发育生物学第15章干细胞

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1、发育生物学第15章干细胞l早期胚胎早期胚胎细细胞是全能的胞是全能的,它既可它既可产产生体生体细细胞胞,又能又能产产生生殖生生殖细细胞胞, 包括从早期的卵裂球和囊胚期的包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细细胞以及后来胚胎的胞以及后来胚胎的3个个胚胚层层已分化后的生殖已分化后的生殖嵴嵴区的原始生殖区的原始生殖细细胞胞.l而分化的后代而分化的后代细细胞可从包括全能胞可从包括全能细细胞向多能胞向多能细细胞和胞和细细胞胞谱谱系的系的各各级级祖祖细细胞胞发发展展,这这些些细细胞仍旧可通胞仍旧可通过过均等和不均等两种分裂均等和不均等两种分裂方式方式进进行繁殖行繁殖,一直到最后的一直到最后的终终未分化体未分化

2、体细细胞。胞。l干干细细胞分胞分为为两两类类：l一一类类干干细细胞包括从早期囊胚胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细细胞分离并在体胞分离并在体外培养和建系的胚胎干外培养和建系的胚胎干细细胞胞(embryonic stem cells, ESC)和从胚胎生殖和从胚胎生殖嵴嵴原始生殖原始生殖细细胞胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖分离建系的胚胎生殖细细胞胞(embryonic germ cells, EGC)；l另一另一类类是先在成年是先在成年组织组织和器官和器官,以后在胎儿以后在胎儿组织组织被被证证明其存在明其存在,随后个随后个别

3、别也在体外培养和建系成功的干也在体外培养和建系成功的干细细胞胞, 称称为组织为组织干干细细胞胞(tissue stem cells) ,又称成体干又称成体干细细胞胞(adult stem cells) 。l二、干二、干细细胞胞(stem cells)与个体与个体发发育育l正常生物个体正常生物个体发发育的育的过过程是按程是按严严格的格的时时空程序空程序进进行的一系列行的一系列细细胞分裂、分化和胞分裂、分化和细细胞凋亡相互胞凋亡相互协调协调作用的作用的结结果。果。l从一个受精卵、全能胚胎干从一个受精卵、全能胚胎干细细胞或胞或组织谱组织谱系干系干细细胞最胞最终终分化分化为为具有独特功能体具有独特功能

4、体细细胞所胞所组组成的成的组织组织器官器官, 这这一一过过程通常被称程通常被称为为发发育的育的遗传遗传程序程序(genetic program) ,被被记录记录在在细细胞基因胞基因组组的的结结构中构中.不同物种有不同的不同物种有不同的遗传遗传程序。程序。l在哺乳在哺乳动动物个体物个体发发育的不同育的不同阶阶段段,包括胚胎、幼年和成年个体包括胚胎、幼年和成年个体的各个的各个发发育育时时期期,都存在着都存在着发发育潜能参差不同的干育潜能参差不同的干细细胞。胞。l干干细细胞最胞最终终演演变为变为独特独特结结构和功能的体构和功能的体细细胞或成熟生殖胞或成熟生殖细细胞胞,即即细细胞分化。从分子水平而言胞

5、分化。从分子水平而言,可以可以认为细认为细胞分化是部分基因胞分化是部分基因选择选择性地被激活或差异性表达性地被激活或差异性表达,从而控制从而控制专专一性蛋白一性蛋白质质的合成的合成和排布的和排布的结结果。果。对对正常正常细细胞分化来胞分化来说说,最重要的是多个基因表最重要的是多个基因表达达过过程在数量和程在数量和时时空上的精确空上的精确联联系和密切配合系和密切配合,并受不同并受不同层层次次的基因的基因调调控网控网络络系系统统精确无精确无误误地地调节调节和控制。和控制。 l三、胚胎干三、胚胎干细细胞研究胞研究简简史史l从从50年代开始年代开始,人人们们就就寻寻找既能在体外增殖找既能在体外增殖,又

6、具有胚胎又具有胚胎细细胞全能胞全能性性(totipotency)或多能性或多能性 (pluripotency),并通并通过过适当条件适当条件诱导诱导分化分化为为各各种种类类型分化型分化细细胞的模型。胞的模型。50年代末美国年代末美国发发育生物学家育生物学家Stevens 将着床将着床前前发发育育阶阶段的小鼠胚胎或段的小鼠胚胎或12天胚天胚龄龄的胚胎生殖的胚胎生殖嵴嵴移植到同系成移植到同系成年小鼠辜丸或年小鼠辜丸或肾脏肾脏被膜下被膜下,移植后移植后7天天,发现发现有有80%接种灶出接种灶出现现并并发发展展为为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细细胞胞(e

7、mbryonal carcinoma cell, EC)系。系。EC细细胞具有胞具有恶恶性生性生长长又具早期胚胎又具早期胚胎细细胞胞发发育育多潜能性的双重性多潜能性的双重性质质。70年代年代 EC细细胞常用作研究哺乳胞常用作研究哺乳动动物物发发育育遗传遗传以及以及细细胞分化的胞分化的实验实验模型模型, 后因后因EC细细胞核型异常胞核型异常,分化分化细细胞胞类类型有限等缺点而不再被使用。型有限等缺点而不再被使用。l80年代初年代初,英国英国Evans和及美国和及美国Martin 2家家实验实验室室独立地从小鼠囊胚独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖成功地建立了能在体外不断增殖,并并维维持

8、不分化状持不分化状态态的多潜能胚的多潜能胚胎干胎干(ES)细细胞系。胞系。90年代初年代初,美国美国Matsui等从小鼠等从小鼠9天胚胎生殖天胚胎生殖嵴嵴建立了多潜能的胚胎生殖建立了多潜能的胚胎生殖细细胞系。胞系。98年年美国威斯康星大学美国威斯康星大学Thomson等人利用等人利用36枚新枚新鲜鲜或或冻冻存的人工体外受精胚胎存的人工体外受精胚胎,获获得人得人ICM细细胞胞,经经体外培养体外培养,首次成功建立了首次成功建立了5株人株人类类ES细细胞系胞系,同年同年, John Hopkins医学院医学院Shamblott等人从等人从5 -9周人流胚胎的生殖周人流胚胎的生殖嵴嵴和和肠肠系膜首次培

9、系膜首次培养出人养出人EG细细胞系。胞系。l第二第二节节 胚胎干胚胎干细细胞胞l胚胎干胚胎干细细胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚胞是指早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细细胞分离培养和胞分离培养和建系的建系的细细胞。而从胚胎生殖胞。而从胚胎生殖嵴嵴中中PGC分离培养建成的称胚胎分离培养建成的称胚胎生殖生殖细细胞。胞。这这2类类干干细细胞胞统统称称为为胚胎性干胚胎性干细细胞。胞。l一、一、ES和和EG细细胞培养、建系技胞培养、建系技术术l体外培养建系技体外培养建系技术术以小鼠的最以小鼠的最为为成熟成熟,基本原基本原则则是有是有赖赖于于获获得得全能性胚胎全能性胚胎细细胞或胞或细细胞胞团团并建立体外适合其增殖

10、和抑制分化的并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系培养系统统。l由于早期胚胎由于早期胚胎细细胞离体后极易胞离体后极易发发生分化生分化,首先要解决阻止其分首先要解决阻止其分化、确保化、确保维维持其全能性或多能性持其全能性或多能性问题问题。目前常用的。目前常用的细细胞分化抑胞分化抑制物有制物有3种：种：饲饲养养层细层细胞胞(feeder layer cells)、特殊特殊细细胞的条件培液胞的条件培液(conditioned medium) ,如如BRL (Buffalo rat liver)细细胞条件培液胞条件培液,分化抑制分化抑制因子因子(differentiation inhibitory f

11、actor, DIF) ,如白血病抑制因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外此外,也有添加通也有添加通过过gp130信号信号转导转导途径的途径的细细胞因子胞因子,如白介素如白介素6 (lL一一6)、Oncostatin M和睫状神和睫状神经营经营养因子养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同等同样样可可维维持小鼠持小鼠ES细细胞的不分化胞的不分化.l体外培养体外培养ES和和EG细细胞可划分胞可划分为为两大两大类类：饲饲养养层层培养法和无培养法和无饲饲养养层层培养法。培养法。l(一一)饲饲养养层细层细

12、胞培养法胞培养法l不不论论ES细细胞或胞或EG细细胞胞,原代或初期培养原代或初期培养阶阶段一般都需依段一般都需依赖赖于能于能分泌使它分泌使它们们在体外存活和增殖所必需生在体外存活和增殖所必需生长长因子的因子的饲饲养养层细层细胞胞.l不同不同类类型的型的饲饲养养层细层细胞分泌的生胞分泌的生长长因子略有不同。但都要求在因子略有不同。但都要求在ES或或EG细细胞培养胞培养过过程中的程中的饲饲养养层细层细胞保持不分裂增殖胞保持不分裂增殖,而仍然而仍然保持保持细细胞的代胞的代谢谢活性。活性。l常用的常用的饲饲养养层细层细胞有下列两种胞有下列两种:l一种是取自各种品系小鼠交配后一种是取自各种品系小鼠交配后

13、12 dpc (days post coitum)的胚胎成的胚胎成纤维细纤维细胞胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝经丝裂霉素裂霉素C (mitomycin C)处处理理以以终终止止细细胞分裂后胞分裂后,用作用作ES细细胞培养的胞培养的饲饲养养层层。l另一种是来自另一种是来自SIM小鼠小鼠 (S)胚胎的胚胎的对对硫代硫代鸟鸟嘌嘌岭岭(thioguanine, T)和和乌乌本苷本苷(ouabain, O )有抗性的成有抗性的成纤维纤维STO细细胞系胞系,主要分泌干主要分泌干细细胞胞生生长长因子因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子和白血病抑

14、制因子(LIF)。 l(二二)无无饲饲养养层层培养法培养法l以添加某些特定以添加某些特定细细胞的条件培养液和胞的条件培养液和LIF生生长长因子至含胎牛血因子至含胎牛血清清(FCS)的正常培养液的正常培养液,替代替代饲饲养养层细层细胞。胞。l有有3种条件培养液可用于小鼠种条件培养液可用于小鼠ES细细胞培养：胞培养：l直接在直接在ES细细胞基胞基础础培养液中加入重培养液中加入重组组生生长长因子和因子和LIF等。等。lBuffalo大鼠肝大鼠肝细细胞条件培养液胞条件培养液(BRL-CM)。l2 -3周周龄龄幼年大鼠心肌幼年大鼠心肌细细胞条件培养液胞条件培养液(RH - CM) 。l一般以一般以2 -

15、3份上述份上述细细胞条件培养液加胞条件培养液加1 - 2份新份新鲜鲜的的ES细细胞培养胞培养液液,再添加再添加10% - 20%胎牛血清胎牛血清,共同共同组组合成无合成无饲饲养养层层的的ES 细细胞胞培养系培养系统统。l但在胚胎干但在胚胎干细细胞原代和建系初期缺乏胞原代和建系初期缺乏饲饲养养层时层时,用用这这种条件培种条件培养液培养养液培养ES和和EG细细胞成功率不高。胞成功率不高。l(三三) ES和和EC细细胞的体外培养胞的体外培养l1. ES细细胞胞l不同不同动动物物,甚至同种不同品系甚至同种不同品系动动物的胚胎物的胚胎发发育速度和方式存在育速度和方式存在着着较较大差异大差异, 如猪如猪I

