室设在本科室内；承担天花猴痘等重要病毒病的应急检测和相关的技术储备任务；同时开展病毒病预防控制新 技术及产品的研发等工作。谢 谢！41
