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1、第二章第二章 园艺植物组织培养园艺植物组织培养Tissue culture of horticultural plants第一节第一节概说概说组织培养(Tissue culture)指通过无菌操作分 离 植 物 体 的 一 部 分 ， 即 外 植 体（explants）接种到人工培养基，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程，也称为离体培养（In Vitro Culture）。一、概念二、分类根据接种外植体不同，分为：茎尖培养(shoottipculture)胚胎培养(embryo/ovule/ovaryculture)花药/花粉培养（anther/
2、pollen/microsporeculture）器官培养(organculture)组织或愈伤组织培养(tissueorcallusculture)细胞/原生质体培养(cell/protoplastculture)根据培养过程：l将从植株体上分离下来的第一次培养称为初代培养(primaryculture)l以后培养体转移到的培养基，则统称为继代培养(subculture)根据培养方式：l将加琼脂的培养基称为固体培养基(solidmedium)l不加琼脂的培养基称为液体培养基(liquidmedium)三、内容1.愈伤组织培养（callusculture）：植物各种器官或组织增殖而成的细胞团的
3、培养。利用愈伤组织培养，在理论上可以阐明植物细胞的全能性和形态发育的可塑性，还可以诱导产生不定芽或胚状体而形成植株。2.器官培养(organculture)：主要是根端、茎尖、叶与未成熟果实等培养。根端的离体培养是研究生物合成的和一种手段，茎尖培养具有快速繁殖和去除病毒的优点。3.胚培养(embryoculture)：主要是对较小且未成熟的胚进行培养，研究胚胎的发生以及影响胚生长的因素，特别是所需有机营养成分的研究。4.胚珠和子房培养(ovuleandovaryculture)：培养已传粉的子房及胚珠，是进行试管受精和诱导单倍体植株的一个途径，也是研究生殖生理的有效方法。l5胚乳培养(endo
4、spermculture)是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系以及获得无籽结实的三倍体植株的手段。l6花粉和花药培养(pollen/antherculture)：利用花粉具有整套染色体的特点，诱导产生单倍体植株进行育种，可以缩短育种周期，获得纯系。7细胞培养(cellculture)：分散性好的离体细胞或细胞团的培养，可应用于生产提取某些有用成分和次生物质，单细胞培养还可用于取得单细胞无性系，进行突变体选育。8.原生质体培养(protoplastculture)：将去壁后裸露的原生质体进行培养。易于摄取外来遗传物质，细胞器及病毒、细菌，应用于体细胞杂交或外源基因的导入研究。哪些过程涉及减数分裂和遗
5、传重组与分离？ 哪些材料培养获得的组培苗有童期？ 四、组织培养的意义园艺植物组织培养的意义和应用营养生理细胞生理和代谢基因重组新的技术手段生物合成l加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。l克服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。l获得三倍体。l快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。l获得无病毒苗木。lIn vitro (cryo-) preservation of germplasm五、组织培养理论与技术发展简史1.探索阶段1902年，植物生理学家（德），根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）
6、的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完全植株的潜在能力。HABERLANDTlThefatherofplanttissuecultureisconsideredtobetheGermanBotanistHABERLANDTwhoconceivedtheconceptofcellculturein1902.2.奠基阶段奠基阶段l1934年，White利用藻类用的无机盐培养基加上葡萄糖和酵母，建立了番茄离体根无性繁殖系。l1934年，Guillarmond（法）的学生，Gantheret，利用山毛柳、黑杨形成层组织培养。l1937年,White发现VB簇对根生长重要。四十
7、年代-lSkoog&崔澂，腺嘌呤或腺苷可诱导形成芽。五十、六十年代-lMorel&Martin从受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。lMuir单细胞培养。3.迅速发展阶段迅速发展阶段七十年代-l原生质体培养和体细胞杂交。l原核生物噬菌体在寄主大肠杆菌中复制DNA，得到遗体稳定的突变DNA克隆。八十年代-l转基因技术迅速发展，全球已有12种作物的48种转基因作物产品获准进行商品化生产，至2001年全球基因作物种植面积达5260万公顷。被批准进入商品化生产l转基因耐贮藏番茄l转查尔酮合成酶基因矮牵牛l抗病毒甜椒l抗病毒番茄l抗虫棉l近20年，对植物的快速繁殖与脱毒、种质保存、次生物质生产、细胞工程
8、和基因工程等生物技术育种、以及遗传学和生物学基础理论进行了广泛的研究。技术的发展Development of the technique（一）材料范围的逐步扩大器官组织、细胞、原生质体低等苔鲜高等植物（二）培养方法的逐步发展l静止液体振荡或旋转改善O2悬浮培养、深层培养l小量大量l试管大罐l手工自动化（三）培养基的逐步改进l随着化学工业发展而迅速发展l各种配方以成品方式出售（四）实验手段的逐步完善新型显微镜新型分子标记新型倍性分析仪（FCM）第二节 组织培养原理与技术 Totipotency: theabilityofundifferentiatedplanttissuestodifferen
9、tiateintofunctionalplantswhenculturedinvitrol细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。l受精卵：可以产生具有完整形态和结构和功能的植株。l体细胞：也具备遗传信息的传递、转录和翻译的能力。乳腺细胞克隆羊乳腺细胞克隆羊Competency（ 再再 生生 作作 用用 ） : the endogenous potential of a given cell or tissue to develop in a particular wayPlantcellandtissueculture: cultural tec
10、hniques for regeneration of functional plants from embryonic tissues, tissue fragments, calli, isolated cells, or protoplastsDefinitionsBasis for cell culture Plant cells are totipotent; Have the ability to develop into whole plants or plantorgans in vitro when given the correct conditions Not all p
