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1、动物基因组动物基因组DNA、总、总RNA的提取及含量测定的提取及含量测定2009-10-15动物基因组DNA总RNA测定课件目的要求目的要求l学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；技术；l了解提取了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；的几种方法，原理和优缺点；l学习测定学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。含量的基本原理及具体方法。动物基因组DNA总RNA测定课件理论基础理论基础l核酸核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；蛋白质是构成生物体
2、的主要成分；l按化学组成可以将核酸分成两大类：按化学组成可以将核酸分成两大类： 含脱氧核糖核酸（含脱氧核糖核酸（DNA），），主要主要存在于细胞核中；存在于细胞核中； 含核糖核酸（含核糖核酸（RNA），），主要主要存在于细胞质内；存在于细胞质内；在生物体中核酸以结合成在生物体中核酸以结合成核蛋白核蛋白的形式存在，但核的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。都很易降解。动物基因组DNA总RNA测定课件核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则l保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性意义：意义：遗传信息
3、全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。l排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染；l无杂核酸分子的污染（如纯化无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应分子时应去除去除RNA分子）。分子）。动物基因组DNA总RNA测定课件注意：注意：l在低温下进行操作；在低温下进行操作；l减少物理因素对核酸的减少物理因素对核酸的机械剪切力机械剪切力；l防止过酸、过碱引起核酸降解，控制防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（
4、值范围（pH值值5-9），），并要保持一定离子强度；并要保持一定离子强度；l防止核酸的生物降解；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温高温灭菌灭菌，提取缓冲液中需加，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂核酸酶抑制剂。进行核酸分离时最好进行核酸分离时最好新鲜新鲜生物组织或细胞样品，若不能生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。冰箱中。动物基因组DNA总RNA
5、测定课件1、RNA的提取与测定的提取与测定lRNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。l常见方法（依据常见方法（依据RNA的种类和来源）：的种类和来源）： 苯酚法（实验室最常用的方法）苯酚法（实验室最常用的方法）去污剂法、去污剂法、盐酸胍法，盐酸胍法，l苯酚法：苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即即溶于上层溶于上层被苯酚饱被苯酚饱和的水相中，和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，后，RNA即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。
6、优点：优点：较好除去较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的和蛋白质，且获得生物活性的RNA。动物基因组DNA总RNA测定课件工业提取工业提取RNA的方法的方法l酵母细胞富含酵母细胞富含RNA，是工业上提取，是工业上提取RNA的主要原料。的主要原料。l工业上制备工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的多选用低成本、适于大规模操作的浓盐浓盐法或稀碱法法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。动物基因组DNA总RNA测定课件l浓浓盐盐法法：使使用用 10氯氯化化钠
7、钠的的溶溶液液，同同时时在在 90摄摄氏氏度度热热提提取取3-4小小时时，以以改改变变细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。经经冷冷却却，离离心心后后上上清清液液由由乙乙醇醇沉沉淀淀 RNA。l稀碱法：使用稀碱法：使用0.2氢氧化钠裂解氢氧化钠裂解酵母酵母，然后用酸中和，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀除去蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀RNA，或调等电点，或调等电点PI2.5沉淀。沉淀。工业提取工业提取RNA的方法的方法动物基因组DNA总RNA测定课件l原理：原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水可
8、溶于水或浓盐溶液（如或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠氯化钠盐溶盐溶液中溶解度液中溶解度最低最低，而核酸核蛋白，而核酸核蛋白（RNP）则在则在0.14mol/L氯化氯化钠中溶解度钠中溶解度最大最大，利用这一性质可将其分开。，利用这一性质可将其分开。l方法：方法：先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L氯化钠溶液把细胞中的氯化钠溶液把细胞中的RNP提取出来，最后用酚提取出来，最后用酚将将RNA和蛋白质分开和蛋白质分开。本实验提取本实验提取RNA的原理及方法的原理及方法动物基因组DNA总RNA
