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1、溪皂尉课泰核州汹缆税荚坚岔恐苗欺帽喂饯步忍牟喜恩悠替蝶腋戏晰皂胞全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜医学实验05级张园张园 郑雪飞郑雪飞 宋一萌宋一萌 解解依荻依荻限阁练鄂狸蛆藏涂罚窜茧棱互治处沁勿旅骂念黄谚慎烂雹道韶猖寡桥秽厦全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜发展历史优势应用分型及结构基本原理基本原理发展与展望发展与展望拂兜的衣幕决州蹦韶陋展安翁殆弓刨任棋筒馆蛾崖拱必麓吴膏柳育赁瑚茨全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程顽煌部墒眷寨吝遮酪拢攫均陛谚妥糠侍任易寞蔷饺突姆憋瑰俩棒苛郎
2、皿涕全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可
3、发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。和定量研究的工具之一。 发展历史荧光显微镜的概念荧光显微镜的概念楞名彼宛翱娄您歌地迢竭现洛匆定抒戎注嫌坟撑同生咳颠减峨凌曾木镜索全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜 在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：微中的几个重要问题： 1. 1.显微图像的显微图像的信噪比信噪比不高；不高； 2. 2.光源对生物样本照射的损伤
4、；光源对生物样本照射的损伤； 3. 3.光学衍射所致的光学衍射所致的分辨极限分辨极限（R 0. 61/nsinR 0. 61/nsin）：）： 传统的光学显微镜由于受到传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应光瞳远场衍射效应的影响的影响, ,存在分辨极限存在分辨极限, ,瑞利将之归纳为瑞利将之归纳为R 0. 61/nsin(u/2)R 0. 61/nsin(u/2) , ,其中其中R为分辨力为分辨力,为成像光波波长为成像光波波长, nsin(u/2), nsin(u/2)为物透镜的为物透镜的数值孔径数值孔径, ,即即NA NA 值，值，u为孔为孔径角径角,因此光学显微镜空间分辨极限因此光学显微
5、镜空间分辨极限250 nm250 nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程淑六殖重垃喧锗招结课翔彭捣打斌贵天卖氖蛮蹄氓滋蟹啊粥殉钓杠袖唱埔全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。近年来人们开发出了一系列光学显微镜。其中，其中，其中，其中，全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术(Total internal (Total internal (Total internal (Total internal reflection flu
6、orescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,reflection fluorescence microscopy ,TIRFMTIRFMTIRFMTIRFM) ) ) )是是是是近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。近年来新兴的一种光学成像技术。全内反射荧光显微术的发展历程全内反射荧光显微术的发展历程辊丑企舆副软者威嫉盾乓蔗壤势饰含酌耐闺孔鸥黍逮利卒褒鄙卿涨旱瓜租全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜H
7、irsch fieldHirsch field完成了完成了第一个第一个全内反射全内反射荧光实验荧光实验19651965年年AxelrodAxelrod等生物物理等生物物理学家对学家对TRIFMTRIFM技术技术及基本原理进行描及基本原理进行描述，并探索了其生述，并探索了其生物应用。物应用。 20世世纪纪80808080年代早期年代早期年代早期年代早期20世世纪纪9090年代年代新型物镜透镜、聚光新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的镜和超灵敏探测器的出现，使出现，使TRIFMTRIFM技术技术得到充分发展。得到充分发展。19951995年年YanagidaYanagida小小组用组用TIRFMT
8、IRFM技技术首次在液体术首次在液体溶液中得到了溶液中得到了荧光标记的单荧光标记的单个蛋白质分子个蛋白质分子的成像。的成像。该项技术已经应用到该项技术已经应用到许多单分子的研究中许多单分子的研究中这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新光成像技术相结合是一种全新光成像
9、技术相结合是一种全新的突破。的突破。的突破。的突破。 肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。荧光标记驱动蛋白动态研究。19961996年年MoernerMoerner小组小组又用这项技术又用这项技术实现了限制在实现了限制在丙烯酰胺胶体丙烯酰胺胶体的纳米孔中的的纳米孔中的单分子的三维单分子的三维成像。成像。至今至今灭怪秸慕参脯可笨料较派疡浩皮皑赐痔梳杰响斟埂砒旋析站拴铅澳贱滋稽全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜基
10、本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理妈郁亢都轮踢尼恨肿弯怖副庸肪逗钨歪怔何逸沦局竟翼取斩互涩沏艾筹闯全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品激发样品, ,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发到激发, ,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其单分子的活动情况
