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1、三代基因组编辑技术基因组编辑技术的介绍基因组编辑技术的介绍p基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。p这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。p通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因p基因组编辑是研究基因功能的重要手基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点生物学
2、的研究热点- 是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。- 对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不 同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。 锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNARNA的序 列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合 在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以 及胚胎发育。- 结构 24-30 个氨基酸残基 形成-二级结构 两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。What is a Zinc Finger?Zinc finger nuclease (ZFN) 由一个 DNA 结合域（DNA-binding do
3、main）和一个非特异性核酸内切酶Fok1构成。DNA 结合域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 34 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。Genetics, Vol. 188, 773782ZFN mediated genome editingFOK1二聚体互作与非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等方法结合使用同源二聚体或单一ZFN单元的结合造成非特异性酶切，即脱靶效应（off-target）ZFN mediated ge
4、nome editing ZFN的限制性的限制性已建有已建有ZFN库，识别多种库，识别多种DNA序列，但不序列，但不能达到识别任意靶能达到识别任意靶DNA，其应用受到限制。，其应用受到限制。细胞毒性细胞毒性大量脱靶位点的出现导致基因组大量脱靶位点的出现导致基因组的破坏的破坏构建繁琐构建繁琐识别特性决定构建难度大，时间识别特性决定构建难度大，时间长长Transcription activator like effector nuclease(TALEN)Plant Bacterial TAL Effector n发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs
5、3基因n发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA. 2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、n应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述Functional domains of Xanthomonas TAL effectorspN-端包括一个移位子信号端包括一个移位子信号pC-端包括一个核定位信号和转录激活域端包括一个核定位信号和转录激活域p中间的重复序列决定其特异性中间的重复序列决定其特异性 The number of repeats in TAL effectors
6、 varies between 1.5 and 33.5 The general repeat length is 34 aaTAL 效应蛋白的不同结构功能域Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectorsl一系列（12或以上）串联重复序列构成识别元件l每个重复有34个氨基酸残基l除12和13位其余都高度保守l重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues, RVD) NI-A, HD-C, NN-G/A, and NG-TlOrigin： bacterium Flavobacterium ok
7、eanokoites海床黄杆菌海床黄杆菌l由一个N-端DNA识别域和C端剪切域组成lFokI 二聚化才有剪切活性Structure of the FokI dimerFok ITale nucleases (TALENs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain16The principle of TALEN-mediated gene targeting(基本原则基本原则).利用TALEN在特定位点创造DSB.利用细胞HR（同源重组）修复机制实现基因修饰.利用细胞NHEJ（非同源性末端接合
8、）修复机制实现基因修饰TALENs的优缺点TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而，构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作性较低。 CRISPR/Cas9 system CRISPR-Cas系统简介系统简介 CRISPR-Cas系统的研究历史系统的研究历史p1987 年，日本课题组在年，
9、日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，年，正式将其命名为正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文成簇的规律间隔的短回文重复序列重复序列p2005 年发现年发现CRISPR 的间隔序列的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
10、方式抵抗外源遗传物质的入侵。p2007 年，年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入系统抵抗噬菌体入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等发现细菌等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能系统的功能p2013 年初，年初，MIT 的研究组首次利用的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人系统对人293T 细胞细胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 细胞细胞Th 基因实现了定点突变。同基因实现了定点突变
11、。同年年Mali 利用利用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 细胞和细胞和K652 细胞基因的靶位点形成细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定修复机制高效介导外源基因定点插入。点插入。 CRISPR-Cas系统的结构系统的结构pCRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。 CasCas蛋白是一种双链蛋白是一种双链DNAD
12、NA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引导下对靶位点进行切割。它引导下对靶位点进行切割。它与与folkfolk酶功能类似，但是它并不需要形成酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。二聚体才能发挥作用。 CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理 CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理p CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是
13、对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating crRNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ）Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构
14、域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。HNHRuvCN代表任意DNA碱基Mechanism of CRISPR/Cas9 to target DNA蛋白质：核酸聚合物蛋白质：核酸聚合物CRISPR/Cas在基因改造中的应用在基因改造中的应用CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer发现tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5端与成熟的crRNA 3端有部分序列(约1
15、3 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA与靶点的配对可能十分重要 根据tracrRNA与crRNA的结构特性，他们tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA (guide RNA，gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能CRISPR/Cas系统有三类，其中Type型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白 目前，产脓链球菌(SF370)的Type型系统（CRISPR/Cas9）是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞 小鼠 斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。CRISPR/Cas9系
16、统的成功应用案例系统的成功应用案例2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISER-Cas systems一文中，作者利用CRISER-Cas systems用设计好的DNA莫版替换相应基因来达到定点修饰2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼
17、胚胎基因进行修饰2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-
18、34%和51%-79% ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 的比较的比较均由自然界存在的核酸酶系统改造而来均具有识别核酸碱基特异性的结构域发挥作用的机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰Differences of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9ZFNTALENCRISPR/Cas9系统大小1 kb 2 3 kb 2 4.2 kb (Cas9 from Streptococcus pyogenes) + 0.1 kb (sgRNA) 识别模块Zinc-finger proteins Transcription activa
19、tor-like effectorscrRNA or sgRNA 识别序列长度1836 bp3040 bp 22 bp (total length 23 bp) 识别序列限制性G-rich Start with T and end with A (owing to the heterodimer structure) End with an NGG or NAG (lower activity) sequence (that is, PAM) 切割模块FokIFokICas9切割效率Low or variable (10%) High (20%) High (20%) 脱靶效应High Low
20、 Variable 细胞毒性Variable to high LowLowCRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9技术的优势技术的优势p而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。p只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。p编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。p较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。 CRISPR CRISPR/ /Cas9Cas9系统的应用前景
21、系统的应用前景p目前应用CRISPR/Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将种主要生物聚合物（、和蛋白质）结合在一起的特殊能力。p各种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用gRNA的靶向作用结合到ds的任意位点，发挥人们预期的功能。 例如：Cas9如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9复合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调控的目的。CRISPR/Cas9的切割是通过向导RNA
22、（sgRNA）与基因组位点之间20bp碱基的配对，再引导Cas9实现的，但是CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于sgRNA与靠近PAM(NGG)处10-12bp碱基的配对，其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响较小，而我们知道，要想在一个基因组中产生特异性位点至少需要16个碱基的配对才可实现特异。同时文献中报道Cas9也可以识别NAG附近的序列并进行打靶，这些研究说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这些问题严重地限制了CRISPR/Cas9的应用。Potential off target of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9的潜在脱靶效应
