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1、质粒的快速抽提复旦大学上海医学院复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系实验背景简介:什么是质粒?扩增扩增质粒质粒DNADNA细菌染色体细菌染色体 DNA DNA质粒质粒目的基因目的基因目的基因目的基因实验原理1 1 碱裂解细菌碱裂解细菌 NaOH NaOH 染色体染色体DNADNA变性变性 SDS SDS 蛋白质变性蛋白质变性2 2 低温下用低温下用KCLKCL沉淀变性的蛋白质和沉淀变性的蛋白质和 染色体染色体DNADNA3 3 离心后从上清中分离出质粒离心后从上清中分离出质粒DNADNA实验原理裂解裂解沉淀沉淀离心离心实验步骤1 1 细菌扩增细菌扩增 在原始平板上挑取
2、待筛选菌落在原始平板上挑取待筛选菌落, ,接种到含接种到含AMPAMP的的LBLB液体培养基中液体培养基中, ,置于置于3737度恒温摇床以度恒温摇床以200bpm200bpm的速的速度振荡培养过夜度振荡培养过夜. .2 2 收集细菌收集细菌 每个每个EppendorfEppendorf管收集管收集1ml1ml菌液菌液,12000g,12000g离心后去离心后去除上清除上清. . 以上步骤由教师完成以上步骤由教师完成, ,学生从第三步开始做学生从第三步开始做. .3 3 重悬重悬 每一每一EppendorfEppendorf管中加入管中加入50ul50ul试剂试剂1 (10 mM EDTA p
3、H 1 (10 mM EDTA pH 8.0),8.0),在涡流震荡器上震荡在涡流震荡器上震荡3030秒重悬细菌秒重悬细菌. .4 4 裂解细菌裂解细菌 每一每一EppendorfEppendorf管加入管加入50ul50ul新鲜配制的试剂新鲜配制的试剂2(0.2M 2(0.2M NaOH,0.5% SDS,20% NaOH,0.5% SDS,20% 蔗糖蔗糖),),震荡震荡3030秒秒.70.70度水浴度水浴5 5分钟分钟. .5 5 沉淀细菌沉淀细菌DNADNA及蛋白及蛋白, ,分离出质粒分离出质粒DNADNA 每管加入每管加入1.5ul1.5ul试剂试剂3(4M KCL)3(4M KCL
4、)和和0.5ul0.5ul试剂试剂4(0.4%4(0.4%溴酚蓝溴酚蓝溶液溶液),),震荡震荡3030秒秒, ,冰浴冰浴5 5分钟分钟.4.4度度12000g12000g离心离心3 3分钟分钟. .6 6 制备制备0.7%0.7%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶( (含含0.5ug/ml EB)0.5ug/ml EB)7 7 电泳电泳 取上清取上清50ul50ul上样于样品槽上样于样品槽, ,电泳电泳( (电压电压5-10V/cm5-10V/cm胶胶),),待染待染料迁移至全胶长度料迁移至全胶长度2/3-3/42/3-3/4时时, ,停止电泳停止电泳, ,紫外检测电泳紫外检测电泳结果结果. .DNADNA
5、的琼脂糖凝胶电泳1 1 琼脂糖是琼脂糖是D-D-和和L-L-半乳糖残基通过半乳糖残基通过 (1-3) (1-3)和和 (1-4) (1-4)糖糖苷键交替构成的螺旋纤维苷键交替构成的螺旋纤维2 2 决定决定DNADNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素: : DNADNA分子的大小和分子的大小和DNADNA构象构象 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭(EB)(EB) 电压电压 琼脂糖种类琼脂糖种类 电泳缓冲液电泳缓冲液 等等 DNADNA分子大小及构象对电泳迁移率的影响1 1 双链双链DNADNA分子在凝胶迁移的分子在凝胶迁移
6、的速率与其碱基对数的常用速率与其碱基对数的常用对数成反比对数成反比: :分子越大分子越大, ,迁迁移越慢移越慢2 2 超螺旋环状（超螺旋环状（SCSC）、切口）、切口环状（环状（OCOC）和线状）和线状（L L）DNADNA在琼脂糖凝胶中在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。以不同速率迁移。配制琼脂糖凝胶的注意事项配制琼脂糖凝胶的注意事项1 1 微波炉加热到熔化微波炉加热到熔化2 2 放置冷却至放置冷却至6060后后 加入加入 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）3 3 待胶凝固完全后上样电泳待胶凝固完全后上样电泳4 4 注意电泳的正负极接口注意电泳的正负极接口 （红色（红色- -正级正级 黑色黑色- -负极）负极） 电泳方向为负电泳方向为负 正正致癌物：致癌物：注意戴手注意戴手套防护套防护实验结果分析思考题1.1.为什么不同构象的为什么不同构象的DNADNA分子在琼脂糖凝胶分子在琼脂糖凝胶电泳中具有不同的迁移率电泳中具有不同的迁移率? ?2.2.在凝胶中添加溴化乙锭的作用原理是什么在凝胶中添加溴化乙锭的作用原理是什么? ?溴化乙锭有哪些毒副作用溴化乙锭有哪些毒副作用? ?应如何避免应如何避免? ?Thank you!Thank you!