16、CM细细胞生胞生长长与与 小鼠不一小鼠不一样样,生生长长速率慢速率慢,且且有一个休眠有一个休眠(quiescent)期。因此期。因此,ES细细胞培养建系需根据各个物种胞培养建系需根据各个物种而而选择选择不同不同发发育育阶阶段的早期胚胎。段的早期胚胎。l如一般小鼠多如一般小鼠多选选用用3 -4 d的囊胚或的囊胚或2 - 3 d的桑椹胚的桑椹胚,猪取猪取8 - 10 d 的囊胚的囊胚,绵绵羊取羊取8 -9 d的囊胚的囊胚,人和牛取人和牛取7 -8 d的囊胚。同的囊胚。同时时,经经体体外受精的胚胎或由核移植外受精的胚胎或由核移植获获得的重构胚胎在体外培养至所需适得的重构胚胎在体外培养至所需适当的当的

17、发发育育阶阶段也是段也是选选取取ES细细胞培养的有效材料来源。胞培养的有效材料来源。l基本培养液基本培养液为为含含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和疏基乙醇和50IV/mL青霉素、青霉素、50g/mL链链霉素的霉素的DMEM液液.将桑椹胚或囊将桑椹胚或囊胚接种于胚接种于预预先先铺铺有作有作为饲为饲养养层层而无有而无有丝丝分裂活性的分裂活性的单层单层MEF细细胞的胞的35 mm培养皿中。培养培养皿中。培养2 -3天后按下列方法之一分离出天后按下列方法之一分离出ICM细细胞胞进进一步培养一步培养.l方法一：免疫手方法一：免疫手术术法法(immunosurgery).l由于

18、由于4 - 4.5 dpc的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚的小鼠囊胚由己分化的滋养外胚层层(trophectoderm)和未分化的和未分化的ICM细细胞胞组组成成,前者前者细细胞表面一般已表达主要胞表面一般已表达主要组织组织相容性复合体相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC),能能识别识别其相其相应应抗抗体和形成免疫复合物体和形成免疫复合物,在在补补体存在体存在时时可可导导致致细细胞胞发发生免疫溶解生免疫溶解.l囊胚去除透明囊胚去除透明带带,直接暴露于稀直接暴露于稀释释的兔抗的兔抗JCR小鼠脾小鼠脾细细胞抗血胞抗血清清(抗抗H - 2b)。再移到新

19、再移到新鲜鲜豚鼠血清中豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚囊胚的滋养外胚层细层细胞呈胞呈泡状泡状,发发生免疫溶解生免疫溶解;而而ICM细细胞不具胞不具H -2b抗原抗原,不不发发生免疫溶生免疫溶解解,故故细细胞完整元胞完整元损损。ICM细细胞胞经经Hanks液洗液洗涤涤后后,移至移至96孔孔铺铺有有MEF或或STO饲饲养养层细层细胞和胞和DMEM基本培液的板内基本培液的板内进进一步培一步培养。养。 l方法二方法二:常常规规培养培养l桑椹胚或囊胚在桑椹胚或囊胚在铺铺有有MEF饲饲养养层层的的DMEM基本培养液中基本培养液中,未去未去透明透明带带的桑椹胚或囊胚培养的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细细

20、胞胞团团从从贴贴壁的囊胚内壁的囊胚内长长出来。吸出出来。吸出ICM细细胞胞团团,用用0.25% (m/V)胰蛋白胰蛋白酶酶(trypsin)和和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在混合消化液在370C消化消化5 min.部分解离的部分解离的细细胞胞团团移至移至铺铺有有MEF饲饲养养层层的的24孔培养板孔培养板, ICM细细胞首先出胞首先出现贴现贴壁生壁生长长,继续继续培养培养4 d,可在一些孔内可在一些孔内见见到巢状集落生到巢状集落生长长的的ES细细胞胞团团.用胰蛋白用胰蛋白酶酶消化巢状消化巢状ES细细胞胞团团,并并继续继续培养培养,一般一般4 -5 d间间隔用隔用胰蛋白胰蛋白酶酶消化消

21、化,克隆和克隆和纯纯化化ES细细胞胞,视视ES细细胞密度逐胞密度逐渐转渐转移到移到较较大容大容积积的培养皿或培养瓶。的培养皿或培养瓶。lES细细胞在培养胞在培养过过程中程中,有有时时在巢状干在巢状干细细胞胞团团周周边边出出现现少量分化少量分化细细胞胞,这时这时除了需除了需继续维继续维持持饲饲养养层细层细胞外胞外,在培液中再添加适量在培液中再添加适量的的LIF生生长长因子因子,可克服可克服细细胞胞进进一步分化的一步分化的现现象。象。lES细细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种主要有多种生生长长因子因子,例如表皮生例如表皮生长长因子因子(ECF

22、) ,可促可促进细进细胞胞DNA合成和合成和 mRNA转录转录,使使细细胞周期的胞周期的S期提前期提前,周期周期缩缩短短;胰胰岛岛素素样样生生长长因因子子(ICF)对对ICM细细胞有促胞有促进进增殖作用增殖作用; 干干细细胞生胞生长长因子因子(SCF)对对干干细细胞有胞有调调控和促分裂作用控和促分裂作用,同同时时可抑制可抑制细细胞凋亡。此外胞凋亡。此外,在培在培液中液中还还需添加需添加还还原原剂剂-巯巯基乙醇基乙醇,可使血清中的含硫化合物可使血清中的含硫化合物还还原原成谷胱甘成谷胱甘肽肽,以消除以消除ES细细胞培养胞培养过过程中程中产产生的毒性生的毒性过过氧化物氧化物,同同时时,-巯巯基乙醇有

23、基乙醇有诱导细诱导细胞增殖和促胞增殖和促进进胚胎胚胎细细胞胞贴贴壁作用。壁作用。l 2. EG细细胞胞lPGC取材根据其在不同物种的早期胚胎中所取材根据其在不同物种的早期胚胎中所处处迁移位置而定。迁移位置而定。l小鼠小鼠EG细细胞建系基本胞建系基本过过程如下：收集程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc小鼠胚胎小鼠胚胎,在解剖在解剖镜镜下用下用镊镊子剖取包含原始生殖子剖取包含原始生殖细细胞胞(PGC)的生殖的生殖嵴组织嵴组织,以以0.02% EDTA液孵育含液孵育含PGC细细胞的生殖胞的生殖嵴组织嵴组织,37 0C, 15 min.吸管吸管轻轻吹打散吹打散,接种于接种于铺铺有有MEF或或S

24、TO饲饲养养层细层细胞的胞的4孔培养板孔培养板内。接种内。接种细细胞首先出胞首先出现贴现贴壁生壁生长长,每天或隔天更每天或隔天更换换培养液。培养液。l生殖生殖嵴组织嵴组织培养物在培养物在饲饲养养层细层细胞上分裂增殖胞上分裂增殖,4 - 6 d后在后在显显微微镜镜下将包含原始生殖下将包含原始生殖细细胞的胞的细细胞胞团团用胰蛋白用胰蛋白酶酶消化并消化并转转移至新的移至新的饲饲养养层细层细胞上胞上,继续继续培养增殖。培养增殖。l重复用胰蛋白重复用胰蛋白酶酶消化并移至新的消化并移至新的饲饲养养层细层细胞胞,经过经过同上同上2 -3次次过过程程,可可产产生巢状生巢状(nests)生生长长的干的干细细胞集

25、落。最后将它胞集落。最后将它转转移到移到铺铺有有饲饲养养层细层细胞的培养瓶内胞的培养瓶内进进一步一步扩扩增。增。lEG细细胞的胞的饲饲养养层层常用常用STO细细胞胞,培养液基本同培养液基本同ES细细胞胞,但除但除LIF外外还还要添加干要添加干细细胞因子胞因子(SCF)和碱性成和碱性成纤维细纤维细胞生胞生长长因子因子(bFGF)。l二、二、ES和和EG细细胞系基本特性胞系基本特性l(一一)体外能无限增殖体外能无限增殖l建系后的建系后的ES细细胞在体外培养不胞在体外培养不仅仅能存活能存活,还还能无限增殖能无限增殖,是干是干细细胞自我更新特性在体外培养中的延胞自我更新特性在体外培养中的延续续。但。但

26、实际实际上上,传传代次数愈代次数愈多多,ES细细胞会像常胞会像常规细规细胞一胞一样样,出出现现核型不正常的情况核型不正常的情况,并失去了并失去了ES细细胞原有的一些重要特性。胞原有的一些重要特性。l129品系小鼠的品系小鼠的ICM细细胞非常容易建立胞非常容易建立ES细细胞系胞系,而其他品系的而其他品系的小鼠不容易小鼠不容易,说说明明遗传遗传因素制因素制约约ES细细胞建系。胞建系。l(二二)体外体外产产生分化生分化细细胞胞l产产生分化生分化细细胞是干胞是干细细胞基本特性在体外培养中的延胞基本特性在体外培养中的延续续。由于早。由于早期胚胎期胚胎细细胞离体后极易胞离体后极易发发生分化生分化,因此因此

27、,ES和和EG细细胞体外培养的胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保维维持其多能性持其多能性的培养体系。的培养体系。lICM细细胞一般接种于胞一般接种于铺铺有有灭灭活的小鼠活的小鼠MEF细细胞作胞作为饲为饲养养层层的的琼琼脂平板上脂平板上,加有含抑制分化的加有含抑制分化的LIF的培养液的培养液,或再添加适当的分化或再添加适当的分化诱导诱导物物质质(如如维维甲酸等甲酸等),或通或通过悬过悬滴培养成滴培养成拟拟胚体胚体 (embryoid bodies, EB)等等,易分化易分化产产生包括生包括3个胚个胚层层的各种的各种类类型的分化型的分化

28、细细胞胞,常常见见的是的是几种几种类类型型细细胞混在一起胞混在一起,单单一一类类型型细细胞要靠定向胞要靠定向诱导诱导分化分化. l体外培养的体外培养的ES细细胞也能胞也能产产生雌、雄两性的生殖生雌、雄两性的生殖细细胞胞,实现实现了体了体外培养的外培养的ES细细胞也能表达胞也能表达全能性全能性 (totipotency)概念概念l(三三)体内体内产产生畸胎瘤生畸胎瘤lES和和EG细细胞若接种于免疫缺胞若接种于免疫缺损损小鼠小鼠(裸鼠或裸鼠或SCID小鼠小鼠)腋腋窝窝下下,或接或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝窝和器官包膜下和器官包膜下,均可形成由均可形成由内胚内胚层层

29、、中胚、中胚层层和外胚和外胚层层多种多种类类型型细细胞构成的畸胎瘤。后者通胞构成的畸胎瘤。后者通过组织过组织学学检查检查, 可以用作分析和可以用作分析和鉴鉴定定ES或或EG细细胞的胞的发发育多潜育多潜能性能性,判断所判断所产产生分化生分化细细胞种胞种类类的多寡。的多寡。l(四四)巢状生巢状生长长有多能胚胎干有多能胚胎干细细胞分子胞分子标记标记lES和和EG细细胞在体外彼此呈胞在体外彼此呈现单层现单层或多或多层紧层紧密堆密堆积积,而形成而形成岛岛状状或巢状集落群体的生或巢状集落群体的生长长形形态态。将。将这这种种岛岛状或巢状群体状或巢状群体细细胞的克胞的克隆挑出隆挑出,用胰蛋白用胰蛋白酶酶轻轻度

