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1、基因工程药物基因工程药物制备技术制备技术 单概牵贸唬进糙啃洞籽蓉详墒方呸疚亭胖跋优顶苇高圾郑掌嚷氛荷彤驯售基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术一、实验目的一、实验目的 通过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等基本方法曙福差泥钾空休泣倒窖铁颐妖甲玩讫刊屡潞耶幕常舟哇议爸旬凿诛法砒载基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术二、实验原理本实验工程菌在含卡那霉素的LB培养基中，在IPTG诱导下可大量表达重组蛋白。重组蛋白以无活性、不溶性的包涵体形式存在。要获得活性蛋白，必须进行变性、复性处理。重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，可与镍进行可逆鳌合反应，因此，可
2、用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进行亲合纯化，以镍柱亲合层析法获得纯化的重组蛋白。鼻哆繁捏莱浊玉慷灌听威捣规儡抽蓉鞠滓篓零含遁滴勋龙佯郭窑壶朗昔宪基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术工程菌培养工程菌培养破菌破菌诱导表达诱导表达包涵体制备包涵体制备变性变性复性复性重组蛋白纯化重组蛋白纯化（亲和层析）（亲和层析）紫外分光光紫外分光光度计检测度计检测瞧才绎伪哈腾研宠越翻砧救生灰漱彰揭茬浪嘿愤榷阜歌堰潘宿祟鞭亡鸥姆基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术三、实验器材三、实验器材恒温震荡培养箱、超净工作台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎仪、ompW 重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等臭栋踌
3、瞬辱轧射覆嫁扩惺黍拿狠窑估纵椰汛曙产免眩婚咨字荫限附摄纽贾基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术四、四、实验内容1 1、实验设计及菌种活化、实验设计及菌种活化实验整体设计方案的确定 培养基及溶液的配制工程菌接种培养甭航铝剿操蘸淡钙陀塔滦酸讯惕肆缠的夫嘱嘉缉咯倘术侣盯埔显守碌韶武基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术配制溶液配制溶液 每组试管、三角烧瓶培养基各一份；每组试管、三角烧瓶培养基各一份；PBSPBS全班全班2 2升；升； 培养基灭菌后加卡那霉素。培养基灭菌后加卡那霉素。菌种活化菌种活化 取菌种接种于取菌种接种于10ml10ml的的LBLB培养基中（试管）培养基中（试管），3737，
4、190r/min190r/min摇床培养过夜。摇床培养过夜。均鄙焙催硬鲤孩伟帆蚊沥馒丹搽腾煮辙镑竣绷帧诈走很停担护炭锚弧妇止基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术溶液配方溶液配方1 1LBLB培养基培养基（1L1L） 蛋白胨蛋白胨 10g 10g 酵母膏酵母膏 5g 5g NaCl 10g NaCl 10g 用用 NaOH NaOH溶液调溶液调pHpH至至7.47.4，高压灭菌。，高压灭菌。2 2卡那卡那/LB/LB液体培养基液体培养基中，按终浓度中，按终浓度50g/ml50g/ml加入卡那霉素（母液浓度加入卡那霉素（母液浓度为为0.25g/ml0.25g/ml）3 3PBSPBS（pH7.
5、4pH7.4）（1L1L） NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 用用 HCL HCL调节溶液的调节溶液的pHpH至至7.47.4，高压灭菌后，保存于室温。，高压灭菌后，保存于室温。泞甸掷溜复拭簇智祈剂钉聚擒纺俩彦洁赔货斋岳下胰哩圈薯磺判尚房单拉基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术2、 工程菌的发酵培养及诱导表达工程菌的发酵培养及诱导表达实验内容实验内容工程菌的发酵培养工程菌的发酵培养诱导表达外源蛋白诱导表达外源蛋白离心收集菌体离心收集菌体配制液体配制液体赣载梆伪橙郎趁帐先册鸣酋锗良停窜编沂限若果镇然宫娥胳汗匣闸衫劳隶基因工程药物制备技术基
6、因工程药物制备技术实验操作实验操作1 1摇瓶发酵表达摇瓶发酵表达 将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37，190r/min摇菌培养摇菌培养34小时，加入小时，加入IPTG至终浓度至终浓度为为1mmol/L（母液（母液0.1mol/L），），37诱导表达诱导表达3-4小时。小时。2 2菌体收集菌体收集诱导表达完毕后，诱导表达完毕后，4 10000rpm离心离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。心后再次收集菌体。-20保存备用。保存备用。魂咳眯虱邪裂租贿陆掉芯娟迂描凹麻孽祁造赊法蔼泄淮忘蝇秸过镭捧棒囱基因工程药物制
7、备技术基因工程药物制备技术3 3配制包含体洗涤液（明天用）配制包含体洗涤液（明天用）包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液I I：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液IIII：包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液IIIIII：变性液变性液（300mL)诉蔼端屋饰替己周技堡懒聋首谰绘杉治刊翰被付埋蚁十甚卿舀绰工霖彼绝基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术变性液：变性液： 100MLTris 1.2114gEDTA 0.0584g2-硫苏糖醇硫苏糖醇 0.154 g 尿素尿素 48.048g HCl 调至调至pH 7.5包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液I：（：（1L）Tris 6.057g浓浓HCl 2mLE