9、测定课件RNA提取提取l匀浆：匀浆：称取称取3克牛肝剪碎，加克牛肝剪碎，加20mL0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液10000r/min左右左右匀浆匀浆1分钟左右；分钟左右；l离心：离心：匀浆后溶液离心匀浆后溶液离心8000r/min离心离心7分钟，量取上清液分钟，量取上清液毫升数毫升数，沉淀物，沉淀物留做提取留做提取DNA；l除杂质：除杂质：于上清液中加入等体积于上清液中加入等体积80苯酚苯酚溶液，搅拌充分混合溶液，搅拌充分混合10-15分钟，分钟，置冰箱置冰箱冷却冷却静止静止10-15分钟，离心取含有分钟，离心取含有RNA上层水相，弃下层酚相；上层水相，弃下层酚相；l沉淀沉淀RNA：取
10、上层水相含取上层水相含RNA溶液，加入溶液，加入2倍体积倍体积95冷乙醇，搅拌，充分冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却混合，置冰箱中冷却(约约10-15分钟分钟)，至出现白色絮状物，至出现白色絮状物RNA，离心，离心8000r/min离心离心7分钟，取沉淀物；分钟，取沉淀物；l溶解：溶解：用少量去离子水（约用少量去离子水（约20毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。动物基因组DNA总RNA测定课件RNA含量测定方法含量测定方法l测定测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚地衣酚；l本实验用地衣酚测定本实验用地衣酚测定原理：
11、原理：当当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成成糠醛糠醛，后者与，后者与3.5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或或Cu2+催催化下，生成鲜绿色复合物，反应在化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，处有最大吸收峰，RNA浓浓度在度在10100g/mL范围内，光吸收与范围内，光吸收与RNA浓度成正比。浓度成正比。动物基因组DNA总RNA测定课件将样品配制成含将样品配制成含5 50g/mL核酸的溶液，于紫外分光光度计核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定上测定260nm吸收值，计算核酸浓度：
12、吸收值，计算核酸浓度：RNA浓度（浓度（g/mL）=式中：式中：O.D260为为260nm波长处吸收值；波长处吸收值；L为比色杯的厚度；为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含为每毫升溶液内含1微克微克RNA的光吸收值；的光吸收值；稀释倍数稀释倍数紫外吸收法紫外吸收法动物基因组DNA总RNA测定课件在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物还原产物钼蓝。钼蓝。H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+
13、12H2O还原剂还原剂钼钼蓝蓝钼蓝最大的光吸收在钼蓝最大的光吸收在650-660nm波长处。当使用抗坏血酸波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克磷。微克磷。定磷法定磷法动物基因组DNA总RNA测定课件RNA含量测定含量测定取取8支试管，支试管，6支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另2管各加入管各加入0.1mL、0.2mL、0.3mL待测液，再加待测液，再加2.9mL、2.8mL和和2.7mL水和水和3.0mL地衣酚试剂试剂，加毕，摇匀，地衣酚试剂试剂，加毕，摇匀，8支试管统一沸支试管统一沸水加热
14、水加热25min，取出后冷水冷却，测定各管，取出后冷水冷却，测定各管OD670为纵坐标，为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，并计算提出的浓度为横坐标作图，并计算提出的RNA的量。的量。(控制控制RNA浓度在浓度在10 100g/mL之内）之内）管号管号试剂试剂(mL) 123456RNA标标准液准液(100gmL-1)00.61.21.82.43.0蒸馏水蒸馏水3.02.41.81.20.60地衣酚试剂地衣酚试剂3.03.03.03.03.03.0动物基因组DNA总RNA测定课件试剂和器材试剂和器材l材料：牛肝材料：牛肝l试剂：试剂：0.14mol/L氯化钠氯化钠标准标准RNA溶液：溶液：100
15、g/mL地衣酚（地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂二羟基甲苯）试剂（现用现配）（现用现配）80苯酚溶液苯酚溶液95乙醇乙醇l器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等动物基因组DNA总RNA测定课件思考题思考题vRNA提取方法有几种？有什么优缺点？提取方法有几种？有什么优缺点？vRNA提取过程中应注意什么？提取过程中应注意什么？动物基因组DNA总RNA测定课件DNA的提取及含量测定的提取及含量测定在在动动植植物物中中，小小牛牛胸胸腺腺、动动物物肝肝脏脏、鱼鱼类类精精子子，植植物物种种子子的的胚中都含有丰富的胚中都含有丰富的DNA；微微生生
16、物物中中，面面包包酵酵母母含含4%，啤啤酒酒酵酵母母含含6%，大大肠肠肝肝菌菌含含9%10%。本本实实验验：将将沉沉淀淀物物溶溶解解于于生生理理盐盐水水，加加入入去去污污剂剂十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（SDS）溶溶液液，使使DNA与与蛋蛋白白质质分分离离开开。加加入入固固体体氯氯化化钠钠使使其其浓浓度度达达到到1mol/L，使使DNA溶溶解解。加加氯氯仿仿-异异戊戊醇醇去去除除蛋蛋白白质质，也也可可重重复复该该步步操操作作得得较较纯纯DNA。最最后后用用95%乙乙醇醇沉沉淀淀DNA。动物基因组DNA总RNA测定课件去除蛋白的常用方法去除蛋白的常用方法l变性剂法：变性剂法：用用SDS等去污剂使
17、蛋白质变性，可以直接从等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取生物材料中提取DNA；l苯酚法：苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的缓和，可以得到较好的DNA制品；制品；l氯仿法：氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。沉淀出来。动物基因组DNA总RNA测定课件D
