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1、桑国俊桑国俊 甘肃省畜牧兽医研究所甘肃省畜牧兽医研究所 v一一 发展背景发展背景v二二 试验内容试验内容v三三 结果与分析结果与分析v四四 总结总结2一一 发展背景发展背景3v 随随着着胚胚胎胎工工程程技技术术的的深深入入研研究究和和商商业业性性胚胚胎胎移移植植技技术术的的发发展展，胚胚胎胎需需求求量量日日益益增增加加，单单纯纯依依靠靠超超数数排排卵卵获获得得体体内内胚胚的的方方法法成成本本高高、采采胚胚数数量量有有限限，不不能能满满足足科科研研和和生生产产的的需需要要。卵卵母母细细胞胞体体外外胚胚生生产产体体系系的的建建立立将将成成为为胚胚胎胎生生产产的的主主要要突突破破点点。深深入入研研究
2、究卵卵母母细细胞胞体体外外胚胚及及其其冷冷冻冻保保存存的的技技术术机机理理，建建立立一一套套完完全全在在体体外外培培养养条条件件下下快快速速生生产产和和保保存存胚胚胎胎的的技技术术体体系系，挖挖掘掘优优良良母母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义4v牛牛胚胚胎胎体体外外生生产产技技术术的的累累积积效效率率低低、技技术术复复杂杂、实实验验条条件件高高，受受培培养养基基、卵卵泡泡液液、共共培培养养细细胞胞等等因因素素影影响响大大，还还缺缺乏乏统统一一的的理理论论依依据据和和程程序序化化的的标标准准方方案案，仍仍处处于于探探索索阶阶段段。因因此此，还必
3、须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系5二二 试验内容试验内容6v试验内容试验内容技术路线技术路线种公牛种公牛鲜精鲜精冻精冻精洗涤、离心洗涤、离心精子获能精子获能母牛母牛超排超排卵巢采卵卵巢采卵IVMIVFIVC桑、囊胚桑、囊胚COCs7v试验内容试验内容试验设计试验设计v1 卵母细胞体外成熟培养卵母细胞体外成熟培养v1.1 COCs级别级别对卵母细胞成熟的影响对卵母细胞成熟的影响v1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响卵泡直径对卵母细胞成熟的影响v2 卵母细胞体外受精卵母细胞体外受精v2.1 不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响不同离心方法对精子
4、获能和卵母细胞受精的影响v2.2 不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响v2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响精子浓度对卵母细胞受精的影响8v3 胚胎体外培养胚胎体外培养v3.1 共培养体系对胚胎发育的影响共培养体系对胚胎发育的影响v3.2 培养液体积对胚胎发育的影响培养液体积对胚胎发育的影响v4 冷冻保存冷冻保存COCs的培养的培养v4.1 GL和和EG一步法冷冻对一步法冷冻对COCs的影响的影响v4.2 麦管和麦管和OPS管玻璃化冷冻对管玻璃化冷冻对COCs的影响的影响vSPSS统计分析统计分析9三三 结果与分析结果与分析10v1 卵母细胞体外
5、成熟培养卵母细胞体外成熟培养 v1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响级别对卵母细胞成熟的影响v选择选择A、B级级COCs进行成熟培养进行成熟培养COCs级别测定数定数成熟成熟数数成熟率成熟率% A级COCs40925563.80 a B级COCs42719747.80 bC级COCs33982.01 c D级COCs18600.00 dC 级COCs11v1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响卵泡直径对卵母细胞成熟的影响v卵卵母母细细胞胞的的成成熟熟率率与与卵卵泡泡直直径径关关系系密密切切，在在卵卵母母细细胞胞体体外外培培养养过过程程中中，宜宜选选择择卵卵巢巢发发育育正正常常的的卵卵泡泡采采
6、集集，而而不不宜宜选选择择发发育育过过大或过小的边际卵泡大或过小的边际卵泡卵泡直径卵泡直径样本样本成熟成熟成熟率成熟率2mm2mm64964912812819.06 19.06 b2 28mm8mm94594557857861.84 61.84 a 8mm8mm147147303017.07 17.07 c 12v2 卵母细胞体外受精卵母细胞体外受精v 2.1不同不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响v二二次次离离心心沉沉淀淀液液：精精子子活活力力0.44；获获能能效效果果10min最最高高为为0.41，15min为为0.32，超活化以，超活化以15min
7、时最好；受精率为时最好；受精率为40.19%v二二次次离离心心上上清清液液：精精子子活活力力0.56；获获能能效效果果10min最最高高0.59，15min时时较较低低为为0.585，超活化也以，超活化也以15min时最好；受精率为时最好；受精率为43.21%洗涤精洗涤精子活力子活力样本样本均数均数冻精解冻精解冻活力冻活力200.41 c2次离心次离心上清液活力上清液活力200.56 a2次离心次离心沉淀液活力沉淀液活力200.44 b13v从从试试验验结结果果看看，宜宜选选用用上上清清液液15min组组的的获获能能精精子子进进行行体体外外受受精精。本本试试验验突突破破了了精精子子离离心心法法
8、的的传传统统方方法法，避避开开了了单单纯纯利利用用沉沉淀淀液液进进行行精精子子获获能能的的思思路路，而而直直接接对对上上清清液液进进行行离离心心处处理理，获获得了理想的精子洗涤和获能效果得了理想的精子洗涤和获能效果精子获能精子获能活活 力力超活化效果超活化效果14v2.2 不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响v室室温温上上浮浮法法： 2024室室温温。上上浮浮60min，45min活活力力最最高高0.68，对其获能，对其获能15min后进行体外受精，平均受精率后进行体外受精，平均受精率41.40%室温上浮室温上浮精子活力精子活力冻精冻精 0.
9、5000 g 上浮上浮15min 0.5667 c 上浮上浮20min 0.6200 b上浮上浮25min 0.5933 bc上浮上浮30min 0.6100 bc上浮上浮35min 0.5467 df上浮上浮40min 0.5900 bce上浮上浮45min 0.6800 a 上浮上浮50min 0.6233 b上浮上浮55min 0.6033 bc上浮上浮60min0.5267 de15v恒恒温温上上浮浮法法：CO2培培养养箱箱（38.5）上上浮浮60min，30min活活力力最最高高0.697，对其获能，对其获能15min体外受精，受精率体外受精，受精率41.51%恒温上浮恒温上浮精子活
10、力精子活力冻精活力冻精活力 0.4800 d上浮上浮15min 0.5367 c 上浮上浮20min0.5933 b上浮上浮25min 0.6067 b上浮上浮30min 0.6967 a 上浮上浮35min 0.5867 b上浮上浮40min 0.5300 c 上浮上浮45min 0.4633 d上浮上浮50min 0.4367 d上浮上浮55min 0.4100 e上浮上浮60min0.3867 e16v二二种种不不同同上上浮浮方方法法的的精精子子活活力力和和受受精精率率之之间间差差异异不不显显著著（p0.05），恒恒温温上上浮浮法法的的效效果果略略高高于于室室温温组组。室室温温随随着着季
11、季节节和和气气候候变变化化而而变变化化，始始终终处处于于不不稳稳定定状状态态，精精子子活活力力升升降降比比较较零零乱乱，而而恒恒温温上上浮浮的的条条件件稳稳定定，精精子子活活力力升升降降序序列列比比较较整整齐齐，在在本本试试验验中中的的优优势势虽虽不不明明显显，如如从从可可控控角角度度考考虑虑，还还以以恒恒温温上上浮浮法法为为宜宜 培培养养液液表表.xls项目项目受精率受精率上清液获能上清液获能精子受精率精子受精率43.21沉淀液获能沉淀液获能精子受精率精子受精率40.18室温上浮获能室温上浮获能精子受精率精子受精率41.40恒温上浮恒温上浮获能能精子受精率精子受精率41.50受精率受精率获能
