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1、 1 2024/7/26层析原理与方法析原理与方法 2 2024/7/26内容提要内容提要1、层析原理与技析原理与技术2、层析方法析方法凝胶凝胶过滤层析析离子交离子交换层析析羟基磷灰石基磷灰石层析析疏水疏水层析析亲和和层析析 3 2024/7/26 层析的起源和原理析的起源和原理起源-1906年，俄国植物学家Tsweet原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的层析原理析原理Chromatography层析析色色谱 4 2024/7/26什么是蛋白什么是蛋白层析析 根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离 极性/疏水性：polarity (solubility, volatility) HIC,
2、 RP 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 结构特征与活性位点：shape (ligand binding, affinity) AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离层析原理析原理 5 2024/7/26分离机制分子的大小分子的大小-凝胶凝胶过滤(size-exclusion)（分子（分子筛，分子，分子 排阻）排阻）分子的分子的电性性-离子交离子交换（IEC）阳离子交）阳离子交换、阴离子交、阴离子交换分子的表面疏水分子
3、的表面疏水结构构-疏水疏水层析（析（HIC），反相），反相 其它：其它：羟基磷灰石，金属螯合基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介和，染料配基介质层析析精制（精制（polishing）：高分辨率）：高分辨率层析析 分离机制分离机制 6 2024/7/26层析的基本概念流流流流动动相相相相固定相固定相固定相固定相C C流出流出流出流出组组份份份份1 12 23 31 12 23 3洗脱峰洗脱峰洗脱峰洗脱峰层析原理析原理 7 2024/7/26层析的基本概念固定相：固定相是层析的一个基质 ，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起
4、着关键的作用。 层析原理析原理流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）A good gel for gel filtration contains about 95% water 8 2024/7/26层析方法析方法凝胶凝胶过滤层析析离子交离子交换层析析羟基磷灰石基磷灰石层析析疏水疏水层析析亲和和层析析 9 2024/7/26GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换Hydrophobic Interaction疏水层析Affinity亲和层析 CHT羟基磷灰石层析原理析原理 10 2024/7/26凝胶凝胶过滤
5、层析析/分子分子筛 11 2024/7/26 分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。 具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。凝胶凝胶过滤 12 2024/7/261. Spherical particles packed into a column2. Sample applied3. Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of matrix4. large mole
6、cules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight through.DiffusionBufferDiffusion into the poresDiffusion out of the poresBuffer凝胶凝胶过滤 13 2024/7/26凝胶凝胶过滤层析析分离分离纯化原理化原理 14 2024/7/26Steric exclusion leads to early elution
7、按照分子量大小洗脱按照分子量大小洗脱大分子首先洗脱，最小的分子在最后面大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱洗脱 15 2024/7/26 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6Bio-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P1001,8008004,0001,0006,000，用于脱用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶凝胶过滤层析析凝胶的凝胶的选择 16 2024/7/26柱柱长的的选择 分离：30120cm 脱盐
8、：30cm以下 洗脱液洗脱液 离子强度低高离子作用 排阻作用（0.1-0.5M) 疏水作用 pH中性中性流速，流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量品容量：13CV凝胶凝胶过滤层析析操作参数操作参数选择 17 2024/7/261.可分离相可分离相对分子量从几百到几十万的物分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱脱盐凝胶凝胶过滤层析析凝胶凝胶过滤层析的析的应用用 18 2024/7/26凝胶凝胶过滤层析析凝胶凝胶过滤层析的特点：
9、析的特点：1.层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高；2.上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；3.工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；4.分辨率低；5.不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐 19 2024/7/26离子交离子交换层析析 20 2024/7/26 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
10、离子交离子交换层析析 21 2024/7/26cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交离子交换层析析离子交离子交换层析析类型及其型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3- 22 2024/7/26pIstability rangestability range与阳离子交与阳离子交换介介质结合合+-denaturationdenaturationpH102离子交离子交换层析析离
11、子交离子交换层析原理析原理蛋白蛋白质滴定曲滴定曲线蛋蛋白白质净电荷荷与阴离子交与阴离子交换介介质结合合 23 2024/7/26Products:UNOsphere Q & S, Macro-Prep High Q & S, CM, DEAE, AG resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration-+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
12、+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +-+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +-+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +离子交离子交换层析析离子交离子交换层析原理析原理 24 2024/7/26sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-
13、anionexchangerbead离子交离子交换过程程 25 2024/7/26离子离子强度度 洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等. 在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与冲液与pH 选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M) 缓冲液PH值： 阳离子低于pI一个pH单位以上 阴离子通常高于pI一个pH单位以上 蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交离子交换层析析离子交离子交换层析操作参数析操
