《DNA片段的连接》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA片段的连接（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验三实验三 DNA片段的连接片段的连接 （向质粒载体中插入外源（向质粒载体中插入外源DNA片段）片段） 实验目的实验目的 : 了解了解DNA片段连接的片段连接的原理原理，掌握掌握DNA连接的连接的方法方法。 实验原理实验原理 : DNA片段之间的连接主要片段之间的连接主要是在是在DNA连接酶连接酶的作用下，使的作用下，使DNA裂裂口上核苷酸裸露的口上核苷酸裸露的3羟基羟基和和5磷酸之间磷酸之间形成共价结合的形成共价结合的磷酸二酯键磷酸二酯键，使原来断，使原来断开的开的DNA裂口裂口连接起来连接起来。 实验仪器、材料与试剂实验仪器、材料与试剂 （一）（一）仪器仪器 1. 恒温水浴锅或恒温箱恒温
2、水浴锅或恒温箱 2. 微量取液器微量取液器 （二）（二）材料材料 “实验二实验二” 回收的回收的DNA片段片段（三）（三）试剂试剂 试剂盒所带：试剂盒所带：Solution I (TaKaRa)实验步骤实验步骤 1.加入加入加入加入pMD18-T VectorpMD18-T Vector（约（约（约（约0.03pmol0.03pmol，质粒载体，质粒载体，质粒载体，质粒载体DNADNA）1L1L，及上个，及上个，及上个，及上个实验回收的实验回收的实验回收的实验回收的DNADNA（约（约（约（约0.10.10.3pmol0.3pmol，插入片段）的，插入片段）的，插入片段）的，插入片段）的DNA
3、DNA溶液（溶液（溶液（溶液（TETE缓冲液或缓冲液或缓冲液或缓冲液或去离子水）去离子水）去离子水）去离子水）4L4L，总体积为，总体积为，总体积为，总体积为5L5L。 2.加入与加入与加入与加入与DNADNA溶液等量的溶液等量的溶液等量的溶液等量的Solution ISolution I（其中包括连（其中包括连（其中包括连（其中包括连接酶、接酶、接酶、接酶、BufferBuffer、双蒸水）、双蒸水）、双蒸水）、双蒸水）5L5L。 3.混合均匀后混合均匀后混合均匀后混合均匀后, ,3000-4000rpm 3000-4000rpm 离心离心离心离心20-3020-30秒秒秒秒；最好；最好；最
4、好；最好再混合再混合再混合再混合并并并并离心离心离心离心一次。一次。一次。一次。4.1616下连接下连接下连接下连接4545分钟至分钟至分钟至分钟至1 1小时小时小时小时。 5.放于放于放于放于-20-20冰箱中，用于下次实验的转化。冰箱中，用于下次实验的转化。冰箱中，用于下次实验的转化。冰箱中，用于下次实验的转化。6.当直接进行转化时，取上述连接反应液当直接进行转化时，取上述连接反应液当直接进行转化时，取上述连接反应液当直接进行转化时，取上述连接反应液10L10L 转转转转化至化至化至化至100-200L100-200L的感受态细胞。的感受态细胞。的感受态细胞。的感受态细胞。 pMD18-T
5、 VectorT-载体连接酶：把基因缝在一起连接酶：把基因缝在一起注意事项注意事项回收的回收的PCR产物、载体产物、载体以及以及SolutionI组成的组成的10L反应体系反应体系需需充分混匀充分混匀。在取在取SolutionI时，应使之时，应使之不离开冰盒不离开冰盒，以防，以防酶活性的破坏。酶活性的破坏。如果反应温度升高（如果反应温度升高（26），较难形成环），较难形成环状状DNA。因此反应必须于。因此反应必须于16进行。进行。 当连接反应难以进行时，可以适当当连接反应难以进行时，可以适当延长反应延长反应时间时间。当连接效率仍然无所改变时，可对。当连接效率仍然无所改变时，可对DNA进行进行乙
6、醇沉淀乙醇沉淀从而从而浓缩后浓缩后再反应。再反应。连接反应液可以连接反应液可以直接用于转化直接用于转化，如发现转化，如发现转化效率效率偏低偏低时，反应结束后向反应液中时，反应结束后向反应液中添加添加NaCl使其终浓度为使其终浓度为500mM，然后进行转化，然后进行转化，可可改善转化效率改善转化效率。另外，当另外，当转化转化DNA量较大量较大或者利用或者利用电刺激电刺激转化转化时，先用时，先用乙醇沉淀法乙醇沉淀法精制精制DNA。 载体结构的三大要素：载体结构的三大要素： 多克隆位点多克隆位点 选择标记（耐药性，选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位独立的复制单位载体种类：载体种类： 质粒质粒 噬菌体噬菌体 酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体反转录病毒载体 表达载体等表达载体等