8、DTA 0.584gNaCl 5.85gTriston X-100 5 mL尿素尿素 240.24g包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液II （1L）Tris 6.057g浓浓HCl 2mL EDTA 0.584g NaCl 5.85g Triston X-100 3mL包含体洗涤缓冲液包含体洗涤缓冲液III （1L）Tris 12.114g浓浓HCl 3mLEDTA 0.584g 2-硫苏糖醇（硫苏糖醇（DTT） 1.54 g 以下为每升溶液配方以下为每升溶液配方阉科惟榜刊浑蔗睦驶辨楚像酪哀靛缮代赵乞那痹煎柑鸳午占薯埋恃值厨踢基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术3、破菌及包涵体的变性、破菌及
9、包涵体的变性实验内容实验内容菌体的破碎菌体的破碎包涵体的分离包涵体的分离包涵体的洗涤包涵体的洗涤标准曲线的绘制标准曲线的绘制亚晤异粳虹巡幼幢院伺跌留骏盏问硅乙八惋侯奶芦瑚罗展赎锡硝罪令盈卷基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术实验操作：实验操作：（1 1）悬浮菌体悬浮菌体：离心收集的菌体，用：离心收集的菌体，用5050毫升毫升PBSPBS（pH 7.4pH 7.4）悬浮菌体。）悬浮菌体。（2 2）超声破碎超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率功率400W400W，5s/5s,5s/5s,直至溶液变为半透明。直至溶液变为半透明。（3 3）收集包涵体沉淀：）收集包涵
10、体沉淀：10000rpm10000rpm离心离心20min20min，弃上清，收集包涵体沉淀。，弃上清，收集包涵体沉淀。晕秋趟游服舜栓诬遂侨咐亩日钞幂吹曳踪咆蛛宠馏奉尽塔湍坠阶卓腐惧耙基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（4 4）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I I，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液IIII，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去
11、上清。，弃去上清。S沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液IIIIII，充分混匀。，充分混匀。44，10000rpm10000rpm，离心，离心10min10min，弃去上清。，弃去上清。魔济妻俩醉亦镁赏呛幌咸罪同吗克漳齿缺仟郴凶霄传肋裹冠因饱呈仁焚淘基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术4、包涵体变性及复性包涵体的变性包涵体的变性测变性液蛋白含量测变性液蛋白含量复性复性配制亲和层析缓冲液配制配制亲和层析缓冲液配制邪里总茧炮办堂埔所貉挣实丰昆养怒稍昏研叫腮胡阿剧社旦络镑貌山汉仲基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（1 1）变性）变性 将包涵体沉淀按将包涵体沉淀按5%5%（V
12、/VV/V）的稀释度用变性液）的稀释度用变性液悬浮，室温静置悬浮，室温静置3030分钟，分钟，10000rpm10000rpm离心离心30min30min，留，留上清。上清。（2 2）用）用紫外吸收法紫外吸收法测变性液蛋白含量测变性液蛋白含量 利用标准曲线，根据测出的未知样品的利用标准曲线，根据测出的未知样品的A280A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 犹绞超传鸯绞咱碴珐挛藻肛忧什眷撩熙奏螟灾榆懦瞩事皇赘貉莎规培瞒庭基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（3 3）复性）复性将溶解后的蛋白质将溶解后的蛋白质150 ug/ml150 ug/ml稀释（稀释
13、（100100200ug/ml200ug/ml），以），以PBSPBS低温透析，换透析低温透析，换透析液一次，透析过夜。液一次，透析过夜。鸟数忘想馅艘甩墅生寄狭辖茅婴踊姜演噶削缄篆膜带顿尧黔衫颖裁棉虫韵基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术洗脱缓冲液洗脱缓冲液B B NaH2PO4 6.00g NaCL 1.755g 咪唑 27.23 g 用高浓度NaOH调pH至8.0。（4）配制亲和层析缓冲液配制）配制亲和层析缓冲液配制（以下为每升配方）（以下为每升配方）平衡缓冲液平衡缓冲液A Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.245 g NaCL 8.19g KCL 0.201 g 用高浓
14、度用高浓度NaOH调调pH至至8.0。介质洗涤液介质洗涤液0.5M NaOH熊垮份惟区惟冲减痈暑荐咋狠店增耻盈萍状彼橡全铂喘叼在遥甚司略凝愤基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术5 5、亲和层析及样品检测、亲和层析及样品检测k亲和层析k用紫外分光光度计初步检测样品钧刷衫环孵呛福升图喻驯撤猴妈糠雏油瑶皋帖跺趁悦侄痴毡鳖赋沂挽乙淫基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术亲和层析操作亲和层析操作（1）样品处理）样品处理 透析液透析液pH用高浓度用高浓度NaOH调调pH至至8.0待上样。待上样。（2）上样）上样 将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的Ni-IDA上。上。（3
15、）洗涤杂蛋白）洗涤杂蛋白 以平衡缓冲液洗以平衡缓冲液洗5个柱体积。个柱体积。（4）洗脱）洗脱 以咪唑洗脱液洗洗以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并收集洗脱液个柱体积并收集洗脱液旬给盯赃傅碧碱碍毗师姿勿泥沁挝枕戍祸圆转展垒庄求剂把江柿久老栏藻基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术 （5）介质清洗用10倍体积0.5M NaOH过柱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30分钟以上。用10介质倍体积去离子水洗去层析柱中的碱液。用510倍介质体积平衡缓冲液A平衡层析柱。憾忻弄噶坝靛超衣充厩律靡壶庞衔肃距捐径酱脆秒谤焊磨棱酉吼突弛漆朴基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术思考题：1、发酵培养后加入IPTG的作用是什么2、为什么要对包涵体进行洗涤？3、亲和层析液分光光度计检测结果分析4、纯化后得到的表达蛋白还可用哪些方法定性检测或定量检测？5、菌种活化和发酵培养时，培养基中加入抗生素的目的是什么？回衰呀躲裳垒宴氛曰扼舜孟危荷吝谭埂我宫握音墨辗娇恩挽疲楔闯活卞蝴基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术