14、作参数选择 26 2024/7/26pI5.5+-pH102离子交离子交换层析析缓冲液与冲液与pHpI7.5阳离子交阳离子交换阴离子交阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋蛋白白质净电荷荷pH4.0pH9.0蛋白蛋白质稳定性范定性范围 27 2024/7/26pH 7.0pH 8.0pH 8.9pH 6.0pH6.0pH7.0pH 8.0pH 8.9缓冲液与冲液与pH的影响的影响阴离子交阴离子交换离子交离子交换层析析离子交离子交换层析操作参数析操作参数选择 28 2024/7/26离子交离子交换层析析离子交离子交换层析操作参数析操作参数选择盐溶液梯度的影响溶液梯度的影响
15、29 2024/7/26疏水疏水层析析 30 2024/7/26基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术疏水作用来自于分子的水化疏水作用来自于分子的水化结构，高构，高浓度度盐溶液破坏生物分子的水化溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋构，使蛋白白质内部的疏水基内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合合不同离子的疏水性不同离子的疏水性Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN-Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+蛋白蛋白质以高以高浓度度盐溶液溶液结合与疏水合与
16、疏水层析柱上，以低析柱上，以低浓度度盐溶液洗脱溶液洗脱原理原理疏水疏水层析析 31 2024/7/26疏水疏水层析析生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合 ，可用疏水层析试盒选择介质 32 2024/7/26作用原理作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG = DH - T DS 33 2024/7/26操作参数操作参数选择疏水疏水层析析疏水介疏水
17、介质选择：甲基，丁基，苯基疏水：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性疏水性强的蛋白的蛋白质：甲基，丁基：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基：丁基，苯基盐：硫酸：硫酸铵，醋酸，醋酸铵等等等等缓冲体系和冲体系和pH洗脱梯度洗脱梯度 34 2024/7/26Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filteredLoad:5 mlBuffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7B: 0.1 M NaP, pH 7Flow Rate: 3 ml/min (230 cm/hr)Macro-Prep 甲基疏水甲基疏水苯基
18、疏水苯基疏水20% EtOH疏水疏水层析析 35 2024/7/26亲和和层析析 36 2024/7/26亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。亲和和层析析 37 2024/7/261.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionEquilibrate the column and the sample to binding conditions.MatrixSpecific liga
19、nd亲和和层析析 38 2024/7/26亲和和层析析1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget bindsOthers wash outApply sample under binding conditions. 39 2024/7/26亲和和层析析1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget elutesChange the eluen
20、t to elute the target. 40 2024/7/26Profinity IMAC纯化His-tagged ProteinChelex 100纯化DNA，PCR样品制备Affi-Gel Protein A纯化单克隆抗体Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) 纯化单抗，分离HSAAffi-Gel 肝素凝胶肝素凝胶多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-Gel Polymixin去除内毒素（热原）Affi-Gel 硼胶硼胶分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子亲和和层析析产品与品与应用用 41 2024/7/26Profinity IMAC
21、Resins固定化金属螯合层析：Immobilized Metal Affinity Chromatography （IMAC） 基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His-tagged Protein 螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+, 现有的产品为螯合Ni2+的介质 UNOsphere 技技术 更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。IDA 42 2024/7/26不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较Profinity IMAC, IDA ligandProfinity IMAC Resins 43 2024/7/
22、26Profinity IMAC Resins 纯化 6His-tagged proteinSample：E.coli. lysate96% 纯度Profinity IMAC Resins 44 2024/7/26羟基磷灰石基磷灰石层析析 45 2024/7/26Ca10(PO4)6(OH)25 个带正电荷的Ca离子对（C位点）2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2 个羟基于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷陶瓷羟基磷灰石晶体基磷灰石晶体结构构陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术 46 2024/7/26蛋白蛋白质带正正电氨基氨基经
23、典的阳离子交典的阳离子交换用中性用中性盐溶液溶液 (NaCl) 或或缓冲冲盐溶溶液液 (PO4)洗脱洗脱初初级保留机制保留机制陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术 47 2024/7/26带负电羧基基经典的金属螯合作用，并受离子排阻典的金属螯合作用，并受离子排阻调节比离子比离子间静静电相互作用相互作用强1560倍倍在无在无PO4 条件下不能被任何条件下不能被任何浓度度NaCl洗脱洗脱用用PO4洗脱洗脱初初级保留机制保留机制陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术 48 2024/7/26优点点独特的分离机制高再生能力 高分辨率容易规模放大容易进行方法开发高机械稳
24、定性高化学稳定性层析柱寿命长颗粒大小：粒大小：20um、40um和和80um陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术 49 2024/7/26Type I由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.Type II由于具有大孔结构，II 型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何如何选择类型型陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术 50 2024/7/26分离分离纯化原理与操作参数化原理与操作参数选择羟
25、基磷灰石（基磷灰石（CHT）影响蛋白影响蛋白质色色谱行行为的操作参数：的操作参数： CHT类型型 NaCl浓度度 PB缓冲液冲液浓度梯度度梯度 双梯度洗脱双梯度洗脱 PB缓冲液梯度含不同冲液梯度含不同NaCl浓度度 缓冲液冲液pH值双梯度洗脱模型双梯度洗脱模型先以先以0-500mM NaCl，再以再以0-500mM 磷酸磷酸钾 51 2024/7/26双梯度洗脱双梯度洗脱羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）0-0.5MNaCl0-0.4MNaPO4玉米种子中玉米种子中纯化化转基因抗体基因抗体IgG 52 2024/7/26单克隆抗体，多克隆抗体克隆抗体，多克隆抗体纯化化重重组疫苗疫苗抗体片段抗体片段重重组蛋白蛋白质酶核酸核酸:DNA/RNA (单双双链)膜蛋白膜蛋白质羟基磷灰石基磷灰石应用用陶瓷陶瓷羟基磷灰石（基磷灰石（CHT）分离技）分离技术