30、消化后接种于新的度消化后接种于新的饲饲养养层层或特定的条或特定的条件培养液中件培养液中,继续继续培养培养3 -4天后天后,分散的分散的ES细细胞或胞或EG细细胞又重新胞又重新长长出彼此出彼此紧紧密接触的密接触的岛岛状或巢状群体状或巢状群体细细胞克隆。胞克隆。l巢状集落生巢状集落生长长是是ES和和EG细细胞最具特征性的生胞最具特征性的生长长方式。不同方式。不同动动物物ES和和EG细细胞巢状集落有所不同胞巢状集落有所不同.如猪如猪EG细细胞集落常是胞集落常是圆圆的的,比小比小鼠鼠ES和和EG细细胞集落胞集落较较扁平和扁平和较较不透明不透明.l小鼠、猪和人小鼠、猪和人类类等灵等灵长类动长类动物的物的

31、ES和和EG细细胞都具有特征性的胞都具有特征性的多能胚胎干多能胚胎干细细胞的分子胞的分子标记标记, 表表19.2.l除牛的除牛的ES细细胞不表达碱性磷酸胞不表达碱性磷酸酶酶(AKP)活性外活性外,其他其他动动物和人物和人的的ES或或EG细细胞都表达胞都表达AKP的活性。分化的的活性。分化的ES或或EG细细胞都不胞都不表达表达AKP。因此因此,AKP活性可作活性可作为为ES或或EG细细胞是否分化的重要胞是否分化的重要标记标记之一。之一。l胚胎胚胎发发育育阶阶段特异性抗原段特异性抗原(stage specific embryonic antigen, SSEA)是早期是早期胚胎胚胎细细胞表面的一胞

32、表面的一类类糖蛋白糖蛋白,不同种不同种类类的的SSEA因糖基化不同而因糖基化不同而区分区分为为SSEA -1、SSEA -3和和SSEA -4不同的表位分子。未分化不同的表位分子。未分化的早期胚胎的早期胚胎细细胞胞 SSEA呈阳性呈阳性,而分化的而分化的细细胞胞为为阴性。人和灵阴性。人和灵长长类类ES细细胞表达胞表达SSEA -3和和SSEA -4,而而SSEA-1仅仅在人在人EG 细细胞及胞及刚刚开始分化的开始分化的ES细细胞中表达。小鼠的胞中表达。小鼠的ES和和EG细细胞只表达胞只表达SSE A-1.l肿肿瘤相关抗原瘤相关抗原(tumor related antigen, TRA)是一种是

33、一种对对唾液酸唾液酸酶酶敏感的敏感的细细胞表面糖蛋白胞表面糖蛋白,生殖生殖细细胞胞肿肿瘤瘤标记标记(germ cell tumor marker, GCTM)是是另一另一类类抗原决定簇不同于抗原决定簇不同于TRA的的细细胞表面糖蛋白。人及猴的胞表面糖蛋白。人及猴的ES细细胞与胞与TRA -1 -60、TRA -1 - 80和和GCTM -2抗体均可起反抗体均可起反应应。人与猴是近人与猴是近亲亲,因此因此,人与猴的人与猴的ES细细胞都表达胞都表达 TRA分子分子,而而啮齿动啮齿动物小鼠却缺物小鼠却缺(见见表表19.2),推推测测TRA可能是灵可能是灵长类长类多能胚胎干多能胚胎干细细胞特胞特异性的

34、分子异性的分子标记标记。lOct -4是生殖系是生殖系专专一性一性转录转录因子因子,在小鼠胚胎在小鼠胚胎发发育早期、生殖育早期、生殖细细胞胞谱谱系以及体外培养的多能胚胎干系以及体外培养的多能胚胎干细细胞中特异地表达胞中特异地表达,被被认为认为是是全能和多能性的一种全能和多能性的一种标标志基因。小鼠、猪和包括人志基因。小鼠、猪和包括人类类在内的灵在内的灵长类动长类动物的物的ES和和 EG细细胞都表达胞都表达Oct - 4。l(五五)染色体数目和核型正常染色体数目和核型正常l无无论论是小鼠或人的是小鼠或人的ES和和EG细细胞胞,经经体外体外传传代培养后代培养后,具有正常的具有正常的染色体数目和二倍

35、体核型染色体数目和二倍体核型,即使即使冻冻存复存复苏苏后后应应仍然保持仍然保持这这种特性种特性.l新建立的新建立的ES细细胞系常有不正常的核型胞系常有不正常的核型,因此因此,需需对对新建系的新建系的ES细细胞胞进进行染色体数目和核型行染色体数目和核型进进行分析确行分析确认认。l(六六)遗传遗传可操作性可操作性lES细细胞胞遗传遗传操作的可行性是由于操作的可行性是由于ES细细胞在体外可以不断地自胞在体外可以不断地自我增殖我增殖,又是具有又是具有发发育的全能或多能性育的全能或多能性, 并能通并能通过过构建嵌合体而构建嵌合体而产产生有功能的生殖生有功能的生殖细细胞。胞。这为这为通通过过基因工程途径改

36、造物种提供基因工程途径改造物种提供了独特的、无与了独特的、无与伦伦比的受体比的受体细细胞。胞。lES细细胞胞遗传遗传操作主要有操作主要有2类类方法：一是通方法：一是通过过同源重同源重组组技技术术去剔去剔除除ES细细胞基因胞基因组组的一个目的基因的一个目的基因,所所谓谓基因剔除基因剔除(knock out);二二是是转转染一个外源基因定点整合到染一个外源基因定点整合到ES细细胞基因胞基因组组的正确位置的正确位置,所所谓谓基因定点敲入基因定点敲入(knock in)技技术术。l(七七)形成嵌合体形成嵌合体实现实现种系种系传递传递l参与嵌合体参与嵌合体实现实现种系种系传递传递是是ES细细胞生物学的重

37、要概念。胞生物学的重要概念。l只有通只有通过过形成嵌合体形成嵌合体实现实现种系种系传递传递即要分析干即要分析干细细胞是否能参与胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能形成生殖腺中卵子和精子才能鉴鉴定体外培养建系的定体外培养建系的ES和和 EG细细胞是否具有全能性。胞是否具有全能性。l三、三、ES和和EG细细胞定向胞定向诱导诱导分化分化l(一一)基本原理基本原理l细细胞胞诱导诱导分化是一个分化是一个细细胞与其微胞与其微环环境相互境相互间间复复杂杂而又精密而又精密协调协调的分子的分子细细胞学胞学过过程。程。l早在早在20世世纪纪六七十年代前六七十年代前,实验实验胚胎学家就胚胎学家就发现发现蛙蛙类类早

38、期原早期原肠肠胚胚(gastrula)的背唇的背唇(dorsal lip)背方区域能背方区域能够诱导够诱导外胚外胚层层分化分化为为神神经经管管,而靠近腹而靠近腹侧侧面面则诱导则诱导出尾部出尾部结结构。接着又构。接着又发现发现胚胎胚胎发发育中育中组织发组织发生和身体构造形成是一生和身体构造形成是一连连串的串的诱导连锁过诱导连锁过程程, 如神如神经组织经组织听囊形成后听囊形成后,则诱导邻则诱导邻近的近的间质细间质细胞形成胞形成软软骨囊骨囊;水晶体水晶体则则剌激覆盖的外胚剌激覆盖的外胚层诱导层诱导出角膜出角膜. l在体胚胎在体胚胎细细胞分化胞分化过过程中程中, 诱导诱导作用的作用的结结果不只是决定于

39、各种果不只是决定于各种诱导诱导物物质质的性的性质质和和专专一性一性,同同时时也决定于被也决定于被诱导细诱导细胞的反胞的反应应能能力力(competence),后者受后者受遗传遗传、发发育潜能等内在因素的限制。育潜能等内在因素的限制。lES细细胞是体外研究胞是体外研究诱导诱导分化的分化的较较理想的模型。理想的模型。l在胚胎在胚胎细细胞被胞被诱导诱导分化中分化中,所用所用诱导诱导物物质质种种类类繁多繁多, 大致分两大致分两类类:l一一类类是使被是使被诱导细诱导细胞可逆性地胞可逆性地轻轻度度损伤损伤:例如无机物、有机酸、例如无机物、有机酸、醇、醇、亚亚甲基甲基盐盐、硫、硫氢氢化物、氨水甚至蒸化物、氨

40、水甚至蒸馏馏水或缺水或缺钙钙的的盐盐水水,都都能使两栖能使两栖类类胚胎胚胎细细胞渗透胞渗透压压改改变变致成致成轻轻度度损伤损伤,导导致神致神经细经细胞胞分化。分化。 l另一另一类诱导类诱导物物,如如类类固醇激素、固醇激素、维维甲酸衍生物甲酸衍生物(RA等等) ,多多肽肽生生长长因子因子(bFGF、TGF、Activin)等等,则则是通是通过过与被与被诱导细诱导细胞表面胞表面各自的受体各自的受体结结合而介合而介导导的的细细胞胞诱导诱导分化。同一种分化。同一种诱导诱导物可以物可以诱诱导导出不同出不同类类型型细细胞或胞或变变化多端的构造。化多端的构造。lES和和EG细细胞定向胞定向诱导诱导分化是当前

41、分化是当前ES细细胞生物学研究中的胞生物学研究中的热热点点之一。之一。 l(二二)定向定向诱导诱导分化的分化的类类型型l体外定向体外定向诱导诱导分化可分分化可分为谱为谱系分化系分化(lineage differentiation)和定向分和定向分化化(committed differentiation)。l谱谱系分化包括系分化包括ES细细胞胞经谱经谱系祖系祖细细胞胞(lineage progenitors)、谱谱系定型系定型细细胞胞(lineage committed cell) 到到终终末分化末分化细细胞的整个胞的整个细细胞分化的全胞分化的全过过程。在程。在这过这过程中程中,会出会出现现一些

42、不一些不稳稳定的、定的、过过渡型的前体渡型的前体细细胞。胞。由于由于ES细细胞也是一种具有不受胞也是一种具有不受约约束的和无序的自我束的和无序的自我发发育特性育特性, ES细细胞在体外被胞在体外被诱导时诱导时常同常同时时出出现现不同胚不同胚层类层类型的多种分化型的多种分化细细胞胞,这这增加了增加了识别谱识别谱系祖系祖细细胞和胞和谱谱系定型系定型细细胞的困胞的困难难性。性。l定向分化要定向分化要设设法控制法控制ES细细胞胞导导向向产产生生单单一一类类型的型的终终末分化末分化细细胞胞,这这是当今是当今临临床床细细胞移植或胞移植或细细胞治胞治疗疗迫切需要的。迫切需要的。对对ES细细胞胞转转染染细细胞

43、胞专专一的一的转录转录因子、因子、标标志基因或有关志基因或有关细细胞分化因子等胞分化因子等遗遗传传操作操作,并并结结合合报报道基因和添加特定道基因和添加特定细细胞因子胞因子诱导诱导条件条件选择选择等等手段手段,可能是探索可能是探索ES细细胞定向胞定向诱导诱导分化的一条有效途径。分化的一条有效途径。 l(三三) ES细细胞体外胞体外诱导诱导分化的基本途径分化的基本途径l1.单层单层ES细细胞培养和胞培养和诱导诱导分化分化l单层单层ES细细胞在撤除胞在撤除LIF并添加适当并添加适当浓浓度的度的细细胞分化胞分化诱导剂诱导剂,如如维维甲酸甲酸(retinoic acid, RA),二甲二甲亚矾亚矾(D