11、lant cells are totipotent. However, there are asufficient number of totipotent cells in the plant (e.g. in the pith木髓) Differentiated cells have to be dedifferentiated into callus and redifferentiated back to somatic embryo that will regenerate the entire plantCallus Is a natural response of the pla
12、nt tissue to wounding A mass of actively dividing undifferentiated cells producedby plant tissue explant Cells are totipotent Callus can be Resuspended in liquid media to create a susupensionculture of single totipotent cells Or differentiated into plant with the appropriatemanipulations of culture
13、conditions两条繁殖途径(1)器官发生（organogenesis），通常由培养的组织或细胞产生愈伤组织（callus），再产生芽和根。(2)胚胎发生（somaticcellembryogenesis），即由培养的组织产生愈伤组织，通过悬浮培养，或直接产生大量胚状体（embryoid），再长成植株。通过胚状体培养可以得到大量的植株。Organogenesis: The process of initiation and development of a structure that shows natural organ form and/or function.Embryogenes
14、is:Theprocessofinitiationanddevelopmentofembryosorembryo-likestructuresfromsomaticcells(Somaticembryogenesis).Virus-free strawberry plantlets by anther cultureAdventitiousbudofaloe芦荟Adventitiousproductfromcallusoforchid器官发生繁殖的4种方式1通过茎尖培养产生大量腋芽植物茎尖部分是分生组织区，是产生植物组织地上部分的全能性区域。叶脉分生 组 织 受 到 顶 端 优 势 （ Api
15、calDominance）的抑制，而调整细胞分裂素浓度，可以促进腋芽的生长。培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添加长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果需要使用激素，一定要严格外源激素，如果需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。控制浓度，以防止产生愈伤组织。腋腋 芽芽 增增 殖殖例：唐菖蒲6weeks+BA0.5mg/L长主芽+BA1mg/L1个侧芽+BA2mg/L3个侧芽例：菊花BA增加，腋芽的萌发量增加。NAA减少，腋芽的萌发量增加。2通过器官培养直接诱导不定芽Tulip Tulip
16、bulb bulb produced produced after after 6 6 months months with with young young flower flower stalks stalks are are the the starting starting materialmaterial从现存的芽以外的从现存的芽以外的任何器官、组织任何器官、组织上通过器官发生上通过器官发生重新形成的芽称重新形成的芽称为不定芽。为不定芽。特点：繁殖系数高，特点：繁殖系数高， 遗传稳定性较好。遗传稳定性较好。 但继代次数有限。但继代次数有限。不定芽增殖3通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽
17、通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽 l接种的组织或器官小块在培养基上生长，去分化形成愈伤组织；为诱导愈伤组织生长，采用较强的生长素浓度。l多数植物的愈伤组织需要低生长素含量，高细胞分裂素浓度的培养基才会分化产生不定芽，且有的在不含生长素的培养基上也可以分化。所有植物通过组织培养均可诱导愈伤所有植物通过组织培养均可诱导愈伤组织，进一步分化即可获得小植株。组织，进一步分化即可获得小植株。该途径经历了组织培养技术的所有该途径经历了组织培养技术的所有过程过程( (愈伤组织诱导愈伤组织增殖愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株芽分化生根完整植株) )，它属，它属于真正意义上的组织培养。于真正意义上的组
18、织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可通过此途径获得组培苗。物，均可通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高，繁殖系数大，但其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁。径快繁。 愈伤组织增殖Callus Is a natural response of the plant tissue to wounding A mass of actively dividing undifferentiated cells produced by pla
19、nt tissue explant Cells are totipotent Callus can be resuspended in liquid media to create a suspension culture of single totipotent cells Or differentiated into plant with the appropriatemanipulations of culture conditionsCell suspension culture增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除
20、还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外( (人人工种子工种子) )，这一途径还没有用于快繁技术。，这一途径还没有用于快繁技术。 4、体细胞胚增殖Basis for Plant Tissue CultureTwoHormonesAffectPlantDifferentiation:Auxin:StimulatesRootDevelopmentCytokinin:StimulatesShootDevelopmentGenerally,theratioofthesetwohormonescandetermineplantdevelopment
21、:AuxinCytokinin=RootDevelopmentCytokininAuxin=ShootDevelopmentAuxin=Cytokinin=CallusDevelopment植物的再生作用l再生作用（competency）植物内在的通过某个器官（根、茎、叶等）发育成完整植株的能力。1扦插的园艺植物有100多种。枝插：梅、葡萄、菊花等；叶插：秋海棠、卷柏、月季；根插：柿、树莓。2受伤的部位往往可产生新的器官：如长出不定芽，或不定根。3再生：主要取决于内源激素调整是否快或完全。细胞分化和形态建成1合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；2体细胞生长（类似），开始是
