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1、实验一实验一 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定 纸层析法纸层析法【实验目的】【实验目的】 学习氨基酸纸层析法的基本原理学习氨基酸纸层析法的基本原理掌握氨基酸纸层析的操作技术掌握氨基酸纸层析的操作技术 纸层析法纸层析法属于分配层析，它是以层析滤纸为属于分配层析，它是以层析滤纸为载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性）为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸（非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸的极性，在固定相和流动相中的的极性，在固定相和流动相中的分配系数分配系数
2、不同而不同而进行分离的（依据相似相溶原理）。进行分离的（依据相似相溶原理）。【实验原理】【实验原理】分配系数分配系数：K 两种溶剂两种溶剂A、B，一种溶质，一种溶质M，即可溶于，即可溶于A，也可溶于，也可溶于B。先将先将M溶于溶于A中，然后加入中，然后加入B，这时，这时A中的中的M将部分转将部分转移到移到B中，当达到平衡时，只要温度不变，中，当达到平衡时，只要温度不变，M分配于分配于A、B中的浓度中的浓度Ca、Cb不会改变，两者的比值是一个常数不会改变，两者的比值是一个常数K。K被称为被称为M在在A和和B中的中的分配系数分配系数。即。即K=Ca/Cb 它是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征
3、参数。它是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。 氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值值(比比移值移值)来表示的。来表示的。 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。【实验器材与试剂】【实验器材与试剂】1、层析缸、层析缸 2、毛细管、毛细管 3、喉头喷雾器、喉头喷雾器 4、培养皿、培养皿 5、层析滤纸、层析滤纸(新华新华1号号)6、铅笔（直尺）、铅笔（直尺）7、分液漏斗、分液漏斗 8、吹风机、吹风机9、 正丁醇正丁醇10、冰醋酸、冰醋酸11、氨基酸标准样品、氨基酸标准
4、样品12、氨基酸混合样品、氨基酸混合样品13、0.1%水合茚三水合茚三 酮正丁醇溶液酮正丁醇溶液【实验步骤】【实验步骤】1、配扩展剂： 正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml 顺序：正丁醇冰醋酸水，放入分液漏斗中，充分混匀。静置约10min后分层，放出下层水层，其余的倒入培养皿中。2. 准备滤纸准备滤纸 取一张层析滤纸，距纸底边2cm处用铅笔划一横线，沿线每隔2.5cm作一记号为点样处，点样处也不要太靠近两侧边（约距1.5cm），会产生边缘效应。 3.点样点样（顺纸纹方向） 用毛细管依次吸取标准品氨基酸和混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸面，样品扩散直径小于3mm。一滴滴完后用冷
5、风冷风吹干，再点第二次，共点三次。4.扩展扩展 将点完样的滤纸两侧面对齐，将点完样的滤纸两侧面对齐，用针线缝合，纸的两边不能接触。用针线缝合，纸的两边不能接触。将点样后的滤纸直立于培养皿的将点样后的滤纸直立于培养皿的扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂中，（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线扩展剂的液面需低于点样线1 cm ）当溶剂展层至滤纸上沿）当溶剂展层至滤纸上沿2cm处处展层结束，取出滤纸。用铅笔画展层结束，取出滤纸。用铅笔画出展层前沿位置，在出展层前沿位置，在通风橱中通风橱中用用热风热风吹干。吹干。5. 显色显色 用喉头喷雾器均匀用喉头喷雾器均匀喷上喷上0.1茚三酮正丁茚三酮正丁醇
6、溶液，然后用醇溶液，然后用热风热风吹干即可显出各层析吹干即可显出各层析斑点。斑点。6. 测量、计算：测量、计算： 分别测量分别测量X、Y值，值，计算各氨基酸的计算各氨基酸的Rf值。值。 Rf= XY注意事项注意事项1 、铅笔、格尺自备。、铅笔、格尺自备。2、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。3、吸取样品的毛细管不可混用。、吸取样品的毛细管不可混用。4、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距 离不能太近。离不能太近。5、吹干时一定要保证完全吹干。、吹干时一定要保证完全吹干。6、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并、缝合时
7、，滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。 7、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于3mm。8、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。并用食指堵管口。9、使用移液管时，应先看清管的最大刻度，、使用移液管时，应先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。每一格代表多少后再量取。10、 15ml水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。11、 实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸及
8、其中的培养皿。及其中的培养皿。12、有机废液倒入右侧实验台上的、有机废液倒入右侧实验台上的“废液收集有机废液收集有机溶剂溶剂”大试剂瓶中。大试剂瓶中。13、 实验结束实验结束, 回收竹夹子、回收竹夹子、A4复印纸、电吹风。复印纸、电吹风。14、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸贴在其中一位同学的实验报告上。贴在其中一位同学的实验报告上。15、坐椅推入实验台下，空出过道。、坐椅推入实验台下，空出过道。【结果分析与讨论结果分析与讨论】 【思考题思考题】通过本次实验，讨论下列问题：（1）简述纸层析的原理。（2）判断氨基酸极性大小顺序，讨论AA极性与Rf的关系？（3）什么是Rf值？影响的主要因素是什么？下周实验：脂质的薄层层析下周实验：脂质的薄层层析 （405实验室）实验室）每组清洗一块玻璃板，置于烘箱中备用。每组清洗一块玻璃板，置于烘箱中备用。