18、NA的提取的提取l溶解：溶解：将离心后除去将离心后除去RNA的沉淀，用的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加浆一次。加4毫升毫升10SDS溶液溶液，使溶液的，使溶液的SDS浓度达到浓度达到1左右，边加边左右，边加边搅拌，放置搅拌，放置60水浴保温水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌，充分搅拌10分钟；分钟；l除杂质：除杂质：加等体积加等体积氯仿氯仿-异戊醇异戊醇混合液，充分震荡混合液，充分震荡10分钟分钟，8000r/min离离心心7分
19、钟，取分钟，取上层上层液量好体积，倒入烧杯中（液量好体积，倒入烧杯中（离心管离心管），加同体积的氯仿），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，异戊醇混合液，重复上次操作重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；。直至界面不出现蛋白凝胶为止；l沉淀：沉淀：准确量取上清液体积，加准确量取上清液体积，加2倍体积倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却冷却，待有白色丝状物出现，约，待有白色丝状物出现，约10-15分钟分钟，离心，离心8000r/min离心离心7分钟，分钟，得白色沉淀；得白色沉淀；l溶解：溶解：将沉淀物用将沉淀物用0.1mol/LNaOH约约10毫升溶解。毫升溶解。动物
20、基因组DNA总RNA测定课件DNA含量测定方法含量测定方法l二苯胺法：二苯胺法：DNA分子中的分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成脱氧核糖在酸性环境中变成-羟基羟基-酮基戊酮基戊醛醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（max=595nm）。）。DNA在在40400微克范围内，光吸收值与微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。在反应液中的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。除除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应，其它多数糖类，外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样
21、反应，其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。而蛋白质、多种糖及其芳香衍生物，包括核糖在内，一般无此反应。而蛋白质、多种糖及其芳香衍生物，羟基醛都能与二苯胺形成有色物质，干扰测定。羟基醛都能与二苯胺形成有色物质，干扰测定。动物基因组DNA总RNA测定课件DNA含量测定含量测定l1、DNA标准曲线的制定标准曲线的制定6支试管，依次加入支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和和2.0mLDNA标准标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各加入。然后各加入4mL二苯胺试剂，二苯胺试剂，混匀。于混匀。于60恒温水浴中保温恒温水浴中保温1h，冷却后于
22、，冷却后于595nm处进行比色测定。处进行比色测定。以以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。l2、制品的测定、制品的测定取取2支试管，各加支试管，各加0.2，0.8mL待测液，加水至待测液，加水至2mL（内含（内含DNA应在应在标准曲线的可范围之内）和标准曲线的可范围之内）和4mL二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。曲线的制作。l3、根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量的含量.动物基因组DNA总RNA测定课件管
23、号管号试剂试剂(mL) 012345678DNA标标准液准液(200gml-1)00.40.81.01.21.62.000蒸蒸馏馏水水2.01.61.21.00.80.401.81.2二苯胺二苯胺试剂试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待待测测液液00000000.20.8摇摇匀，匀，60水浴保温水浴保温1h，在，在595nm处测处测吸光度（吸光度（OD值值或或A值值）OD595DNA含量含量(g)080160200240320400动物基因组DNA总RNA测定课件试剂和器材试剂和器材l试剂：试剂：生理盐水生理盐水10SDS氯化钠氯化钠95乙醇乙醇氯仿氯仿-异戊醇混
24、合液异戊醇混合液DNA标准溶液：用标准溶液：用0.01mol/LNaOH配成配成200g/mL溶液溶液二苯胺试剂（现用现配）二苯胺试剂（现用现配）l器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等动物基因组DNA总RNA测定课件思考题思考题l二苯胺法测定二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是，为什么加乙醛，作用是什么？什么？l除杂质常用那些方法？除杂质常用那些方法？动物基因组DNA总RNA测定课件工工艺艺图图3g肝脏肝脏+20mL0.14mol/L氯化钠氯化钠匀浆匀浆,1min离心离心8000r/min,7min等体积等体积80苯酚苯酚搅拌搅拌10-20min，冰箱静置，冰箱静置30min8000rn/min，7min上清上清RNA、多糖、多糖沉淀沉淀DNA、蛋白、蛋白加加2 2倍体积倍体积9595冷乙醇冷乙醇冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀离心离心沉沉淀淀离心离心冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀加加2倍体积倍体积95冷乙醇冷乙醇等体积氯仿等体积氯仿/异戊醇，震荡异戊醇，震荡10min/离心离心加氯化钠至加氯化钠至1mol/L，搅拌，搅拌10min4ml10SDS，60，10min30ml生理盐水溶解生理盐水溶解上上清清DNARNA动物基因组DNA总RNA测定课件