22、进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，首先要经过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）最常见的再分化是根的形成：3种方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，较易产生根；（3）同时产生芽和根。l一般而言，芽和茎叶原基起源于组织培养中比较表层的细胞（外起源）l根原基则发生在组织较深处（内起源）l在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，而成为完整的植株。l有分化胚状体能力的种子植物已有117种（分属于3
23、4科，75属）。胚状体可从以下几种培养物中产生：1直接从器官上发生；2从愈伤组织上发生；3从游离的单细胞发生；4从小孢子发生。诱导胚状体与诱导芽相比，有3个显著优点：1数量多、速度快、结构完整；2胚状体以单细胞直接分化成小植株，比经过愈伤组织再分化要快；3胚状体一旦形成即可再生小植株，成苗率高。Factors Affecting Plant Tissue CultureGrowthMediaMinerals,Growthfactors,Carbonsource,HormonesEnvironmentalFactorsLight,Temperature,Photoperiod,Sterility
24、,MediaExplantSourceUsually,theyounger,lessdifferentiatedtheexplant,thebetterfortissuecultureGeneticsDifferentspeciesshowdifferencesinamenabilitytotissuecultureInmanycases,differentgenotypeswithinaspecieswillhavevariableresponsestotissueculture;responsetosomaticembryogenesishasbeentransferredbetweenm
25、eloncultivarsthroughsexualhybridization第三节 实验室设计及基本设备实验室设置实验室设置基本技术基本技术培养基及其配制培养基及其配制外植体外植体接种培养接种培养实实验验室室设设置置实验室组成实验室组成基本设备配置基本设备配置培养容器与用具培养容器与用具实验室的基本要求实验室的基本要求实验准备实验准备包括培养基配制，包括培养基配制，洗涤与灭菌等洗涤与灭菌等无菌操作无菌操作控制培养控制培养Culture roomCulture roomPreparation Preparation roomroomSterile Sterile roomroomS St te
26、 er ri il le e o op pe er ra at ti io on nCytology Cytology roomroomTransiTransi- -tiontion area area实验室布局示意图实验室布局示意图基基本本实实验验室室 准备室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止清洁，能较长时间保持无菌。
27、为了保持清洁，接种室应防止空气对流。空气对流。 培养室培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。应保持干燥和清洁。辅 助 实 验 室细胞学实验室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。染。摄影室及暗室摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。其
28、功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。进行取样检查。 基本设备配置基本设备基本设备灭菌设备灭菌设备光照培养室与设备光照培养室与设备无菌操作设备无菌操作设备细胞学鉴定设备细胞学鉴定设备天平天平 ，冰箱，冰箱 ，酸度计酸度计 ，纯水器，纯水器 活性成分过活性成分过滤灭菌滤灭菌接种工具随接种工具随时消毒时消毒培养基
29、灭菌培养基灭菌玻璃器皿灭菌玻璃器皿灭菌防止空气对流定期消毒保持干燥,控制光照和温度精确培养使用特殊设备培养容器与用具l玻璃容器玻璃容器l塑料容器塑料容器l金属用具金属用具l塑料用具塑料用具倒置显微镜倒置显微镜研究显微镜研究显微镜激光共激光共聚焦聚焦显微操作仪显微操作仪第四节第四节组织培养基组织培养基（Culture media）一培养基的种类和成分培养基的种类1培养基是组织培养最重要的基质。2培养基的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。3国际上常用的五种培养基：MS：Murashige和Skoog(1962)MT: Murashige 和和Tucker (1969)ER：Eriksson（
30、1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）lMS（Murashige和Skoog1962）lM6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养lMiller（1963）：一般组织培养lH（Bowgin和Nitsch）：一般组织培养lT（一般组织培养）lWhite（1963）：一般组织培养lB5（Gamborgetal1968）一般组织培养lC17（王培等1986）：小麦花药培养lW14（欧阳俊闻等1988）：小麦花药培养lKM8P（Kaoetal1975）：原生质体培养lLloydandMccoun（Lloyd
31、1980）：木本植物培养lRM（Reinentetal1967）：兰花l4各培养基特点lMS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。lER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。lB5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。lSH：与B5相似，无机盐的含量稍高。lHE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。培养基成分主要为五大类：水无机盐有机化合物培养体支持材料抗生素及中药天然复合物（一）水自来水重蒸馏水蒸馏水（二）无机盐（inorganic element）1大量元素lN：硝态氮、铵态氮。lP：ATP合成不可少，培养基中一般以PO34的形式添加。lK、Ca、
32、Mg、S：必须元素，浓度一般在13毫克分子较适合。2微量元素Fe：l有利于合成叶绿素，是植物细胞分裂和延长所必需的。l一般使用Fe2(SO4)3和FeCl3，pH5.2以上时，成 Fe(OH)3的 不 溶 性 沉 淀 ， 常 以FeSO4.7H2O和NaEDTA使用。Mn、Cu、Zn、Mu：组织培养常需要。（三）有机化合物1碳水化合物蔗糖：浓度为23%，胚培养时，可加45%其它：葡萄糖、果糖、麦芽糖。2植物激素（1）植物生命活动中不可缺少的物质，主要是促进细胞分裂生长及诱导器官分化。（2）组织培养用的较多的有：IAA、NAA、2,4-D、KT、BA。3.维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸
33、、一般0.10.5mg/L。维生素C：可防止组织变褐；维生素B1：与愈伤组织的产生和生活力有密切关系；维生素B6：对根的生长有促进；烟酸：对植物代谢和胚的发育有作用。4肌醇：一般用量100mg/L（1）对组织、细胞繁殖、分化有促进；（2）对细胞壁的形成有作用；（3）还可增强愈伤组织的生长。5氨基酸（1）对培养体的生长、分化起重要作用；（2）但单独添加进往往起阻碍作用，几种混合时才有好的作用。（四）天然复合物（1）含氨基酸、激素、酶等复杂化合物，如；（2）对细胞和组织的增殖与分化有促进，但对器官分化不明显；（3）成分不清，一般应尽是避免使用。1椰乳coconutmilk（1）使用最多、效果最大的
34、一种，浓度在1020%；（2）对愈伤组织和细胞培养有促进作用。2香蕉（1）黄熟的小香蕉，150200g/L（2）对pH的缓冲作用大，主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进。3胳朊加水分解物（1）主要成分为氨基酸，浓度100200mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4马铃薯（1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200mg/L。（2）对pH缓冲作用大。5其它（1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。（2）遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。（五）培养材料的支持物1琼脂（agar)（1）凝固剂，一般0.61%.（2）为防此有害物质毒害，可加110g/L
35、的活性炭。2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。（六）抗生物质防止内生菌，可加抗生物质。Hypocotyls of papaya Hypocotyls of papaya were contaminated by were contaminated by endogenous bacteriaendogenous bacteria培养基的制备（一）母液配制和保存1.为减少工作量，一般配制所需浓度高10-100倍的母液(Stocksolution)；2配制母液，按所使用药品的类别，分别配成大量元素、微量元素、维生素等；3保存：无机成分在一起时，可能产生沉淀，应分别保存；4要用重蒸馏水，等级较高的化学纯或分
36、析纯的药品，称量或定容要准确；5配好的母液瓶上注明母液号、配制倍数、日期、及配1升培养基时应取的量。6低温下可保存几个月。培 养 基 配 制大量元素配制成大量元素配制成10-2010-20的母液的母液微量元素配制成微量元素配制成100-200100-200的母液的母液激素单独配制成激素单独配制成mg/mlmg/ml的母液的母液培养用培养基按需要按比例加入培养用培养基按需要按比例加入成成分分用量用量每升培养每升培养基用量基用量成成分分用量用量每升培每升培养基用养基用量量1）母液母液（大量元素，（大量元素，20）g/5L2）ml母液母液（铁盐，（铁盐，100）mg/lmlNH4NO3165.050
37、FeSO4.7H2O2780.010KNO3190.0Na2.EDTA.2H2O3730.0CaCl2.2H2O44.03）有机成分（有机成分（100）mg/lmlMgSO4.7H2O37.0肌醇肌醇1000010KH2PO417.0烟酸烟酸5010母液母液（微量元素，（微量元素，100）(mg/l)ml盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇5010KI83.0010盐酸硫胺素盐酸硫胺素1010H3BO3620.00甘氨酸甘氨酸20010MnSO4.4H2O2230.001）：大量元素母液配制时按表中的顺序进行混匀：大量元素母液配制时按表中的顺序进行混匀ZnSO4.7H2O860.002）：）：混合贮存于混合贮
38、存于5L的容量瓶中的容量瓶中Na2MoO4.2H2O25.003）：）：有机成分分别存放有机成分分别存放CuSO4.5H2O2.50CoCl2.6H2O2.50（二）过程加重蒸馏水按序加母液生长调节物质加蔗糖熔琼脂（三）pH值的调节1一般加0.11N的HCl（或NaOH）；2通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中pH变化高压灭菌引起pH变化（四）培养基分注：趁热分注1三种方法：虹吸式、滴管方法、漏斗；2分注适量，一般占试管或三角瓶的1/31/4；3不要把培养基粘到管壁；分注后马上用棉盖塞住，并做好标记。（五）灭菌和
39、洗涤1灭菌（1）高压蒸气锅灭菌，压力0.81.1kg/cm2，保持1520min。（3）进行三天预培养，一般至多保存2周。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至热至1504015040分钟，或分钟，或12021202小时。小时。金属器皿：干热灭菌。金属器皿：干热灭菌。接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，每醛加高锰酸钾，每100ml100ml甲醛加甲醛加5g5g高锰酸钾。高锰酸钾。 培养基体积与灭菌时间的关培养
40、基体积与灭菌时间的关系系培养基体积培养基体积（mlml）灭菌温度灭菌温度（）灭菌时间灭菌时间（min.min.）202050501211212020505050050012112125255005005000500012512535352洗涤（1）小口器皿：清水冲洗衣粉刷子刷自来水蒸馏水洗1次烘箱烘干（2）大口器皿：清洗前，要先浸泡2小时。玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其
41、附着力较强，冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。力较强，冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。生长调节物质的应用l生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起决定性作用。（一）生长素1吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2萘乙酸（NAA）：可人工大量生产，高温高压下稳定，动能比IAA高3.7倍。32,4-D：可促进愈伤组织形成。不同器官对生长素的反应
42、根：对生长素最敏感，低浓度下105103PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。（二）赤霉素（GA3）1GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2GA3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。3GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。GA3 蛋白酶 蛋白质 色氨酸生长素（三）细胞分裂素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用
43、。生长调节物质的使用溶剂1水中直接溶解困难。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等则可用0.11N的HCl溶解，再加水。2也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一般用mg/L表示。l使用量l1一般生长为0.0510mg/l。细胞分裂素0.0520mg/l。l2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。l生长素/细胞分裂素低促进芽形成l生长素/细胞分裂素高促进根形成要点1举例说明国际上常用的几种培养基？2培养基一般由哪些成分组成，各成分有何作用？3培养基的配制程序？4生长素、GA3、细胞分裂素在培养中主要有哪些作用
44、？第五节第五节 Tissue Culture ApplicationsMicropropagationlGermplasmpreservationlSomaclonalvariation&mutationselectionlEmbryoCulturelHaploid&DihaploidProductionlIndustrialProductsfromCellCultures一、MicropropagationlTheartandscienceofplantmultiplicationin vitrolUsuallyderivedfrommeristems(orvegetativebuds)wi
45、thoutacallusstageTendstoreduceoreliminatesomaclonalvariation,resultingintruecloneslCanbederivedfromotherexplantorcallus(buttheseareoftenproblematic)Steps of MicropropagationlStage0Selection&preparationofthemotherplantsterilizationoftheplanttissuetakesplacelStageI-Initiationofcultureexplantplacedinto
46、growthmedialStageII-Multiplicationexplanttransferredtoshootmedia;shootscanbeconstantlydividedlStageIII-RootingexplanttransferredtorootmedialStageIV-Transfertosoilexplantreturnedtosoil;hardenedoffFeatures of MicropropagationlClonalreproductionWayofmaintainingheterozygozitylMultiplicationstagecanberec
47、ycledmanytimestoproduceanunlimitednumberofclonesRoutinelyusedcommerciallyformanyornamentalspecies,somevegetativelypropagatedcropslEasytomanipulateproductioncyclesNotlimitedbyfieldseasons/environmentalinfluenceslDisease-freeplantscanbeproducedHasbeenusedtoeliminatevirusesfromdonorplants外 植 体 灭 菌外植体外植
48、体清洗整理清洗整理杀菌剂灭菌杀菌剂灭菌无菌水清洗无菌水清洗不同外植体不同外植体在灭菌剂浓度、在灭菌剂浓度、时间、程序上时间、程序上应有所区别应有所区别消 毒 剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易次氯酸钙/纳10530好易新洁尔灭1020530好易氯化汞0.11210最好最难过氧化氢1012515较好最易抗菌素450mgl-13060较好较难几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较二、Germplasm PreservationlExtensionofmicropropagationtechniqueslTwomethods:1.Slowgrowthtechniqueso
49、e.g.:Temp.,Light,mediasupplements(osmoticinhibitors,growthretardants),tissuedehydration,etcoMedium-termstorage(1to4years)2.CryopreservationoUltralowtemperaturesoStopscelldivision&metabolicprocessesoVerylong-term(indefinite?)oDetailstofollowonnexttwoslidesCryopreservation RequirementslPreculturingUsu
50、allyarapidgrowthratetocreatecellswithsmallvacuolesandlowwatercontentlCryoprotectionGlycerol,DMSO,PEG,etc,toprotectagainsticedamageandaltertheformoficecrystalslFreezingThemostcriticalphase;oneoftwomethods:lSlowfreezingallowsforcytoplasmicdehydrationlQuickfreezingresultsinfastintercellularfreezingwith
51、littledehydrationCryopreservation RequirementslStorageUsuallyinliquidnitrogen(-196oC)toavoidchangesinicecrystalsthatoccurabove-100oClThawingUsuallyrapidthawingtoavoiddamagefromicecrystalgrowthlRecovery(dontforgetyouhavetogetaplant)ThawedcellsmustbewashedofcryoprotectantsandnursedbacktonormalgrowthAv
52、oidcallusproductiontomaintaingeneticstability三、Somaclonal Variation in VitroSomaclonal Variation: variability in plantsregeneratedfromtissueculturethatiseitherinduced or uncovered by a tissue cultureprocess.Mostsomaclonalvariationisnegative,butifenoughplantsareexamined,positivechangescanusuallyberec
53、overed.SomaclonalVariation&BreedinglThesourceformostbreedingmaterialbeginswithmutations,whetherthemutationoccursina modern cultivar, a landrace, a plantaccession, a wild related species, or in anunrelatedorganismlTotalsourcesofvariation:Mutation,Hybridization,PolyploidylSomaclonalvariationisageneral
54、phenomenonofallplantregenerationsystemsthatinvolveacallusphaseSomaclonal VariationlTherearetwogeneraltypesofSomaclonalVariation:Heritable,geneticchanges(altertheDNA)Stable,butnon-heritablechanges(altergeneexpression,AKAepigenetic)lSinceutilizingsomaclonalvariationisaformofmutationbreeding,weneedtoco