44、MSO)和和环环六六亚亚甲基双乙甲基双乙酰酰胶胶(HMBA)等并添加适当的生等并添加适当的生长长因子条件下因子条件下,每隔每隔2天天,更更换换含含诱导剂诱导剂的新的新鲜鲜培养液。培养液。l细细胞分化胞分化类类型随型随诱导剂诱导剂和生和生长长因子性因子性质质及其及其浓浓度度,细细胞胞浓浓度度,培培养条件等因素养条件等因素,特特别别是是ES细细胞本身的分化潜能和特性而异。通胞本身的分化潜能和特性而异。通常常单层单层培养的培养的ES细细胞胞较难较难分化分化为单为单一一类类型的型的细细胞胞,常出常出现现以某以某种种类类型分化型分化细细胞胞为优势为优势的情况下的情况下,杂杂有一些其他有一些其他类类型的分

45、化型的分化细细胞。胞。l2. ES细细胞胞拟拟胚体形成和胚体形成和诱导诱导分化分化l形成形成拟拟胚体方式是胚体方式是ES细细胞定向胞定向诱导诱导分化的常用途径分化的常用途径.有两有两类类方方法法 l(1)软琼软琼脂培养脂培养lES细细胞胞经经胰蛋白胰蛋白酶酶消化消化,吹打成吹打成单单个个细细胞胞,接种于接种于预预先以先以软琼软琼脂脂铺铺底的培养皿内底的培养皿内,ES细细胞呈胞呈悬悬浮生浮生长长,增殖增殖,彼此粘附聚集而形成彼此粘附聚集而形成拟拟胚体。胚体。l(2)悬悬滴培养滴培养lES细细胞胞经经胰蛋白胰蛋白酶酶消化消化,制制备备成成单单个个细细胞胞悬悬浮液浮液,滴种在直径滴种在直径为为10

46、cm培养皿的盖子上培养皿的盖子上,制成制成许许多多悬悬浮浮细细胞小滴胞小滴,培养皿内加入适培养皿内加入适量量PHS,然后小心盖上然后小心盖上带带有有许许多小滴的盖子多小滴的盖子,使盖子上的使盖子上的许许多小多小滴倒置成滴倒置成悬悬滴。置滴。置370C,5% CO2培养箱。培养培养箱。培养3天后天后,悬悬滴中的滴中的ES细细胞聚集形成胞聚集形成拟拟胚体。胚体。l将将拟拟胚体移至含胚体移至含细细胞分化胞分化诱导剂诱导剂(如如RA)的培养皿或微孔板的培养皿或微孔板进进一一步培养。然后移放人步培养。然后移放人铺铺有有 0.1%白明胶的培养皿或微孔板内白明胶的培养皿或微孔板内,在在含有或不含含有或不含细

47、细胞分化胞分化诱导剂诱导剂,并缺乏并缺乏LIF的培养液中的培养液中进进一步培养一步培养,可被可被诱导诱导分化分化为为不同不同类类型的型的细细胞胞.l(四四) ES细细胞体外胞体外诱导诱导分化的几种分化的几种细细胞胞l人人类类ES/EG细细胞建系成功胞建系成功,人人们们借借鉴鉴小鼠小鼠ES细细胞体外胞体外诱导诱导分化分化的成功的成功经验经验,致力于将人致力于将人ES 细细胞改造成以胞改造成以临临床基因、床基因、细细胞治胞治疗疗和和组织组织工程种子工程种子细细胞胞为为目的的各种定向目的的各种定向诱导诱导分化分化细细胞研究胞研究.目目前至少有前至少有20余种从余种从ES细细胞胞诱导诱导分化来的体分化

48、来的体细细胞胞获获得成功得成功(表表19.3)l造血造血细细胞胞(hematopoitic cell)是是报报道最多的一种分化道最多的一种分化细细胞胞类类型。小鼠型。小鼠ES细细胞胞拟拟胚体在体外可分化胚体在体外可分化为类为类似于早期胚胎卵黄囊血似于早期胚胎卵黄囊血岛样岛样的的结结构构,分化分化产产生生红细红细胞、髓胞、髓细细胞和淋巴胞和淋巴细细胞等各种造血系胞等各种造血系统统的的细细胞。一般常采用分胞。一般常采用分阶阶段段诱导诱导小鼠小鼠ES细细胞分化胞分化为为造血干造血干细细胞和胞和B淋巴淋巴细细胞胞:首先使首先使ES细细胞胞发发育成育成拟拟胚体胚体,然后然后,用胰蛋白用胰蛋白酶酶消化成消

49、化成单单个个细细胞胞,经经干干细细胞因子胞因子(SCF)、血小板生成素、血小板生成素(TPO)和和胚胎胚胎细细胞的条件培养液胞的条件培养液处处理理,使其定向分化使其定向分化为为造血干造血干细细胞胞;再用再用原代骨髓基原代骨髓基质细质细胞作胞作饲饲养养层层和和SCF及及IL-6细细胞因子胞因子处处理理,可可进进一一步使步使ES细细胞来源的造血干胞来源的造血干细细胞分化胞分化为为B淋巴淋巴细细胞系。胞系。l在体胚胎研究表明在体胚胎研究表明, 7.5 d的小鼠胚胎最初在卵黄囊的小鼠胚胎最初在卵黄囊(yolk sac)内内出出现现大而有核的前成大而有核的前成红细红细胞。当胚胎胞。当胚胎长长至至10 -

50、12 d肝形成肝形成时时, 则则卵黄囊前成卵黄囊前成红细红细胞逐胞逐渐渐消失。表明胚胎造血器官是从卵黄囊消失。表明胚胎造血器官是从卵黄囊转转移到胚胎肝移到胚胎肝脏脏的。而在的。而在ES细细胞体外分化胞体外分化实验实验中中,生生长长4d的的拟拟胚胚体首先出体首先出现现前成前成红细红细胞胞,拟拟胚体生胚体生长长至第至第10 -12 d时时前成前成红细红细胞胞逐逐渐渐消失。成熟消失。成熟红细红细胞和成髓胞和成髓细细胞都是在前成胞都是在前成红细红细胞出胞出现现后不后不久才久才产产生。利用骨髓基生。利用骨髓基质细质细胞或其条件培养液胞或其条件培养液,可以可以诱导诱导小鼠小鼠ES细细胞在体外分化胞在体外分

51、化为为造血干造血干细细胞。胞。l小鼠在体胚胎的卵黄囊血小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛岛内内,前成前成红细红细胞的胞的产产生生总总是伴随着内是伴随着内皮皮细细胞的出胞的出现现,因而因而认为认为内皮内皮细细胞和前成胞和前成红细红细胞来源于共同的祖胞来源于共同的祖细细胞。同胞。同样样,ES细细胞体外分化胞体外分化时时,拟拟胚体的血胚体的血岛样结岛样结构中前成构中前成红红细细胞集落周胞集落周围围也有内皮也有内皮细细胞出胞出现现。ES细细胞衍生的胞衍生的拟拟胚体分化的胚体分化的管状管状结结构是由内皮构是由内皮细细胞排列胞排列组组成的成的,管道内管道内还还含有一些造血含有一些造血细细胞胞,类类似于胚胎似于胚胎发

52、发育中的早期血管育中的早期血管发发生。生。l将将ES细细胞胞单层单层培养在含重培养在含重组组TGF1的的I型胶原蛋白型胶原蛋白为为基基质质的三的三维维系系统统内内,或将或将过过度表达度表达TGF1的的ES细细胞胞单层单层培养在培养在I型胶原蛋型胶原蛋白白为为基基质质的三的三维维系系统统内都能内都能获获得内皮得内皮细细胞胞组组成的血管成的血管样结样结构构,而而缺乏重缺乏重组组TGF1处处理或无理或无过过度表达度表达TGF1的正常的正常ES细细胞在胞在I型型胶原蛋白胶原蛋白为为基基质质的三的三维维系系统统内培养内培养, 不形成血管不形成血管样结样结构构.因此因此, TGF1可能是通可能是通过细过细

53、胞外基胞外基质质行使其形成血管的功能行使其形成血管的功能.l单层单层培养的小鼠培养的小鼠ES细细胞的胞的诱导诱导分化分化实验实验中中,在在10mol/L维维甲酸甲酸(RA)与与1 mmol/L双丁双丁酰酰基基环环腺苷磷酸腺苷磷酸(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, dBcAMP )共同作用下共同作用下,90% -95%的分化的分化细细胞胞为为神神经经胶胶质细质细胞。小鼠胞。小鼠ES细细胞也可在体外被胞也可在体外被诱导诱导分化分化为为少突神少突神经经胶胶质细质细胞胞(oligodendrocytes)和运和运动动神神经经元。元。ES细细胞胞拟拟胚体

54、在特定条胚体在特定条件件贴贴壁培养壁培养时时也能被也能被诱导诱导分化分化为为神神经经元。用元。用悬悬浮培养浮培养4 d的的拟拟胚体在含胚体在含RA的培养液中的培养液中继续继续培养培养 4 d,再使再使拟拟胚体胚体贴贴壁培养壁培养则则可高效重复地分化出神可高效重复地分化出神经细经细胞胞,不不仅仅表达表达专专一性的神一性的神经经微微丝丝M和和微管蛋白微管蛋白,还还有有钠钠、钾钾、钙钙等离子信号通道的特征。等离子信号通道的特征。l分化的神分化的神经细经细胞胞还还表达神表达神经递质经递质GABA、glycine和受体和受体NMDA等不同物等不同物质质。甚至在体外。甚至在体外诱导诱导分化早期的分化早期的

55、拟拟胚体中胚体中检测检测到神到神经经元和神元和神经经胶胶质细质细胞的共同前体胞的共同前体细细胞的胞的专专一性一性标标志巢蛋白志巢蛋白(nestin)。用用RA诱导诱导ES细细胞分化胞分化为为表达表达-氨基丁酸的神氨基丁酸的神经细经细胞植入胞植入Huntingtons病病(一种一种遗传遗传性舞蹈病性舞蹈病)大鼠模型体内大鼠模型体内,具有神具有神经细经细胞功能的移植物胞功能的移植物使患鼠症状有所改善使患鼠症状有所改善,并存活了并存活了6周。周。l因此因此,ES细细胞体外胞体外诱导诱导分化分化细细胞有可能成胞有可能成为临为临床床细细胞治胞治疗疗的移的移植物来源的新途径之一。植物来源的新途径之一。l悬

56、悬浮或浮或悬悬滴培养的小鼠滴培养的小鼠ES细细胞的胞的拟拟胚体在胚体在RA诱导诱导条件下条件下贴贴壁壁生生长长数天数天,常出常出现现某些分化某些分化细细胞集落具胞集落具节节律性自律性自发发收收缩现缩现象象.电电镜观镜观察察证实证实,收收缩缩的的细细胞内存在着肌原胞内存在着肌原纤维纤维、肌小、肌小节节和和闰盘闰盘等等典型心肌典型心肌细细胞特有胞特有结结构。构。发现发现心肌心肌细细胞分化胞分化过过程中程中,分化分化细细胞胞团刚团刚开始收开始收缩时缩时型肌球蛋白重型肌球蛋白重链链(MHC)表达占表达占优势优势,继续继续培养培养数天数天,则则型型MHC逐逐渐渐占占优势优势,最最终终在分化的心肌在分化的