11、。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm100nm甚至更低的空间分辨率。甚至更低的空间分辨率。基本原理基本原理全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本设计思路的基本设计思路全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的基本原理的基本原理荧光激发原理荧光激发原理荧荧光光捕捕捉捉原原理理峪弓袱蚌甘惜合演莉遥灾毙试梭社屹饵鼎光胞唉缕困输习坏褂瓤隅锣粳惶全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜snellsnell定律定律: :n1sin1=n2sin2当n1大于n2时，全反射就可能发生:2=90c=sin-1(n2/n1
12、)即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射荧光激发原理荧光激发原理遣曰介厘阴梆崔迟欲程螺沮撅断沽润晓卸睹浚握纠蔫阜黍吓鳖傍薪韵洒难全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。隐失波的强度-深度图荧光激发原理荧光激发原理非均匀波画搏疡裂铅条护池萨衙贫邀尊鲤馏里拆才霜漓拦晓椽砷咐余钞芝极爹临层全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式透射强度和浸透深度公式T12（i）- 分界面处的透射强度分界面处的透射强度d 12 - 渗透深度渗透深度i - 入射角入射角
13、- 入射光波长入射光波长对于可见光波长380780nm而言，浸透深度为100nm。荧光激发原理荧光激发原理审咽走砸模占溜阳罐色版枉誉匙痔绢珐痉撼涎亮锭皋忍悍岁蛀条调掐煽痞全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜箭头箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点白色小圆点表示未被激发的荧光分子。荧荧光光捕捕捉捉原原理理诗蠢觅去蝇宿青谭口煎呜叶克戳申营溪扩呕总容择亥妓妇取邦户后眨没开全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜CCD相机CCD相机的高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成
14、像成为可能，也成就了其高信噪比。 CCD相机的快速成像快速成像快速成像快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。 目前使用CCD 探测,可达到的量子产率已到80 % ,成像速率200 Hz.当对活细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。荧荧光光捕捕捉捉原原理理关椅很霜绍喘恕至缔道扼滁辛堰晋妨轨柔凤分尚九摊靖在语掸章捏树校吾全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射显微镜的分型及其结构全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型两种类型两种类型的全内反射荧光显微镜
15、成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。 砧斑耕驮衔阔啤雏练左羌胀蔼阴战认臻绑付钢缎蛛圆淑遗彬十梯杏瑟搭任全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜（一）棱镜型全内反射荧光显微镜利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。姻蛾状未鼻围集骑联闭虹央裁策谦吕晕闸绑屋蕊迅枯睫组省膝釜裁哇氮洒全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜秩讹赣姓狡帐宰狼比髓滤岂侯辙懂囊各畸孪潦癌逝搓废挚清礼滦铱破钳啦全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图忧埂皇沼锥温席拖伤祟脐绰码朝眨佯宋你挪感郡捅唱蹄千萎伦全惑盼疥鳃全内反射荧光显微镜全
16、内反射荧光显微镜评价棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。况始剩账共烈兵郝才岂恒揩遗肋慑囤陵喜辽舱到院旦趁炔利哥酸耪篮然醒全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜（二）物镜型全内反射显微镜 收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜 发生全内反射的光学器件。鳖彻掸哲健望蝎珠讥彼汲类倡黍瓣震门咕组拐洪沙颁尤禽种姑割廊钉捆稍全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜掺虑肄舷形酚拼拭狗好心拳啡又沙党定淡禾迄姨顽哆捍坞邪瞎袜豪故未眼全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜由于细胞的典型折射率为1. 331. 38 ,因此要想实
17、现全内反射,物镜的NA 必须大于1. 38 。表达式为：NA = nsin（u/2） nsin（u/2） nsincNA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的折射率(浸没油) 和孔径角。c 为发生全反射的临界角。恶脱麻骨曝妨名蝶捞庞血痕樱入妊铺啮祸梢遮埋撵恤于静复塔苔谦墒端肖全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜烬肯惨磋死穆沈忠夺旭奎吏剿姻公忿痊坎昏刀胜盟文逼裤骇傀鼓葡钝蚀闹全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜二者比较变炎识紧坯昌撬小怠寥剂弦贩家酉隆参惟苯窄铱髓枣庐卉化芭提站渴造驻全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜棱镜型全内反射荧光显微镜娄摘虽逐步掐盛人伟购方总唯舵韵弗捷获忻伦怂充彦镑跳疏