55、nsidermutationbreedinginmoredetailInducing MutationslPhysicalMutagens(irradiation)Neutrons,AlpharayslDenselyionizing(“Cannonballs”),mostlychromosomeaberrationsGamma,Beta,X-rayslSparselyionizing(“Bullets”),chromosomeaberrations&pointmutationsUVradiationlNon-ionizing,causepointmutations(ifany),lowpene
56、tratinglChemicalMutagens(carcinogens)ManydifferentchemicalslMostarehighlytoxic,usuallyresultinpointmutationsInducing MutationslCallusGrowthinTissueCultureSomaclonalvariation(canbecombinedwithotheragents)lCanscreenlargenumberofindividualcellslChromosomalaberrations,pointmutationslAlso:Uncovergeneticv
57、ariationinsourceplantTraditional Mutation Breeding ProcedureslTreatseedwithmutagen(irradiationorchemical)lTarget:50%killlGrow-outM1plants(somecallthisM0)Evaluationfordominantmutationspossible,butmostarerecessive,solGrow-outM2plantsEvaluateforrecessivemutationsExpectsegregationlProgenytestselected,pu
58、tativemutantsProvemutationisstable,heritableSomaclonal Breeding ProcedureslUseplantculturesasstartingmaterialIdeaistotargetsinglecellsinmulti-cellularcultureUsuallysuspensionculture,butcallusculturecanwork(wantasmuchcontactwithselectiveagentaspossible)lOptional:applyphysicalorchemicalmutagenlApplyse
59、lectionpressuretocultureTarget:veryhighkillrate,youwantveryfewcellstosurvive,solongasselectioniseffectivelRegeneratewholeplantsfromsurvivingcellsSomaclonal/Mutation BreedinglAdvantagesScreenveryhighpopulations(cellbased)CanapplyselectiontosinglecellslDisadvantagesManymutationsarenon-heritableRequire
60、sdominantmutation(ordoublerecessivemutation);mostmutationsarerecessivelCanavoidthisconstraintbynotapplyingselectionpressureinculture,butyouloosetheadvantageofhighthrough-putscreeninghavetogrowoutallregeneratedplants,produceseed,andevaluatetheM2lAlternative:performonhaploidcelllinesTargets for Somacl
61、onal VariationlSeedlessness,maturationtime:citruslHerbicideResistanceandTolerancelSpecificaminoacidaccumulatorsScreenforspecificaminoacidproductione.g.LysineincerealslAbioticstresstoleranceAddorsubjectculturestoselectionagente.g.:salttolerance,temperaturestresses,etclDiseaseresistanceAddtoxinorcultu
62、refiltratetogrowthmediaExamplesshownonnextslideDisease Resistant Success using Disease Resistant Success using SomaclonalSomaclonal Variation VariationCropPathogenToxinAlfalfaColletotrichumsp.CulturefiltrateBananaFusariumsp.FusaricacidCoffeeColletotrichumsp.PartiallypurifiedculturefiltrateMaizeHelmi
63、nthosporiummaydisT-toxinOat*HelminthosporiumvictoriaeVictorinOilseedRape*PhomalingamCulturefiltratePeachXanthomonassp.CulturefiltratePotato*PhytophthorainfestansCulturefiltrateRice*XanthomonasoryzaeCulturefiltrateSugarcane*Helminthosporiumsp.CulturefiltrateSugarcane*HelminthosporiumsachariPartiallyp
64、urifiedHStoxinTobacco*PsedomonastabaciMethionine-sulfoximineTobacco*AlternariaalternataPartiallypurifiedtoxin*Showntobeheritablethroughsexualpropagation*ShowntobestablethroughvegetativepropagationRequirements for Somaclonal BreedinglEffectivescreeningprocedureMostmutationsaredeleteriousMostmutations
65、arerecessivelMustscreenM2orlatergenerationslConsiderusingheterozygousplants?ButsomesayyoushouldusehomozygousplantstobesureeffectismutationandnotnaturalvariationlHaploidplantsseemareasonablealternativeifpossibleVerylargepopulationsarerequiredtoidentifydesiredmutation:lCanyouaffordtoidentifymarginaltr
66、aitswithreplicates&statistics?Estimate:10,000plantsforsinglegenemutantlClearObjectiveCantexpecttojustplantthingsoutandseewhathappens;relatestohavinganeffectivescreenThismaybewhysomanyearlyexperimentsfailedSources of somaclones in citrus: organogenesis, somatic embryogenesis, protoplastsSWEETORANGEOR
67、GANOGENESISADVENTITIOUSSHOOTBUDINDUCTIONSWEETORANGEEMBRYOGENICCALLUSSWEETORANGEPROTOPLASTSORNAKEDCELLSCREC/UF, FloridaVariable Traits Observed in Hamlin and Valencia Somaclones *alteredtreesizeandarchitecture*maturitydate*seedcontent*juicecolor*juice%*solublesolids*acidcontent*fruitsize*peelability*
68、flavor Most Promising Valencia SomaclonesProcesssing:B10-81,B6-68-two-fourweeksearly(Feb.)-highsolidsandcolorSF14-62W-six-eightweeksearly(Jan.)-highsolidsandcolorC1-41-veryhighcolor-highsolidsT5-53,N7-1,etc.-verylatematurity(May,June)-highsolids Most Promising Valencia SomaclonesFresh Fruit:T2-21 -s
69、eedless -early maturity (Feb.)SF15-62W -seedless -large fruit size -normal maturityN12-11 -soft-rag and candy flavor -large fruit size -low seed contentN11-28 -seedless -large fruit size -late maturity (May)VALENCIA SOMACLONE WITH FRESH-MARKET POTENTIALVery Early Maturing Valencia Somaclone-recently
70、 selected -SF14-62W 2000(1/28)2001(2/04)2002(1/15)SF14-62W11.0brix12.811.814.7ratio15.813.838color3837.64.9lb.sol7.0n.d.Control-Val-10.1Val-11.7MidS-12.010.810.313.437.637.536.45.66.1n.d. Tissue Culture ApplicationsMicropropagationlGermplasmpreservationlSomaclonalvariation&mutationselectionEmbryoCul
71、turelHaploid&DihaploidProductionlIn vitrohybridizationProtoplastFusionlIndustrialProductsfromCellCultures四、Embryo CulturelRescueF1hybridfromawidecrosslOvercomeseeddormancy,usuallywithadditionofhormonetomedia(GA)lToovercomeimmaturityinseedTospeedgenerationsinabreedingprogramTorescueacrossorself(valua
72、blegenotype)fromdeadordyingplantEmbryo Culture as a Source of Genetic VariationlHybridizationCantransfermutantallelesbetweenspeciesCanintroducenewgeneticcombinationsthroughinterspecificcrosseslPolyploidyCancombineembryoculturewithchromosomedoublingtocreatenewpolyploidspecies(allopolyploidy)Embryo Cu
73、lturelEmbryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidnotoccur;lThesetechniqueshavebeenfurtherdevelopedfortheproductionofplantsfromembryosdevelopedbynon-sexualmethods(haploidproductiondiscussedlater)Embryo Rescue Processl
74、MakecrossbetweentwospecieslDissectembryo(usuallyimmature)Theyoungertheembryo,themoredifficulttoculturelGrowonculturemediumusingbasictissueculturetechniques,useforbreedingiffertilelManytimes,resultingplantswillbehaploidbecauseoflackofpairingbetweenthechromosomesofthedifferentspeciesThiscanbeovercomeb
75、ydoublingthechromosomes,creatingallotetraploidsPolyploidsareanothersourceofgeneticvariationCitrusseedcategoriesbycrossingCitrusembryoexcisionCitrusEmbryoDevelopmentalStagesTriploid hybrid Identification幼胚离体培养的生长发育方式幼胚离体培养的生长发育方式胚性发育胚性发育( (embryonalembryonal development) development)：幼胚仍按在活体内的方幼胚仍按在活
76、体内的方式发育，形成成熟胚式发育，形成成熟胚( (有时甚至可能类似种子有时甚至可能类似种子) )，然后按种子萌，然后按种子萌发途径出苗形成完整植株，该途径发育的幼胚一般发途径出苗形成完整植株，该途径发育的幼胚一般1 1个幼胚形个幼胚形成成1 1个植株。个植株。早熟萌发早熟萌发(early mature sprouting)(early mature sprouting)：离体胚不继续胚性生离体胚不继续胚性生长，而迅速萌发成幼苗，称为早熟萌发。多数情况下，一个幼长，而迅速萌发成幼苗，称为早熟萌发。多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时由于细胞分裂产生大量胚性细胞，胚萌发成一个植株，但有时由于
77、细胞分裂产生大量胚性细胞，形成多个胚状体，可形成许多植株，即丛生胚现象。形成多个胚状体，可形成许多植株，即丛生胚现象。愈伤组织愈伤组织(callus)(callus)：幼胚先发生细胞增殖形成愈伤组织。由幼胚先发生细胞增殖形成愈伤组织。由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，很容易分化形成植株。胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，很容易分化形成植株。Endosperm culture概况：概况：胚乳培养始于胚乳培养始于19331933年，进行玉米胚乳培养。胚乳培养年，进行玉米胚乳培养。胚乳培养研究主要集中探讨以下问题：研究主要集中探讨以下问题：1、胚乳细胞全能性：在离体培养条件下，胚乳细胞是否与胚