57、心肌细细胞中胞中,27 % 表达表达型型MHC,33 %同同时时表达表达和和型型MHC,40 %表达表达型型MHC。这这种种MHC亚亚型的型的转变转变与在体胚胎心肌与在体胚胎心肌发发育育过过程极相似。除心程极相似。除心肌肌细细胞外胞外,决定骨骼肌决定骨骼肌发发育的基因育的基因myf-5、myogenin, myoD等在等在ES细细胞胞拟拟胚体的分化胚体的分化细细胞中都能胞中都能够够表达表达,而且表达而且表达时时序与在体序与在体胚胎胚胎发发育中相同。育中相同。ES细细胞胞拟拟胚体胚体贴贴壁培养壁培养1- 2周后一般都能出周后一般都能出现现肌肌细细胞胞,继续继续培养培养则则融合成肌管融合成肌管,显

58、显示出骨略肌示出骨略肌发发育的典型特育的典型特征。分化的肌征。分化的肌细细胞常表达成熟肌胞常表达成熟肌细细胞胞专专一的一的Ca2+信号通道和烟信号通道和烟碱受体碱受体(nicotinic receptor)。二甲二甲亚矾诱导亚矾诱导ES细细胞胞拟拟胚体可形成心肌胚体可形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种、平滑肌和骨骼肌等多种类类型肌型肌细细胞胞,用肌肉用肌肉专专一性的一性的调节调节因因子子myoD基因基因转转染染ES细细胞并胞并结结合合DMSO诱导处诱导处理理,额额外表达外表达myoD基因的基因的ES细细胞胞,则则主要分化主要分化为为骨骼肌骨骼肌,没有心肌和平滑肌没有心肌和平滑肌类类型型细细胞出胞出

59、现现,且骨骼肌常融合形成肌管。且骨骼肌常融合形成肌管。l因此因此,通通过过改造改造ES细细胞某种基因和胞某种基因和给给予适当培养条件的途径予适当培养条件的途径,是是诱导诱导ES细细胞向特定胞向特定单单一一类类型型细细胞分化的可行方法之一。胞分化的可行方法之一。 l小鼠小鼠ES细细胞或胞或EG细细胞通胞通过悬过悬滴培养法滴培养法,形成的形成的拟拟胚体被胚体被转转移到移到铺铺有有琼琼脂的培养皿中脂的培养皿中,悬悬浮培养浮培养3 d, 每天更每天更换换含有含有诱导剂诱导剂二甲二甲亚亚矾矾(DMSO)的培养液。的培养液。3 d后后,经过诱导剂处经过诱导剂处理的理的拟拟胚体移人表胚体移人表面事先用明胶面

60、事先用明胶 (gelatin)包被的培养皿中包被的培养皿中进进一步一步贴贴壁培养。壁培养。这时这时给给培养液中加入胰培养液中加入胰岛岛素、三腆甲腺原氨酸素、三腆甲腺原氨酸(triiodothyronine) 和胎牛和胎牛血清血清,10 -15 d后大部分后大部分拟拟胚体分化胚体分化为为脂肪脂肪细细胞。脂肪胞。脂肪细细胞中的胞中的脂滴含有甘油三脂滴含有甘油三酯酯(triglycerides),很容易用油很容易用油红红O (oil red O)染色染色鉴鉴定定,显显示特异性示特异性红红色。色。l小鼠小鼠ES细细胞通胞通过过形成形成拟拟胚体并胚体并结结合添加合添加转转化生化生长长因子家族因子家族(如

61、如TGF1 ,BMP-2和和BMP-4)可可诱导诱导分化分化为为表达表达软软骨相关基因和蛋白的骨相关基因和蛋白的软软骨骨细细胞。胞。ROSA-geo基因基因转转染的小鼠染的小鼠ES细细胞胞,在缺乏在缺乏G418的的情况下聚集成情况下聚集成拟拟胚体。用胚体。用10%小牛血清代替胎牛血清小牛血清代替胎牛血清,培养液培养液中含有分化中含有分化诱导剂诱导剂1mol/L地塞米松地塞米松(dexamethasone),2 - 3 d更更换换培培养液养液,50 d后后,这这种种拟拟胚体胚体发发育成育成软软骨骨细细胞胞,经经Alcian blue液染色液染色,显显示出明确的示出明确的软软骨骨细细胞特征胞特征,

62、细细胞胞间间存在着存在着11型胶原。型胶原。 l小鼠小鼠ES细细胞胞经过拟经过拟胚体胚体阶阶段段,结结合无血清和多种生合无血清和多种生长长因子、有因子、有丝丝分裂原分裂原处处理理,可被可被诱导诱导分化分化为为分泌胰分泌胰岛岛素的、素的、类类似胰似胰岛岛的的结结构。近来利用人构。近来利用人ES细细胞胞经过悬经过悬浮培养浮培养获获得胚体得胚体,再再经经如如bFGF等等生生长长因子因子诱导诱导可分化可分化为为以以产产生胰生胰岛岛素素为为特征的胰特征的胰岛岛样细样细胞。胞。lES细细胞定向胞定向诱导诱导分化分化为为肝肝细细胞。用胞。用RA、肝、肝细细胞生胞生长长因子因子 (HGF)、-神神经经生生长长

63、因子因子(-NGF)共同添加至共同添加至细细胞培养液胞培养液,被被诱导诱导分化分化细细胞从形胞从形态态学、生化和肝学、生化和肝细细胞功能性胞功能性标记标记等指等指标标都都证证明是具有功明是具有功能性的肝能性的肝细细胞。但胞。但仅仅使用使用RA,虽虽能分化能分化为为上皮上皮样细样细胞胞,可并不表可并不表达各种肝功能的生化指达各种肝功能的生化指标标,例如例如,白蛋白、白蛋白、AFP、G-6-P、1-AT、肝核因子肝核因子-4和和SAPK/ERK激激酶酶-1 (SEK1)等等,表明表明 HGF和和-NGF是是诱导诱导小鼠小鼠ES细细胞分化胞分化为为功能性肝功能性肝细细胞的重要因子。胞的重要因子。l第

64、三第三节节 成体干成体干细细胞胞l20世世纪纪初初, Pappenheim根据根据对对骨髓中的造血骨髓中的造血细细胞胞发发生生过过程的形程的形态态学学观观察察,提出了骨髓中存在着未分化干提出了骨髓中存在着未分化干细细胞的胞的设设想想,认为认为未分未分化的干化的干细细胞通胞通过过各个中各个中间阶间阶段的前体段的前体细细胞最胞最终终生成成熟的多种生成成熟的多种类类型血型血细细胞。首次提出了成体干胞。首次提出了成体干细细胞胞(adult stem cell)的概念。的概念。l成体干成体干细细胞是一群分布在成体胞是一群分布在成体组织组织中尚未分化的、具有自我更中尚未分化的、具有自我更新潜能并新潜能并负

65、负有构建和有构建和补补充某种充某种组织组织的各种的各种类类型型细细胞的干胞的干细细胞胞,故又名故又名组织组织干干细细胞。胞。l成体成体组织组织中存在干中存在干细细胞是个体胞是个体发发育育进进化史的化史的产产物物, 涉及涉及组织组织器器官的再生能力和官的再生能力和创伤创伤修复等基本特性。如骨髓修复等基本特性。如骨髓组织组织的造血干的造血干细细胞可分裂、分化胞可分裂、分化为为血液系血液系统统的各种的各种细细胞胞,定期定期补补充充细细胞成分或胞成分或失血。小失血。小肠肠和皮肤中的干和皮肤中的干细细胞也分胞也分别别能分化、能分化、补补充和更新小充和更新小肠肠和皮肤和皮肤组织组织的一些的一些细细胞。胞。

66、 l传统传统的的观观点点认为认为,干干细细胞一旦分化成熟胞一旦分化成熟,就不再分裂增殖了就不再分裂增殖了;人体人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏脏的的组织组织干干细细胞有一定的再胞有一定的再生能力外生能力外,其他其他组织组织器官如神器官如神经组织经组织基本上不再具有再生能力基本上不再具有再生能力.同同时时也也认为认为在成体中存在的属于某在成体中存在的属于某组织组织器官的成体干器官的成体干细细胞是胞是专专能或限能的能或限能的,如造血干如造血干细细胞只能分化胞只能分化为为血液系血液系统统的各种的各种细细胞等胞等.l新近的研究表明新近的研究表明,这这些成体干些成体干细

67、细胞的胞的发发育潜能可跨越育潜能可跨越组织组织或胚或胚层层的界限。如从成年小鼠的界限。如从成年小鼠脑组织脑组织分离的神分离的神经经干干细细胞移植入胞移植入经经X射射线线照射照射过过的小鼠骨髓部位的小鼠骨髓部位,则则分化出血液分化出血液细细胞。此后胞。此后,发现发现人人和小鼠的神和小鼠的神经经干干细细胞具有分化胞具有分化为为肌肌细细胞和胚胎多种胞和胚胎多种组织细组织细胞的胞的潜能潜能.l因此因此,神神经经干干细细胞同胞同样样具有可塑性具有可塑性,能分化能分化为为非神非神经类经类型的型的细细胞胞.人人们们把成体干把成体干细细胞具有跨越胞具有跨越组织组织或胚或胚层层分化的分化的这这一特性称一特性称为

68、为干干细细胞的可塑性胞的可塑性(plasticity)或跨越分化或跨越分化(transdifferentiation).l成体干成体干细细胞分化的多能性表明：胞分化的多能性表明：细细胞的命运不是一成不胞的命运不是一成不变变的的,这为许这为许多疾病的多疾病的细细胞治胞治疗疗提供了新的思路和有希望的前景。提供了新的思路和有希望的前景。l成体干成体干细细胞是一种胞是一种处处于尚未于尚未终终末分化的、末分化的、处处于干于干/祖或前体祖或前体细细胞状胞状态态的成体的成体细细胞胞,它来源于成年和未成年个体的它来源于成年和未成年个体的组织组织干干细细胞。胞。在正常生理条件下在正常生理条件下,倾倾向于分化成并

69、更新所在向于分化成并更新所在组织组织的各种的各种细细胞。胞。但在特定的外界条件但在特定的外界条件诱导诱导下下,一种一种组织组织的成体干的成体干细细胞能超越胞能超越该该特定特定组织组织、胚、胚层层分化成其他分化成其他组织组织的功能性的功能性细细胞胞,补补充参与其他充参与其他组织损伤组织损伤的修复等。的修复等。l一、成体干一、成体干细细胞具分化可塑性胞具分化可塑性l成体干成体干细细胞具有可塑性胞具有可塑性(plasticity).证证据大多数来自小鼠的据大多数来自小鼠的实验实验,人人们们确信机体中成体干确信机体中成体干细细胞的可塑性胞的可塑性现现象具有普遍性。象具有普遍性。 l(一一)骨髓干骨髓干

70、细细胞胞l骨髓是由不同骨髓是由不同类类型多种型多种细细胞成分胞成分组组成的成的组织组织,除了分化的血除了分化的血细细胞和胞和间质细间质细胞外胞外, 有二有二类类成体干成体干细细胞：一胞：一类类是造血干是造血干细细胞胞(hematopoietic stem cell, HSC),能生成各种血能生成各种血细细胞胞;另一另一类类是是间质间质干干细细胞胞(mesenchymal stem cell, MSC),能生成内皮能生成内皮细细胞、脂肪胞、脂肪细细胞和成胞和成纤维纤维细细胞等。胞等。l通通过过全骨髓移植全骨髓移植实验证实验证明明,骨髓中的骨髓中的细细胞在不同微胞在不同微环环境的位点境的位点,除形

71、成各种血除形成各种血细细胞和衍生于胞和衍生于间质间质干干细细胞的各胞的各类细类细胞外胞外,还还可被可被诱导诱导分化分化为为神神经细经细胞、肌胞、肌细细胞、骨和肝胞、骨和肝细细胞等外、中、内胞等外、中、内3个个胚胚层层的不同的不同类类型的分化型的分化细细胞胞(表表19.4)。证证明骨髓明骨髓组织组织中含有的干中含有的干细细胞具有多潜能性胞具有多潜能性,在特定的条件下可跨越在特定的条件下可跨越组织组织或胚或胚层层分化的分化的能力能力,能能够够分化分化为为内皮、神内皮、神经经元、胶元、胶质细质细胞和肝胞和肝细细胞等。胞等。l目前已知骨髓中存在造血干目前已知骨髓中存在造血干细细胞胞(HSC)和和间质间

72、质干干细细胞胞(MSC)两两类类干干细细胞胞,为为区区别这别这两两类类干干细细胞在分化潜能上的不同胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干便把骨髓干细细胞分离和胞分离和纯纯化。体外培养的骨髓化。体外培养的骨髓细细胞胞,HSC细细胞呈胞呈悬悬浮集落浮集落生生长长;而而MSC细细胞胞则贴则贴壁生壁生长长。两者都具有多潜能性。两者都具有多潜能性。 l1.间质间质干干细细胞胞lMSC细细胞在体外胞在体外单单独培养独培养,证证明具有分化明具有分化为为包括骨包括骨细细胞、胞、软软骨骨细细胞、腱、脂肪胞、腱、脂肪细细胞和肌胞和肌细细胞等潜能胞等潜能,也能分化成内皮也能分化成内皮细细胞和胞和内胚内胚层层的肝的肝细细胞

73、。胞。MSC细细胞移植至胞移植至脑脑中中,可分化可分化为为非非间质细间质细胞胞性性质质的神的神经细经细胞。当胞。当MSC细细胞注射入早期囊胚胞注射入早期囊胚,然后移植入假然后移植入假孕母鼠孕母鼠,分析嵌合体分析嵌合体动动物物,发现发现MSC细细胞可参与大多数体胞可参与大多数体细细胞胞类类型的分化型的分化;当当MSC细细胞移植入正常宿主胞移植入正常宿主时时,则则除了肝、肺和除了肝、肺和肠肠的的上皮外上皮外,主要分化主要分化为为造血造血细细胞的胞的谱谱系世代。当系世代。当MSC细细胞移植入胞移植入小量射小量射线线照射的宿主照射的宿主,则则造血系造血系统统和胃和胃肠肠道道组织组织有所增加。有所增加。

74、l2.造血干造血干细细胞胞lHSC细细胞是研究得最早和最多的一种异胞是研究得最早和最多的一种异质质性很性很强强的干的干细细胞。已胞。已知知HSC细细胞表面存在着一些胞表面存在着一些标标志志,可用流式可用流式细细胞胞仪仪或免疫磁性或免疫磁性分分选选技技术术从骨髓从骨髓细细胞中分离和胞中分离和纯纯化出化出HSC细细胞。胞。经经移植至不同移植至不同的体内微的体内微环环境境,可分化可分化为为三胚三胚层层的各种的各种类类型型细细胞胞,包括心肌、骨包括心肌、骨骼肌、血管内皮系骼肌、血管内皮系统统,肝肝细细胞、肺泡、食管、胞、肺泡、食管、肠肠 道、胃、胆管道、胃、胆管以及皮肤和神以及皮肤和神经细经细胞等。胞

75、等。l因此因此,骨髓中的骨髓中的HSC与与MSC一一样样,分化潜能具有很大的可塑性分化潜能具有很大的可塑性,可可分化分化为为跨越胚跨越胚层层的各种的各种类类型型细细胞。胞。l(二二)神神经经干干细细胞胞l神神经发经发育育过过程中未成熟的、增殖中的各程中未成熟的、增殖中的各类细类细胞称胞称为为神神经经前体前体细细胞胞(progenitor cell).神神经经干干细细胞是神胞是神经经系系统统中中一一类类能自我更新并能自我更新并产产生神生神经经元和神元和神经经胶胶质细质细胞的前体胞的前体细细胞胞.早期研究确早期研究确证证胚胎的神胚胎的神经经系系统统中普遍存在着中普遍存在着这类这类神神经经干干细细胞

76、胞.其后其后,进进行成体神行成体神经经干干细细胞分离胞分离,发现发现成体成体神神经经干干细细胞主要存在中枢神胞主要存在中枢神经经系系统统的的2个神个神经发经发生区域：生区域：即即脑脑的海的海马马区区(hippocus)和次和次脑脑窒区窒区(subventricular zone, SVZ )以及包括脊髓等其他一些非神以及包括脊髓等其他一些非神经经性的区域性的区域.l神神经经干干细细胞或神胞或神经经前体前体细细胞在个体胞在个体发发育育过过程中程中,经经受受发发育上的育上的时时空空变变化化,成体神成体神经经干干细细胞的可塑性受到限制。胞的可塑性受到限制。通通过过个体不同个体不同发发育育阶阶段的神段

77、的神经经干干细细胞移植至宿主不同胞移植至宿主不同部位部位, 发现发现神神经经干干细细胞移植物分化胞移植物分化为为神神经细经细胞的潜能具胞的潜能具有有发发育育阶阶段的依段的依赖赖性性,成体中的神成体中的神经经干干细细胞分化潜能随胞分化潜能随发发育遂受到限制。育遂受到限制。l用成体中枢神用成体中枢神经经系系统统的干的干细细胞胞经经体外培养体外培养扩扩增的移植增的移植实验实验表明表明,其在成体微其在成体微环环境中尚有一定的可塑性。如成体脊髓衍生的干境中尚有一定的可塑性。如成体脊髓衍生的干细细胞通常不胞通常不产产生神生神经经元元,若注人成体若注人成体脑脑的海的海马马区区,则则能能产产生神生神经经元元;

78、成年海成年海马马衍生的干衍生的干细细胞移植入胞移植入SVZ,则则能能产产生嗅球神生嗅球神经经元。然元。然而而,至今却没有直接至今却没有直接证证据表明成体神据表明成体神经经干干细细胞分化胞分化为为如在胚胎如在胚胎中正常中正常产产生的有突触的神生的有突触的神经经元。元。l研究表明研究表明,把体外培养的把体外培养的SVZ干干细细胞生胞生长长成神成神经经球通球通过过注射入注射入鸡鸡胚神胚神经嵴经嵴 (neural crest)途径途径,其分化潜能有所其分化潜能有所扩扩大大,可可产产生周生周围围神神经经系系统统。另外。另外,神神经经干干细细胞的子代也有可能恢复胞的子代也有可能恢复发发育多潜能性。育多潜能

79、性。如通常唯一如通常唯一产产生神生神经经胶胶质细质细胞的胞的视视神神经经O2A中枢前体中枢前体细细胞在体胞在体外可恢复其多能的、外可恢复其多能的、产产生中枢神生中枢神经经系系统统的干的干细细胞。表明胞。表明环环境因境因子能改子能改变变神神经经干干细细胞的命运或增加其可塑性。胞的命运或增加其可塑性。l(三三)肝干肝干细细胞胞l由于肝干由于肝干细细胞本身缺乏特异性胞本身缺乏特异性标标志志,给给肝干肝干细细胞分离和胞分离和鉴鉴定定带带来了困来了困难难。l早在早在58年年, Wilson JW等人等人认为认为“肝肝组织组织中存在着干中存在着干细细胞胞”,依据是依据是肝肝组织组织因因营营养养损伤损伤或部

80、分切除或部分切除时时仍能再生仍能再生,但已存在的肝但已存在的肝细细胞不胞不能分裂和再生能分裂和再生, 新生的肝新生的肝细细胞只能来源于肝干胞只能来源于肝干细细胞。化学致癌胞。化学致癌实实验时验时,位于位于门门管周管周围围的小的小细细胞胞发发生增殖生增殖,这这种具有卵种具有卵圆圆形形细细胞核、胞核、少少细细胞胞质质的的细细胞称胞称为为卵卵圆圆形形细细胞胞(oval cell)。在人肝在人肝组织组织中中,同同样发样发现这现这种卵种卵圆圆形形细细胞。胞。对发对发育中的肝具有自我更新能力的育中的肝具有自我更新能力的细细胞胞进进行行单单克隆培养和分析克隆培养和分析,证证明明这这种卵种卵圆圆形形细细胞在体

81、外能大量增殖胞在体外能大量增殖,细细胞移植后在形胞移植后在形态态和功能上可分和功能上可分别别分化分化为为肝肝细细胞和胆管上皮胞和胆管上皮细细胞胞,表明肝卵表明肝卵圆圆形形细细胞是肝干胞是肝干细细胞胞.l近来近来发现发现,骨髓和血液中的骨髓和血液中的细细胞能分化胞能分化为为肝肝细细胞胞.l肝干肝干细细胞来源可能有两条途径：一是肝胞来源可能有两条途径：一是肝组织组织外外, 骨髓和血液是卵骨髓和血液是卵圆圆形形细细胞的来源胞的来源,人的骨髓人的骨髓细细胞也能分化胞也能分化为为肝肝细细胞和胆管上皮胞和胆管上皮细细胞胞;二是肝二是肝组织组织内内处处于休眠期的肝干于休眠期的肝干细细胞。双潜能的肝干胞。双潜

82、能的肝干细细胞同胞同时时表达肝表达肝细细胞和胆上皮胞和胆上皮细细胞的胞的标标志物志物,细细胞角蛋白胞角蛋白CK7 和和CK19为为胆上皮胆上皮细细胞的特异性胞的特异性标标志志;白蛋白和肝代白蛋白和肝代谢谢酶酶细细胞色素胞色素P450可可作作为为肝肝细细胞的特异性胞的特异性标标志物志物;而而细细胞角蛋白胞角蛋白CK8和和CK18在肝在肝实实质细质细胞和胆上皮胞和胆上皮细细胞都有表达。胞都有表达。l肝干肝干细细胞一般除了其特有的形胞一般除了其特有的形态态学外学外,常常结结合上述特有合上述特有标标志通志通过过免疫免疫组织组织化学、流式化学、流式细细胞胞检测检测和原位和原位杂杂交等方法予以交等方法予以

83、鉴鉴定。定。l双潜能卵双潜能卵圆圆形形细细胞不胞不仅仅能分化能分化为为肝肝细细胞和胆管上皮胞和胆管上皮细细胞胞,当分当分别别移植到胰腺和十二指移植到胰腺和十二指肠时肠时,还还能跨越能跨越组织组织各自分化各自分化为为胰腺胰腺细细胞和胞和肠肠上皮上皮细细胞。表明肝干胞。表明肝干细细胞在适当的微胞在适当的微环环境能被境能被诱导诱导分化分化为为内胚内胚层层其他其他组织组织的的细细胞胞.l卵卵圆圆形形细细胞异常分化或分化突然停止有可能胞异常分化或分化突然停止有可能发发生肝生肝细细胞癌。胞癌。l在培养液添加适当的分化在培养液添加适当的分化诱导剂诱导剂,如丁酸如丁酸钠钠或二甲基或二甲基亚矾亚矾,可可诱诱导导

84、和促和促进进肝干肝干细细胞分化胞分化为为肝肝细细胞。在培养液中添加胞。在培养液中添加转转化生化生长长因因子子(TGF)或肝或肝细细胞生胞生长长因子因子(HGF) ,可可诱导诱导肝干肝干细细胞分化胞分化为为胆胆管上皮管上皮细细胞。胞。l(四四)骨骼肌干骨骼肌干细细胞胞l肌肉的生肌肉的生长长、更新和修复是与肌、更新和修复是与肌纤维纤维周周围围的的卫卫星星细细胞胞(satellite cells)有关有关, 一般一般认为这认为这就是骨骼肌干就是骨骼肌干细细胞。胞。l从肌肉分离的干从肌肉分离的干细细胞不胞不仅仅能分化出肌肉能分化出肌肉,还还能能产产生血液生血液细细胞成分胞成分. Jiang等人从等人从

85、3天天龄龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼肌肌细细胞胞,得到一得到一类类多能成年前体多能成年前体细细胞胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)的的细细胞。胞。这这种种细细胞具有胞具有类类似于小鼠骨髓似于小鼠骨髓MAPC的表型和的表型和特征特征,能在体外增殖。肌肉来源的能在体外增殖。肌肉来源的MAPC在体外特定的在体外特定的细细胞因子胞因子条件下可被条件下可被诱导诱导分化成内皮、肝分化成内皮、肝细细胞胞样细样细胞和包括胞和包括进进一步分化一步分化为为神神经经元及神元及神经经胶胶质样细质样细胞的神胞的神经经外

86、胚外胚层细层细胞。表明骨骼肌胞。表明骨骼肌组组织织中确中确实实存在着干存在着干细细胞胞,并具有分化的可塑性。并具有分化的可塑性。 l二、成体干二、成体干细细胞研究中的胞研究中的问题问题l(一一)异异质质性性l成体干成体干细细胞在胞在组织组织中的含量极少中的含量极少,又缺乏特异性又缺乏特异性检测标检测标志志,很很难难从从组织组织中将其分离中将其分离纯纯化出来。化出来。l在一些成体干在一些成体干细细胞胞“可塑性可塑性”的的实验实验中中,人人们质们质疑所疑所谓谓“可塑性可塑性”可能是可能是组织组织中混中混杂杂着几种或一群不同着几种或一群不同类类型的干型的干细细胞而分化的胞而分化的结结果果,这这在骨髓

87、在骨髓组织组织的干的干细细胞胞实验实验中更中更为为明明显显。在肝。在肝细细胞胞谱谱系分系分化的各化的各类类祖祖细细胞中胞中,就就发现发现存在着异存在着异质质性性(heterogeneity)和可塑性。和可塑性。l干干细细胞的异胞的异质质性在性在遗传遗传学中是指由于不同学中是指由于不同遗传遗传机制而机制而产产生相同生相同或或类类似的表型。异似的表型。异质质性在某种程度上是干性在某种程度上是干细细胞固有的特性。造胞固有的特性。造血干血干细细胞异胞异质质性早已被性早已被证证明。从骨骼肌干明。从骨骼肌干细细胞的研究中胞的研究中发现发现,这类这类所所谓谓的肌干的肌干细细胞在特定胞在特定环环境下分境下分别

88、别分化出肌肉和血分化出肌肉和血细细胞胞,其其实这实这是由含有两是由含有两类类分化方向完全不同的干分化方向完全不同的干细细胞所致。胞所致。l(二二)干干细细胞所胞所处处的的环环境境l小鼠造血干小鼠造血干细细胞和胰腺干胞和胰腺干细细胞都能分化出肝胞都能分化出肝细细胞并能修复小鼠胞并能修复小鼠受受损损的肝的肝组织组织。但是。但是,移植造血干移植造血干细细胞和胰腺干胞和胰腺干细细胞胞对对修复小修复小鼠受鼠受损损肝肝组织组织的效果的效果远远远远不如移植成熟肝不如移植成熟肝细细胞本身。看来干胞本身。看来干细细胞所胞所处环处环境的信号境的信号对对于于细细胞分化有重要影响。胞分化有重要影响。l特殊特殊稳稳定的

89、微定的微环环境可以控制造血干境可以控制造血干细细胞生胞生长长和分化和分化,这这种微种微环环境在早期被称境在早期被称为为壁壁龛龛(niche)。现现在微在微环环境定境定义为义为能容能容纳纳一个或多一个或多个干个干细细胞并能控制其自我更新和分化的胞并能控制其自我更新和分化的组织细组织细胞和胞外基胞和胞外基质质的的组组合。合。l将将视视网膜祖网膜祖细细胞分离出来在体外培养一些胞分离出来在体外培养一些时间时间后后,分化分化为视为视网网膜感受器膜感受器细细胞。如果从小鼠眼中分离的干胞。如果从小鼠眼中分离的干细细胞移植入正常小鼠胞移植入正常小鼠视视网膜网膜,它它们们将不能分化和被整合入正常将不能分化和被整

90、合入正常视视网膜网膜;而当移植入而当移植入损损伤伤的的视视网膜中网膜中,则则分化分化为为感受器感受器细细胞胞,并整合入并整合入该该受受损组织损组织,表明表明组织环组织环境确境确实对实对干干/祖祖细细胞的命运有决定性的作用胞的命运有决定性的作用.l脊髓脊髓产产生的运生的运动动神神经经元具有元具有对对来自各来自各组织组织的信号具有反的信号具有反应应的能的能力力;从鼠从鼠脑脑中中获获取的神取的神经经干干细细胞在体外因中断了来自大胞在体外因中断了来自大脑脑的信的信号刺激号刺激,在体外培养条件下在体外培养条件下,只能一只能一过过性地分化性地分化为为多巴胶能神多巴胶能神经经元元,不能不能维维持持长长久的多

91、巴胶能神久的多巴胶能神经经元的功能。干元的功能。干细细胞与所胞与所处细处细胞胞环环境之境之间间的的协调协调作用可能是干作用可能是干细细胞胞可塑性可塑性的重要原因的重要原因. l(三三)成体干成体干细细胞可塑性的胞可塑性的调调控控l成体干成体干细细胞胞“可塑性可塑性”的解的解说说有有4种：种：l机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细细胞群体胞群体,分分别别能定向地向各自的能定向地向各自的组织组织来源的来源的细细胞分化。胞分化。l机体中存在着一种多潜能的成体干机体中存在着一种多潜能的成体干细细胞胞,在不同的微在不同的微环环境信号境信号的刺激下的刺激下

92、,可向不同可向不同组织组织的的细细胞方向分化胞方向分化.l某特定某特定组织组织来源的成体干来源的成体干细细胞胞,除了向除了向该组织该组织的的细细胞成分分化胞成分分化外外,在特殊信号的剌激下在特殊信号的剌激下,可重新可重新编编程程(reprogramming),继续继续分化分化为为其他其他类类型的型的细细胞。胞。l某种成体干某种成体干细细胞与特定胞与特定组织组织来源的干来源的干细细胞胞发发生融合生融合,成成为为具有具有来自来自2种种细细胞的胞的遗传遗传物物质质,染色体数量也是正常染色体数量也是正常2倍的倍的“杂杂交交细细胞胞”.l成熟的干成熟的干细细胞也胞也许许无法无法变变成不同成不同类类型的型

93、的细细胞胞,但它但它们们可自可自动动与与现现有的干有的干细细胞融合胞融合,形成其他形成其他组织类组织类型的型的细细胞。如神胞。如神经经干干细细胞与造胞与造血干血干细细胞融合胞融合,从而从而变变性性为为血液干血液干细细胞胞,分化分化为为各各类类血血细细胞。胞。l干干细细胞的胞的可塑性可塑性一方面与其所一方面与其所处处微微环环境密切相关境密切相关,即受到外即受到外源性因素源性因素调调控控;另一方面也受到成体干另一方面也受到成体干细细胞本身胞本身对这类对这类外来信外来信号做出反号做出反应应的固有特性即内源性因子的固有特性即内源性因子调调控。控。l在内源性在内源性调调控机制中控机制中,一般一般认为转录

94、认为转录因子在其中起着重要的作因子在其中起着重要的作用。用。细细胞分化中胞分化中,一个已明确定向分化程序的一个已明确定向分化程序的谱谱系特异性系特异性转录转录因子因子过过表达会致使表达会致使该谱该谱系特异性系特异性转录转录因子功能因子功能发发生生颉顽颉顽作用作用,并使原有的基因程序活性保持沉默。并使原有的基因程序活性保持沉默。这样这样,这类细这类细胞胞对对微微环环境境中特定中特定细细胞因子的反胞因子的反应应是分化成另一是分化成另一类类新新细细胞。如在成肌胞。如在成肌细细胞胞分化中分化中,转录转录因子因子MyoD和和Myf5起着起着调调控成肌控成肌细细胞胞调调控因子控因子(myogenic re

95、gulatory factor, MRF)网网络络中的中的颉顽颉顽作用。在成作用。在成纤维细纤维细胞胞中中, MyoD的的过过表达可致使表达可致使这类细这类细胞胞转变为转变为成肌成肌细细胞胞,同同时时, Myf 5又抑制成肌又抑制成肌细细胞的分化活性。但在某些情况下胞的分化活性。但在某些情况下,这这一一过过程却是程却是可逆的。在可逆的。在转转基因基因C2C12细细胞的肌管形成中胞的肌管形成中,同源异形框基因同源异形框基因的异位表达降低了成肌的异位表达降低了成肌细细胞胞调调控因子控因子MRF和和MyoD表达水平表达水平,致使多核的肌管去分化而致使多核的肌管去分化而转变转变成成单单核的核的细细胞胞

96、, 进进一步再分化一步再分化为为软软骨骨细细胞、脂肪胞、脂肪细细胞等中胚胞等中胚层类层类型的型的细细胞。胞。 l(四四)分化分化细细胞的功能胞的功能l目前在技目前在技术术学上学上还还无法无法证证明成体干明成体干细细胞在所移植的胞在所移植的组织组织或器官或器官中中产产生出来的生出来的细细胞具有功能性胞具有功能性.l如在研究帕金森氏病的如在研究帕金森氏病的动动物物实验实验中中,体外培养的多巴胶能神体外培养的多巴胶能神经经元移植入元移植入脑脑内内,可可观观察到被整合入察到被整合入动动物物脑组织脑组织,但不能但不能证证明明这这些些新的神新的神经经元是否具有完整的功能。因此元是否具有完整的功能。因此,欲

97、要确定供体干欲要确定供体干细细胞胞的的终终末分化状末分化状态应该态应该包括包括细细胞表面胞表面标标志志鉴别鉴别和和细细胞功能确定胞功能确定这这2方面因素。如神方面因素。如神经经干干细细胞移植后，胞移植后，可塑可塑为为血血细细胞胞,既要既要鉴鉴定定出分化出分化细细胞具有血胞具有血细细胞的表面胞的表面标标志志,又要肯定使已接受致死又要肯定使已接受致死辐辐射射剂剂量照射量照射过过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。的受体小鼠存活并使造血功能恢复。l(五五)体外增殖体外增殖l成体干成体干细细胞从某一胞从某一组织组织分离、分离、纯纯化后化后,目前目前,尚未有尚未有现现成的能成的能较较长长期在体外期在体外维维

98、持其未分化状持其未分化状态态并大量并大量 增殖的方法。增殖的方法。l大多数成体干大多数成体干细细胞研究是用于再生医学作胞研究是用于再生医学作细细胞治胞治疗疗的目的的目的,常常设计设计使用两种手段使用两种手段:一是将分离的成体干一是将分离的成体干细细胞直接移植入胞直接移植入动动物物或患者的或患者的损损害害组织组织器官器官,以期在受以期在受损组织损组织原位分化出原位分化出该组织该组织中中成熟的功能性的成熟的功能性的细细胞胞;二是在体外将干二是在体外将干细细胞胞诱导诱导分化分化为为所需要所需要的成熟的成熟细细胞胞,而后将而后将细细胞移植入胞移植入损损害害组织组织或器官。或器官。l由于成体干由于成体干

99、细细胞很胞很难难分离、分离、纯纯化和体外培养化和体外培养, 目前目前这这两种手段两种手段都不能奏效。如将都不能奏效。如将烫伤烫伤患者的、含有皮肤干患者的、含有皮肤干细细胞的健康皮肤切胞的健康皮肤切取下来取下来,进进行短行短暂暂体外培养体外培养,再重新植回患者的皮肤再重新植回患者的皮肤损损害部位害部位,发发现现尽管皮肤可愈合尽管皮肤可愈合,但不能但不能产产生汗腺和毛孔生汗腺和毛孔,无法行使正常功能无法行使正常功能.l第四第四节节 干干细细胞在再生医学中的胞在再生医学中的应应用用l成体干成体干细细胞的胞的“可塑性可塑性”或或“跨越分化跨越分化”潜能的潜能的发现发现具有重要的理具有重要的理论论意意义

100、义和和应应用价用价值值。不。不仅仅向向传统传统的的细细胞分化和胞分化和细细胞周期理胞周期理论论提提出了挑出了挑战战,而且成体干而且成体干细细胞在胞在细细胞生物学行胞生物学行为为上与癌上与癌细细胞很相似胞很相似,成了研究癌症成了研究癌症发发生机制新的生生机制新的生长长点。点。l在再生医学中可望利用成体干在再生医学中可望利用成体干细细胞修复胞修复创伤创伤、疾病的、疾病的细细胞治胞治疗疗并介入整形外科学和并介入整形外科学和组织组织工程学等方面工程学等方面,其中除了神其中除了神经经干干细细胞作胞作为脑损为脑损害的害的细细胞治胞治疗疗研究有研究有较较多的多的报报道外道外,大部分工作集中在大部分工作集中在

101、组组织织工程学工程学领领域域,干干细细胞在生物和再生医学中的胞在生物和再生医学中的应应用主要有下列用主要有下列4方面。方面。 l一、哺乳一、哺乳类发类发育的体外模型育的体外模型l干干细细胞胞(ES细细胞胞)因其富具独特的因其富具独特的发发育全能或多能性育全能或多能性质质,在嵌合体在嵌合体动动物中物中,ES细细胞又能参与个体胞又能参与个体发发育育,并并产产生包括生殖系在内的各生包括生殖系在内的各种种类类型型细细胞胞,表明表明ES细细胞胞类类似胚胎的似胚胎的ICM细细胞胞,不不仅仅具有完整的具有完整的发发育潜能性育潜能性,而且也持有而且也持有对调节对调节正常正常发发育所有信号的育所有信号的应应答能

102、力。答能力。l在特定的体外培养条件和在特定的体外培养条件和诱导剂诱导剂共同作用下共同作用下,ES细细胞在体外可被胞在体外可被诱导诱导分化属于分化属于3个胚个胚层谱层谱系的各种高度分化的体系的各种高度分化的体细细胞胞,如神如神经细经细胞、肌肉、血胞、肌肉、血细细胞、上皮胞、上皮细细胞和成胞和成纤维细纤维细胞等。同胞等。同时时,在在这这些些细细胞分化胞分化过过程中程中,必然先必然先经过经过一定的前体一定的前体细细胞胞阶阶段。段。l因此因此,ES细细胞不胞不仅仅是研究特定是研究特定类类型型细细胞分化的模型胞分化的模型,而且也是研而且也是研究某些前体究某些前体细细胞起源和胞起源和细细胞胞谱谱系演系演变

103、较变较理想的理想的实验实验体系体系.l可能可能ES细细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同,但但在分子水平包括在分子水平包括发发育的育的遗传遗传程序仍有共同或相似之程序仍有共同或相似之处处。小鼠的。小鼠的卵受精后的卵裂期卵受精后的卵裂期较长较长,约约 3天才到达天才到达16细细胞期胞期,进进一步分裂一步分裂,约约在在4.5 dpc时时形成囊胚。形成囊胚。这时这时胚胎出胚胎出现现第一次分化第一次分化,产产生以后参生以后参与胚外与胚外结结构的滋养外胚构的滋养外胚层层和原始内胚和原始内胚层层。胚泡内。胚泡内约约由由20个左右个左右细细胞胞组组成内成内细

104、细胞胞团团(ICM)。胚胎。胚胎进进一步增殖和空腔化一步增殖和空腔化(cavitation),约约在在5.0 dpc时时逐形成原始外胚逐形成原始外胚层层或上胚或上胚层层(epiblast),后者在原后者在原肠肠期除了主要期除了主要发发育成胎儿本体的育成胎儿本体的3个胚个胚层组织层组织外外,还还有部分有部分细细胞将胞将来参与胚外中胚来参与胚外中胚层层的的发发育。育。l悬悬浮生浮生长长的体外的体外细细胞胞拟拟胚体在胚体在结结构排列上与在体胚体的有些不构排列上与在体胚体的有些不同同,但一些但一些类类型的型的细细胞分化秩序和方式却非常胞分化秩序和方式却非常类类似于在体的胚似于在体的胚体。因此小鼠体。因

105、此小鼠ES 细细胞是研究哺乳胞是研究哺乳类发类发育的理想模型。育的理想模型。l人人ES细细胞建系后胞建系后, 法律和道德法律和道德伦伦理禁止用于人体胚胎研究理禁止用于人体胚胎研究.但近但近来来认识认识到到,ES细细胞本身缺乏胚外胞本身缺乏胚外组织组织,不可能不可能产产生完整的胚胎。生完整的胚胎。因此因此,许许多国家在法律上禁止以克隆或复制人多国家在法律上禁止以克隆或复制人为为目的的前提下目的的前提下,已允已允许许将人将人ES细细胞胞类类似于小鼠似于小鼠ES细细胞的体外胞的体外实验实验那那样样,用于研用于研究人究人类类胚胎在体内所不能分析的胚胎在体内所不能分析的发发育、分化和育、分化和调节调节信

106、号等事件信号等事件.l二、介二、介导导改造改造动动物的基因物的基因lES细细胞介胞介导导的的转转基因基因优优点明点明显显超超过过常常规规如逆如逆转录转录病毒病毒载载体整合体整合至早期胚胎或至早期胚胎或显显微注射微注射DNA至受精卵原核等一般至受精卵原核等一般转转基因方法基因方法, 因因为为在后一途径中在后一途径中,导导人的多拷人的多拷贝贝DNA存在着随意整合的存在着随意整合的问题问题,产产生的生的转转基因基因动动物效果一般不太理想。物效果一般不太理想。l利用利用ES细细胞技胞技术术学的学的优优点是在于点是在于产产生一种新的生一种新的经经生殖系生殖系传递传递的的转转基因基因动动物以前物以前,可通

107、可通过过在体外在体外ES细细胞系胞系统统中中,研究和研究和筛选筛选外源外源DNA表达表达质质粒的构建、整合和表达。从而可提高粒的构建、整合和表达。从而可提高产产生生转转基因基因动动物的效率物的效率;同同时时,ES细细胞在体外增殖迅速胞在体外增殖迅速,可作可作为为重重组组ES细细胞取之胞取之不尽的来源不尽的来源;ES细细胞的基因改造技胞的基因改造技术术,如剔除如剔除(knock out)、敲入敲入(knock in)能能够够精确地改造精确地改造细细胞内存在的基因胞内存在的基因,克服位置效克服位置效应应、插入失活、插入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重和特殊内源性基因失活等弊病。重组组ES细细胞的

108、基因胞的基因组经组经生殖系生殖系传递传递途径途径,可不断地提供和可不断地提供和产产生同生同样样基因型的、丰富的基因型的、丰富的转转基因基因动动物的种子物的种子细细胞来源。胞来源。l利用体外培养的体利用体外培养的体细细胞胞经经外源基因外源基因转转染后染后,取其取其细细胞核胞核显显微注微注射至去核卵射至去核卵细细胞胞,从而从而获获得得转转基因基因动动物物,这这一技一技术术路路线线比直接比直接显显微注射微注射DNA至去核卵至去核卵细细胞效果更好。胞效果更好。 l三、人体的基因和三、人体的基因和细细胞治胞治疗疗l干干细细胞生物学技胞生物学技术术和理和理论论的的发发展展,促使医学促使医学产产生了一生了一

109、门门新的学新的学科分支科分支,即再生医学即再生医学(regenerative medicine)。它是一它是一门门探索人体探索人体组织组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力,并使用多种修并使用多种修复复术术手段使人体的手段使人体的组织组织器官功能得以改善或恢复新器官功能得以改善或恢复新兴兴学科。学科。干干细细胞的基因和胞的基因和细细胞治胞治疗则疗则是再生医学的重要是再生医学的重要组组成部分之一成部分之一.l基因治基因治疗疗是指用是指用遗传遗传改造改造过过的人体的人体细细胞直接移植或胞直接移植或输输入患者入患者体内体内,达到控制和治愈疾病达到控制和治

110、愈疾病为为目的的治目的的治疗疗手段手段,又称又称细细胞治胞治疗疗。人人ES细细胞胞经遗传经遗传操作后一般能操作后一般能稳稳定地在体外增殖定地在体外增殖传传代代,克服了克服了目前基因治目前基因治疗疗中需大量靶中需大量靶细细胞来源的主要胞来源的主要问题问题。 l四、四、组织组织工程的种子工程的种子细细胞来源胞来源l组织组织工程的核心是由种子工程的核心是由种子细细胞和生物活性材料构成的三胞和生物活性材料构成的三维维空空间间复合体复合体. l构建像心、肝、构建像心、肝、肾肾、肺等大型精、肺等大型精细细复复杂杂的器官的器官还还需要技需要技术术上的上的突破突破,但作但作为为构建构建组织组织、器官的基本、器

111、官的基本单单元元,具具备备足足够够数量并保持数量并保持特定生物学活性的种子特定生物学活性的种子细细胞胞则则是是组织组织工程最基本的要素。工程最基本的要素。l目前缺目前缺损组织损组织或器官的修复主要有或器官的修复主要有3种方法种方法,即自体移植、异体即自体移植、异体移植和移植和组织组织代用品。代用品。这这3种方法都受到客种方法都受到客观观条件的限制条件的限制,自体移自体移植必植必须牺须牺牲自身的正常器官牲自身的正常器官,更何况自体的心、肝、膜等器官更何况自体的心、肝、膜等器官独一无二独一无二,岂岂能移植能移植?异体移植不异体移植不仅仅器官来源极有限器官来源极有限,而且即使被而且即使被移植后常易移

112、植后常易发发生生组织组织排斥反排斥反应应被移植物不易成活。采用被移植物不易成活。采用组织组织代代用品如硅橡胶、不用品如硅橡胶、不锈钢锈钢和和镰铁镰铁合金等合金等则则与人体与人体组织组织兼容性差兼容性差,效果不太理想。效果不太理想。l自体或异体移植的种子自体或异体移植的种子细细胞尽管存在来源有限、易老化、不易胞尽管存在来源有限、易老化、不易大量大量扩扩增以及取材增以及取材对对机体造成机体造成创伤创伤等弊病等弊病,在胚胎干在胚胎干细细胞定向胞定向诱导诱导分化和免疫排斥反分化和免疫排斥反应应等等问题问题未解决之前未解决之前,自体或异体的同自体或异体的同源干源干细细胞仍是胞仍是组织组织工程种子工程种子细细胞胞较较理想的来源之一。理想的来源之一。