12、方法获能方法与卵母细胞受精率与卵母细胞受精率17v2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响精子浓度对卵母细胞受精的影响v本试验表明精子适宜浓度宜控制在本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.01.5106个个/ml精子浓度精子浓度样本样本COCs卵裂卵裂受精率受精率高（高（300万万/ml）3040213733.9637 c 中（中（150万万/ml）3040319047.3357 a 低（低（100万万/ml）3038216242.3837 b18v3 胚胎体外培养胚胎体外培养v3.1 卵丘细胞、卵丘细胞卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响共培养系统对胚胎发育的影响处理处理样本样本CO
13、Cs桑椹胚数桑椹胚数囊胚数囊胚数桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率卵丘细胞组卵丘细胞组303911133329.0713 b8.5063 b卵丘细胞卵丘细胞+bFF302421484534.9890 a 10.6343 a 对照组对照组30308781926.6677 c 7.2363 c 19v卵卵母母细细胞胞体体外外胚胚的的发发育育受受到到多多种种因因素素的的影影响响，培培养养过过程程中中要要摸摸拟拟卵卵母母细细胞胞或或胚胚胎胎在在子子宫宫中中的的条条件件，给给细细胞胞发发育育创创造造良良好好的的环环境境。卵卵母母细细胞胞体体外外受受精精过过程程中中明明显显存存在在发发育育阻阻滞滞，克克服服发发
14、育育阻阻滞滞的的主主要要手手段段是是用用共共培培养养系系统统提提高高卵卵裂裂率率和和桑桑、囊囊胚胚发发育育率率。本本试试验验通通过过添添加加共共培培养养物物质质，较较好好地地克克服服了了体体外外胚胚的发育阻滞的发育阻滞20处理处理样本样本COCs桑椹胚数桑椹胚数囊胚数囊胚数桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率50l培养液培养液303771233533.1433 b9.0680 b500l培养液培养液303881373836.2260 a 10.2310 a v3.2 培养液体积对胚胎发育的影响培养液体积对胚胎发育的影响21v大体积培养液培养的体外胚、大体积培养液培养的体外胚、 桑、囊胚率均较高于微滴培
15、养桑、囊胚率均较高于微滴培养v胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的变化而改变；培养液体积过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓变化而改变；培养液体积过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效地促进胚胎正常发育度降低，不能有效地促进胚胎正常发育22v4 冷冻保存冷冻保存COCs的解冻培养的解冻培养v4.1 GL和和EG一步法冷冻对一步法冷冻对COCs的影响的影响vCOCs在液氮保存在液氮保存1周后解冻成熟培养周后解冻成
16、熟培养v冷冷冻冻保保护护剂剂GL和和EG均均可可用用于于COCs的的冷冷冻冻保保存存（p0.05） ，但，但EG的效果比较好的效果比较好处理处理冷冻冷冻COCs成熟成熟COCs桑椹胚桑椹胚囊胚囊胚成熟率成熟率桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率GL356118371433.44 a 10.56 a 3.86 a EG349119381434.46 b11.18 b4.18b23成熟率成熟率桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率24v4.2 麦管和麦管和OPS管玻璃化冷冻对管玻璃化冷冻对COCs的影响的影响v以以麦麦管管和和OPS管管作作为为冷冷冻冻载载体体，二二步步法法玻玻璃璃化化冷冷冻冻COCs。对对冷冷冻冻
17、1周后的周后的COCs解冻培养解冻培养vOPS管管玻玻璃璃化化冷冷冻冻的的效效果果优优于于麦麦管管法法（p0.05），而而麦麦管管法法宜宜于于操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法处理处理冷冻冷冻COCs成熟成熟COCs桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚成熟率成熟率桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率麦管法麦管法 347102331229.84 a 9.34 a 3.47 a OPS法法 372118361431.89 b9.67b3.80 b25成熟率成熟率桑椹胚率桑椹胚率囊胚率囊胚率26v4.3 COCs冷冻方法的比较冷冻方法的比较vCOCs的的4种种处处理理方方法法在在成成