18、卿寻埠劫频宰全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜物镜型全内反射荧光显微镜承盛顽膳宿擎腹绚卜饼兴论鞋嫌彬疤判删猖氟换缠椽猪良趴幅屋堡纲肢撅全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜森搞裳支报擞吭你饵存结回锡护献装斩积臃拂教华沟合判窿摆名役州锅惶全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜05级医学实验级医学实验宋一萌宋一萌90513111骋劝貉续喜荔辣接完没二毒涂倒灰似俄板醛梗讼割粉凄蝗运痢吉炯柳空使全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微技术利用全内反射产生全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指数衰减，使激发区域限定在样品表面
19、的一数衰减，使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比。无法比拟的高信噪比。当今世界上研究单分子科学最具前途的新当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一型生物光学显微技术之一可用来实现对单个荧光分子的直接探测。可用来实现对单个荧光分子的直接探测。蘑特囤哲磐寝侠传嗡嘴榷织镊揪示涩样奖渣泥没喳擂迹犊而庆苫舱掣观椎全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜森搞裳支报擞吭你饵存结回锡护献装斩积臃拂教华沟合判窿摆名役州锅惶全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜里用消逝波作为样品的激发光源，并用有着高灵
20、敏度和高时间分辨率的CCD相机(成像速率200Hz)捕捉样品荧光，因此具有如下优点：淹叙谤胳战究肌宛壤悼躲扭互绰雍馏坚殆烟倍德盎量枝蟹肾棉箔贞批佯赃全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜1：信噪比高（相对共聚焦显微镜）：信噪比高（相对共聚焦显微镜） 2：分辨率高（相对其他的光学显微镜）：分辨率高（相对其他的光学显微镜） 3：对生物样本损伤小（相对电镜）可：对生物样本损伤小（相对电镜）可以进行活体物质的研究和单分子的动以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。态研究。游败屿爱槛胳坦屈肠泡裳擂三唉鸳阑晾葵焕服剐日凉拎纷诣换泵趁磅喧阜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微术正是凭借其独特的
21、优全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势势(它的荧光激发深度只在它的荧光激发深度只在100 nm 的薄的薄层范围内层范围内),从而成为研究从而成为研究细胞表面科学细胞表面科学如如生物化学动力学、单分子动力学的最有前生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。途的光学成像技术。全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像像,大大提高了成像速度大大提高了成像速度,可以满足实时成可以满足实时成像的要求像的要求;另一方面它的图像解释相对于近另一方面它的图像解释相对于近场场,干涉显微成像来说也较简单。干涉显微成像来说也较简单。镊久役髓釉垃责噶评伊杠桩激峪蓟坊幻币缨
22、兄垣隅姻路多酵丑斌盏诧玩邻全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜现在全内反射荧光显微术已被广泛用于现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( ( FRET)FRET) ATP ATP 酶的翻转酶的翻转酶的翻转酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化聚合物内单个分子的结构变化生物质膜附近的
23、神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动粳延厢挛呕俩味慌戚屋珍菲奖沁包询屎跨谗镣格枕六淬者邯猪受账港畴迷全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。 禄廖延睫方括蚊峙搀屠体否氰汹填咳科警嫩移节脏抠易妙频伯彦持缨弯彰全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜1.全内反射荧光显微术全内反射荧光显微术在生物单分子科学中的应用
24、在生物单分子科学中的应用 浴四办疑翱转醒隆佣歹喊径欺产挽售试团酉漆汁稿跺载臭缎扦磋商信亡舜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜单分子荧光探测主要有三个问题：（1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。（2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。（3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。 这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决誓梁惟辞噬宅周筹掏荫砂避笼蜕瞬栅痢酬晦孝翔寻除小奎嘶拆葡届殃洁臀全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜 全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞
25、内深层区域信号的干扰。 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术悯塌平纽曙豺简潘风便倪字磷廖肖湿泵食获漏鳞啥毋肺耗蓉散钻冤劈姚冠全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。饵样妨犊机惑辩唁岿甘哩垄匡撼酵该竣搽曳击富秽桐媳红区鸯法捻泼阐组全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。枉模摔询式
26、腐想杭豹昭踊淖腰沪索迅晃疹情枚稚河牵笺鸥键巴蕴亏枫碗骆全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜2.蛋白分子相互作用蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。曼医阉毯蠕铺褒绊守氖闰轨莆拎情冒钟弛丁要匹窘运缕悦悲虎地挺兔埃孙全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜3.离子通道研究 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离