78、乳细胞全能性：在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。2 2、多数被子植物胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三、多数被子植物胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养，探索改良农倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养，探索改良农林、园艺植物三倍体育种技术的可能性。林、园艺植物三倍体育种技术的可能性。3、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。迄今已有迄今已有4040多种植物进行胚乳培养。苹果、柚、甜橙、檀香、多种植物进行胚乳培养。苹果、柚、甜橙、檀香、枸杞、猕
79、猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等胚乳培养再生了植株。核桃等胚乳培养再生了植株。Endosperm culturelVerydifficult;lFortriploidseedlessbreeding;lPlantletsregeneratedinCitruswereveryweak,andfinallydead.五、Haploid Plant ProductionlAnther/MicrosporecultureCulturingofAnthersorPollengrains(microspores)Deriveamatur
80、eplantfromasinglemicrosporelOvulecultureCulturingofunfertilizedovules(macrospores)Sometimes“trick”ovuleintothinkingithasbeenfertilizedAnther/Microspore Culture FactorslGenotypeAswithalltissueculturetechniqueslGrowthofmotherplantUsuallyrequiresoptimumgrowingconditionslCorrectstageofpollendevelopmentN
81、eedtobeabletoswitchpollendevelopmentfromgametogenesistoembryogenesislPretreatmentofanthersColdorheathavebothbeeneffectivelCulturemediaAdditives,Agarvs.FloatingFeatures of Anther/Microspore CultureOvule Culture for Haploid ProductionlEssentiallythesameasembryocultureDifferenceisanunfertilizedovuleins
82、teadofafertilizedembryolEffectiveforcropsthatdonotyethaveanefficientmicrosporeculturesysteme.g.:melon,onionlInthecaseofmelon,youhaveto“trick”thefruitintodevelopingbyusingirradiatedpollen,thenx-raytheimmatureseedtofinddevelopedovulesWhat do you do with the haploid?lWeak,sterileplantlUsuallywanttodoub
83、lethechromosomes,creatingadihaploidplantwithnormalgrowth&fertilitylChromosomescanbedoubledbyColchicinetreatmentSpontaneousdoublinglTendstooccurinallhaploidsatvaryinglevelslManysystemsrelyonit,usingvisualobservationtodetectspontaneousdihaploidslCanbeconfirmedusingflowcytometryUses of Haploids in Bree
84、dinglCreationofallopolyploidsProductionofhomozygousdiploids(dihaploids)lDetectionandselectionfor(oragainst)recessiveallelesl迅速获得纯合型材料，缩短育种年限；迅速获得纯合型材料，缩短育种年限；l获得育种中间材料；获得育种中间材料；l与诱变育种相结合可以提高诱变频率；与诱变育种相结合可以提高诱变频率；l与细胞融合结合，使该育种途径更具有实际意义与细胞融合结合，使该育种途径更具有实际意义（x x + 2x+ 2x创造创造3X3X柑橘、土豆已成功）；柑橘、土豆已成功）；l作为遗
85、传工程受体更为有效；作为遗传工程受体更为有效；l基础遗传研究的各个领域（基础遗传研究的各个领域（基因组测序基因组测序等）等）。桃单倍体果实桃单倍体果实柚柚单倍体开花结果单倍体开花结果 花药培养基本程序：花药培养基本程序： 外植体选择外植体外植体选择外植体( (花蕾花蕾) )低温预处理低温预处理外植体外植体消毒消毒剥取花药剥取花药接种接种诱导培养诱导培养分化培养分化培养低温处理的作用：低温处理的作用：激发花粉母细胞产生两个相等核，而激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是不是1 1个营养核和个营养核和1 1个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰
86、老；激发花粉产生原胚；促使细胞同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。同步分裂。l花粉发育时期花粉发育时期四分体四分体 小孢子小孢子 单核花粉单核花粉 双核花粉双核花粉 最适期最适期花粉洗涤花芽单倍体胚形成花药增殖胚发育愈伤组织分化固体培养液体培养花药平板接种花药花药提取花粉秋水仙素加倍纯合2X植株花粉发育胚花药培养花粉培养花花药药和和花花粉粉培培养养六、Industrial ApplicationslSecondarymetabolitesproducedbyplantsAlkaloids,Terpenoids,Steroids,Anthocyanins,Anthraq
87、uinones,PolyphenolslOftenunclearfunctionintheplantlOftenrestrictedproduction(specificspecies,tissueororgan)lManyarecommerciallyvaluablelCellculturetechniquesallowlarge-scaleproductionofspecificsecondarymetabolites本章思考题l概念：组织培养、体细胞无性系变异、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体保存等l简答题：l简述组织培养的基本设施；l简述培养基配制的基本流程、应注意哪些方面？l简述组织培养技术主要有哪些应用？