18、熟熟培培养养、桑桑椹椹胚胚发发育育和和囊囊胚胚发发育育方方面面的的趋趋势势基基本本一一致，整体效果的优势序列为致，整体效果的优势序列为EG法法GL法法OPS管法麦管法管法麦管法v玻玻璃璃化化冷冷冻冻效效果果低低于于程程序序化化一一步步法法冷冷冻冻法法。由由于于玻玻璃璃化化冷冷冻冻的的解解冻冻处处理理程程序序复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法处处 理理COCs成熟率成熟率 桑椹胚率桑椹胚率 囊胚率囊胚率一步法一步法甘甘 油油 组组 33.441310.56233.8610乙二醇组乙二醇组 34.459011.18104.1817平平 均均
19、33.950110.87164.0213玻璃化法玻璃化法麦麦 管管 法法29.83779.34433.4700 OPS 法法31.88809.66573.8003平平 均均 30.86289.50503.635127四四 总结总结28v1 COCs级别级别 选择选择A、B级级COCs进行卵母细胞成熟培养进行卵母细胞成熟培养 v2 卵卵泡泡大大小小 选选择择直直径径28mm卵卵泡泡的的COCs进进行行卵卵母母细细胞胞成成熟培养熟培养v3 离离心心法法精精子子获获能能 对对第第一一次次离离心心上上清清液液继继续续进进行行低低速速离离心心处理，可获得更好的精子洗涤和获能效果。处理，可获得更好的精子洗
20、涤和获能效果。低速离心低速离心v4 上浮法精子获能上浮法精子获能 选用恒温上浮法进行精子洗涤和获能选用恒温上浮法进行精子洗涤和获能 v5 获获能能精精子子浓浓度度 用用于于体体外外受受精精的的适适宜宜精精子子浓浓度度为为1.01.5106个个/mlv6 共共培培养养系系统统 卵卵丘丘细细胞胞+bFF 共共培培养养系系统统能能显显著著促促进进体体外外胚胚的发育的发育29v7 培培养养液液体体积积 大大体体积积培培养养液液培培养养的的桑桑、囊囊胚胚率率均均较较高高于于微微滴培养，大体积培养液更有利于胚胎发育滴培养，大体积培养液更有利于胚胎发育v8 冷冻冷冻COCs解冻培养解冻培养v 冷冷冻冻保保护
21、护剂剂EG和和GL对对COCs有有良良好好的的冷冷冻冻保保存存作作用用， EG效果比效果比GL更好更好v OPS管管玻玻璃璃化化冷冷冻冻效效果果优优于于麦麦管管法法，麦麦管管法法宜宜于于操操作作和和储储存，建议在实际操作中选用麦管法存，建议在实际操作中选用麦管法 v 程序化一步法冷冻程序化一步法冷冻COCs的效果优于玻璃化冷冻法的效果优于玻璃化冷冻法 30v1 卵卵母母细细胞胞及及体体外外胚胚培培养养：选选择择28mm卵卵泡泡的的A、B级级COCs，清清选选后后移移入入500l成成熟熟培培养养液液中中培培养养24h；拣拣取取成成熟熟良良好好卵卵母母细细胞胞，用用上上清清液液二二次次离离心心法法
22、或或恒恒温温上上浮浮法法清清选选和和获获能能的的精精液液体体外外授授精精8h，在在加加入入卵卵丘丘细细胞胞和和bFF的的IVC液液中中继继续续培培养养120140h，拣取桑椹胚和囊胚，拣取桑椹胚和囊胚v2 卵卵母母细细胞胞的的冷冷冻冻保保存存：选选择择28mm卵卵泡泡A、B级级COCs，用用以以EG为冷冻保护剂的麦管程序化一步法进行冷冻保存为冷冻保护剂的麦管程序化一步法进行冷冻保存v3 冷冷冻冻卵卵母母细细胞胞的的解解冻冻培培养养 ：冷冷冻冻卵卵母母细细胞胞解解冻冻后后，拣拣取取卵卵丘丘细胞完整的细胞完整的COCs按照正常卵母细胞进行培养按照正常卵母细胞进行培养根据以上试验结果，卵母细胞培养、体外胚培养、卵根据以上试验结果，卵母细胞培养、体外胚培养、卵母细胞冻存和解冻培养的操作程序概括为：母细胞冻存和解冻培养的操作程序概括为：31主要创新点主要创新点v1 系系统统研研究究了了牛牛卵卵母母细细胞胞体体外外培培养养技技术术，突突破破发发育育阻阻滞滞，将将卵母细胞体外培养到桑、囊胚卵母细胞体外培养到桑、囊胚v2 对对卵卵母母细细胞胞进进行行冷冷冻冻保保存存，探探索索了了COCs的的冷冷冻冻方方法法，并并对冷冻效果进行了评定对冷冻效果进行了评定v3 建立了新的精子洗涤和获能方法建立了新的精子洗涤和获能方法3233