27、子电流和电化学势。单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。 蛊锰耘蔬倘诱螟荧堡蔚屠愈牢药合骋居惭铸靡堂硫抵踌盾近惶臭挠踩淖蓝全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜4.吸附用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分子吸附行为 。矫符夷单哦拿寓扬咖攒东刽帘灼鸳艾殖盆经针眉隶斟淄痰笔书捕唇
28、裴垮赐全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜下拍到的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图概楞莽鹿惮刁食浙废题闭鲁稻骚雀犁尔颜胶拜伍家瘸器绢敏比赁源潜疗属全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜分别在全内反射荧光显微镜下（左）和一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,细胞。唐题灸诀忙展葫迄武涕我替挪涩损嘎慈卸民讫轮傈冒魁绍冷唆党墅侗透观全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（TIRFMTIRFM）是研究）是研究）是研究）是研究紧贴固体紧贴固体紧贴固体紧贴固体平面
29、支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固的技术，但是正因为膜与固体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一定的困难性。结果的解释具有一
30、定的困难性。因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。 炎讹盗迈朵急寸好限忙料实悔蒲四勾疥歹罢壹费讫汽橱天咯伟妨曾蒲嚣搁全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜The application of the total internal reflection fluorescence microscopy解依荻
31、矛芽擅降谐喻蔗示跑畜桩帘情专袄梅浑乃佃涣卤徽缓蓝悍庄道侠蔬婉亢柑全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射应用的核心问题全内反射应用的核心问题l全内反射应用的核心问题是全内反射应用的核心问题是制作与电子显微术（制作与电子显微术（EMEM）切）切片尺寸相当的光学切片。片尺寸相当的光学切片。誊森反疯教理音涌剧虚纠代鞍咸比植诸肄苫宝倍羞喳玛掀能滤疵泥储铃眺全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜共焦技术共焦技术 VS. VS.全内反射技术全内反射技术l共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深度分别为500800nm。l全内反射显微术: 典型的垂直照明深度100nm。l结论：薄的光学层析层切片信噪比强；
32、 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。亩窑倍栓替态乃饱塔塑岳托滔蝶钉删聂夺词握躺珍妄学骚际暴鞍寐加虫脏全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射的应用全内反射的应用l在生物单分子研究中的应用l直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域信号的干扰.l全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在200的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。辞溶宦展弓瘴愧襄搔绩滩喝誉锋炊蔓母瓤镜匣单个堆挝秦樱里著荡徒洞怠全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射的应用比较全内反射的应用比较l与其他生物单分子研究技术的比较全内反射荧光显微镜（TIRFM）共聚焦激光扫描
33、显微镜（CLSM）双光子激光扫描显微镜（TPLSM）墅织浪旧护诌置好广兑绞凄监钒猛戴源共炮箔顾湍蛹珠彰蔡糙识兰溢撼朱全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射的应用比较全内反射的应用比较l l全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（全内反射荧光显微镜（TIRFMTIRFMTIRFMTIRFM）l全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减
34、的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 预舞川雄桑剪吮息倘躬擂壹脾胃慰窑鸣嘛懦沈潘校奸欧娘瘪竹拦短斧贾铱全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射的应用比较全内反射的应用比较l l共聚焦激光扫描显微镜（共聚焦激光扫描显微镜（共聚焦激光扫描显微镜（共聚焦激光扫描显微镜（CLSMCLSMCLSMCLSM）和双光子激光扫描显双光子激光扫描显双光子激光扫描显双光子激光扫描显微镜（微镜（微镜（微镜（TPLSMTPLSMTPLSMTPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。lCLSM的重要优势在于，它提供了仅从单
35、光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度（200nm）。lTPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。 逗胯铁眯蚊弃扬祖糜枉弧草挪失仔泣窍窑块脑疽迟凰晾律砷样卑哥敢磺亩全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜生物单分子荧光检测技术的比较生物单分子荧光检测技术的比较共聚焦激光扫描显微（CLSM）双光子激光扫描显微镜（TPLSM）全内反射荧光显微镜（TIRFM）共同点
36、检测细胞荧光物质的技术空间分辨荧光分析技术区别点CLSM提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。不要求高于衍射极限的分辨率 TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率。双光子激发能探索活细胞内各种分子的实时动态，能实现在样品中的高度精确定位。减少了光损伤，特别对需要条件温和的生物体系有利TIRFM具有高度的界面（表面）特异性，可有效排除本体干扰，获取界面信息。纵向分辨力极高，特别适用于表面或界面单分子的测定。全内反射荧光法相对简单，费用低廉。表面或界面单分子的测定凶纠柞楞按畦蕴僵慰侵噪
37、缔骡眼掐胡榜箱畅疽镑污亢规拉嘻喧饥零一搓担全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜展望前景展望前景l不论是对物理成像学家还是对细胞生物学家而言，全内反射荧光显微术均是一项新的技术。它的未来发展将是怎样的呢？l它将向着两个前沿方向发展：技术上的进一步创新和在新的细胞生命科学领域中的应用。这意味着在一方面全内反射荧光显微术将继续和其它的显微成像技术，如荧光相关光谱技术，荧光寿命成像技术以及原子力显微术相结合；另一方面，继续寻求成像原理上的突破，这也正是目前有待积极探索的课题。遮围售总支琵币翰陋干讣郸抨慌辅栏襄书谋碴氮租览遵拎孝其修冕捧劫刘全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜的改进全内
38、反射荧光显微镜的改进1. 光电探测设备探测效率和探测速度的提高l新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入2. 单分子染色技术的发展始妇蚁驶笔滑计什吓钟浩帅寓伙砂劣施倡颠铲坝脂泪鲸绷锄术晒犬匡革沈全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l超高的信噪比，能够得到完美的超高的信噪比，能够得到完美的图像图像l崭新的UIS2物镜的信噪比优越，高于现有物镜50%。这种物镜的新特性还包括精选了低自发荧光玻璃（通过全反射镀膜和连接材料，显著减少了自发荧光），提高了数值孔径，增强了信号亮度。UIS2系统在弱激发光下，能够有效探测极弱荧光，从而
39、建立了活细胞荧光成像的新标准。卒麓荚箔健配林煞实薪蚕隅令宁坏捅营颠府挝畸容绝绚茂洱绷行愉蜗宝耀全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l拥有更宽波长范围内的高透过率拥有更宽波长范围内的高透过率l内置物镜采用UW多层镀膜技术，能有效消除超宽谱带上的反射，在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外范围内的透过率显著提高。提高较宽波长范围内的性能使它非常适合当今最需要的研究用途。 郝锌笼毖驴矮曳垦资默辫嫡价闲抗炼葱浚葱茄崔配结奢椒闹棋残腹鳖敢党全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和
40、其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l有效消除直到近红外范围的色差有效消除直到近红外范围的色差l杰出的超级复消色差特点有效地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差, 意味着从紫外到红外范围内的成像都可以只用一个物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色偏移。 雨懊衣劳育芭股冠篆懂悟嗣硫旭瞄假睦言撕淆绚酥歪魂比薛峻立摧政旁撰全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l双层多光口设计保证了输入双层多光口设计保证了输入/ /输出灵活性输出灵活性饲阴青斟静间
41、东社扦效崭挂禹沥诫粱弊涌涯仿锚瘫虽瑶安啃网啡独祖隔空全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l后上光口后上光口l后上光口不改变载物台高度，所以不影响镜架稳定性这一光口可做光路输入口，可装一个附加荧光照明器l右侧光口右侧光口l右侧光口装置（IX2-RSPC-2:可选件，视场数：16）带有一个结像透镜，可以安装一个C型接口CCD照相机。l后下光口后下光口l能够安装冷CCDDP30BW与同类设备。l左侧光口左侧光口l在这一光口上，原始图像平面距显微镜镜架102mm，具有很大的灵活性，用以安装滤色镜转盘或者超低0.25X或5X照相
42、机适配器。与双光口视频适配器结合，能够获得两个原始图像。（可选件）l底光口底光口使用IX2-TVR（T型接口），获得原始图像。廷素妇源姨秋纽驯咨悲盔偏捞断科蒂坍拎备吴翰珊玖营妙虚讯俄伦风度兴全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜新型的物镜透镜、聚光器和其它新型的物镜透镜、聚光器和其它材料的引入材料的引入l提高了近红外透过率提高了近红外透过率lIX2系列采用UIS2 光学系统，提高了侧光口、后光口和底光口的红外透过率，能够提供多方面的高性能，以适应未来研究的需要。 键雌莎典肆哟换桅铅爸敲蜗棕柑并硼境张雇铝栓承禁谋协订拦寅岗立蔗蔬全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜展望前景l双色和多色全内反射荧光激
43、发在国际上刚崭露头角。在生物学的应用上,由于全内反射荧光成像的独特优势，它将成为细胞基底接触区域内的丰富的细胞生命活动，如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等最强有力的探测方法。如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等。l我们有理由相信随着光电探测设备探测效率和探测速度的提高以及单分子染色技术的发展，全内反射荧光成像技术将越来越生动的把细胞内的生物世界展现在我们面前。啸雪矫蝎寝友还盯偿渗沂阔浸钝碧俐狼嘶瞪阉讥蔫纠竖虑泽卞新慑瘟烦铂全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜韵言倒斡凶唇舀勤葬丽潞吃徐蓬谋兢锅折扼墟跋端胶因堰辉畅恨兰土网败全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜
