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1、第第 2 2 章章DNADNA重组克隆的单元操作重组克隆的单元操作 DNA DNA重组的载体；重组的载体； DNADNA的体外重组；的体外重组； 重组重组DNADNA分子的转化与扩增；分子的转化与扩增； 转化子的筛选与重组子的鉴定；转化子的筛选与重组子的鉴定； 目的基因的克隆。目的基因的克隆。2.1 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒（质粒（plasmidplasmid）噬菌体噬菌体考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）与噬菌粒与噬菌粒人造染色体载体人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能及特征1.1.载体的功能载体的功能 为外源基因提供进
2、入受体细胞的转移能力为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.2.载体应具备的条件载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 质粒质粒1.1.质粒的基本特征质粒的基本特征 质粒是生物细胞内固有的、能独立于
3、寄主染色体而自主复质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的。型的。绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。 质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1 - 1 - 100 kb100 kb。质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与
4、模板的结合orioriE.coliE.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（+ +）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒DNADNA复制启动控复制启动控制制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合PcopPcopcopcopP/P/OrepOreprepreporioriCopCopRepRep 可扩增性可扩增性根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）
5、多寡，质粒可分为根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 1 - 5 5 拷贝拷贝 stringent plasmidstringent plasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 30 - 50 30 - 50 拷贝拷贝 Relaxed plasmidRelaxed plasmid 质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒：接合型质粒： 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用
6、）。个细胞（接合作用）。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 质粒的不相容性质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101pSC101、F F拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 携带特殊的
7、遗传标记携带特殊的遗传标记物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X X射线射线物质合成：细菌毒素、有机碱物质合成：细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。2.2.质粒的改造与构建质粒的改造与构建 野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSCpSC101101、ColE1ColE1和和pSFpSF21242124构建。构建。 删除非必需
8、区域DNA。 灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因 加入标记基因。 添加MCS，删除重复酶切位点。 加上一些调控序列。3.3.质粒的分类质粒的分类人工人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝高拷贝质粒质粒 扩增基因扩增基因低拷贝低拷贝质粒质粒 表达某些毒性基因表达某些毒性基因测序测序质粒质粒 用于测序用于测序整合整合质粒质粒 外源基因的整合外源基因的整合穿梭穿梭质粒质粒 基因克隆基因克隆表达表达质粒质粒 表达外源基因表达外源基因探针探针质粒质粒 启动子等元件的克隆筛选启动子等元件的克隆筛选4.4.重要的大肠杆菌质粒载体重要的大
9、肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR322 pBR322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因克隆用于基因克隆 pUC18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ pUC18 pUC18 / 19/ 19：正选择标记正选择标记 lacZlacZ 的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPla
10、clacZlacZMCSMCSbb-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的aa-肽段肽段a a a a a ab b b b b b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-D-D-半乳糖半乳糖苷苷X-galX-gal蓝色 pGEM-3Z pGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ 用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的RNARNA聚合聚合2743 2743
11、bpbpMCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriApAprrpGEM-3ZpGEM-3ZP PSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶。如聚合酶。如E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等。等。碱溶法碱溶法 i. i.用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 ii.ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 iii.iii.加加NaOHNaOH和和SDSSDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 iv.iv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染
12、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体DNADNA及大部分蛋白质及大部分蛋白质 v.v.离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质vi.vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNADNAvii.vii.用无用无DNaseDNase的的RNaseRNase去除残余的去除残余的RNARNA cccDNAcccDNAL-DNAL-DNAocDNAocDNA5.5.质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化 沸水浴法沸水浴法 i. i.用含有用含有EDTAEDTA和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液
13、悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 ii.ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 iii.iii.沸水浴沸水浴4040秒钟秒钟iv.iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物 v.v.乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA噬菌体噬菌体 噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。1. 1. 大肠杆菌的大肠杆
14、菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNA l l 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA-DNA组组成成 l l-DNA-DNA全长全长48.548.5kbkb全基因组共全基因组共3636个基因个基因 生物结构5 GGGCGGCGACCT5 GGGCGGCGACCT3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5 COSCOSCOSCOScoscos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DN
15、ADNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l l l - DNA- DNA 感染裂解周期感染裂解周期E.coliE.coli吸附吸附LamBLamB受体受体注入注入复制复制包装包装裂解裂解体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75 - 105%75 - 105%即即 36 - 51 36 - 51 kbkbDDAA 溶原状态溶原状态 l l噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其DNADNA直直接
16、接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNADNA上上，并并不不产产生生子子代代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。 l l-DNA-DNA载体的构建载体的构建 野野生生型型l l-DNA-DNA包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源DNADNA片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染力的噬菌体颗粒。染力的噬菌体颗粒。 根据切除的多少，可将根据切
17、除的多少，可将l l-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体 缩短长度插入型载体插入型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 3751 37）取代型载体取代型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26） 删除重
18、复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型的l l-DNA-DNA链上有链上有5 5个个EcoRIEcoRI位点和位点和7 7个个HindIIIHindIII位点，位点，不利于重组操作，必须删除至不利于重组操作，必须删除至1 - 21 - 2个。个。同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，还需要增片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。加一些单一的酶切位点。灭活灭活某些与裂解周期有关的基因，某些与裂解周期有关的基因，构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体 琥琥珀珀型型突突变变（supsup) )是是指指由由CAGCAG（GlnGln）向向UAGUAG（
19、stopstop）的的突突变变。大大肠肠杆杆菌菌的的某某些些菌菌株株含含有有特特异异性性的的校校正正基基因因，其其编码产物校正编码产物校正tRNAtRNA能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。 基基因因工工程程实实验验中中使使用用的的受受体体则则是是具具有有琥琥珀珀型型突突变变体体校校正功能的菌株。正功能的菌株。 加装选择标记加装选择标记野生型野生型l l-DNA-DNA上缺少合适的选择标记。上缺少合适的选择标记。l l-DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记加装选择标记：加装选择
20、标记：clcl+含有完整标记基含有完整标记基因的因的l l- -载体进入受体细胞后，建立溶原状载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNADNA插入到标记基因中，基因灭活，插入到标记基因中，基因灭活， l l- -重重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。加装选择标记：加装选择标记：lacZlacZ lacZlacZ基因编码基因编码b b- -半乳糖苷酶，能催半乳糖苷酶，能催化化无色的无色的X-galX-gal生成蓝色化合物。当外源基因生成蓝色化合物。当外源基因插入到插入到lacZlacZ 基因中，基
21、因灭活，不能合成基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体蓝色化合物；而空载体l l-DNA-DNA则产生蓝色则产生蓝色透明斑。透明斑。以以EcoR为例为例A、B、C、D、E和和F片段长度分别为片段长度分别为21.6kb、4.9kb、5.5kb、7.5kb、5.9kb和和3.3kb用于建立用于建立cDNA文库和克隆外源目的基因文库和克隆外源目的基因2.6kb非必需区引入筛选标记非必需区引入筛选标记 l l-DNA-DNA重组分子的体外包重组分子的体外包装装 l l-DNA-DNA重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重组颗粒，方可高效导入受体细
22、胞。重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l l噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆菌中提取，现已商品化。杆菌中提取，现已商品化。 l l-DNA-DNA及其重组分子的分离纯化及其重组分子的分离纯化 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期；将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期； 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养1 1小时；小时； 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达1
23、01013 13 -10-1014 14 / / L L，大肠杆菌细胞已完全裂解；大肠杆菌细胞已完全裂解； 超速离心，沉淀噬菌体；超速离心，沉淀噬菌体； 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l-DNA-DNA ； 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l-DNA-DNA 。 l l-DNA-DNA作为载体的优点作为载体的优点 l l-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒可在体外包装成噬菌体颗粒。 l l-DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量。远远大于质粒的装载量。 重组重组l l-DNA-DNA分子分子的筛选较为方便。的筛选较为方便。 重组重组l
24、 l-DNA-DNA分子的提取较为简便。分子的提取较为简便。 2.2.大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNA M13 M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13M13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNADNA组成组成 M13M13 DNADNA全长全长64076407个核苷酸个核苷酸M13 DNAM13 DNA上上有有1010个基因个基因27002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子M13M13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 生物结构 感染周期感染周期E
25、.coli基因基因II蛋白蛋白基因基因II蛋白蛋白基因基因V蛋白蛋白+ DNA+ DNA+ DNA+ DNA+ DNA+ DNA M13 DNA M13 DNA载体的构建载体的构建III VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型M13RF-DNAM13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mpM13mp系列载体系列载体lacZlacZ polylinkerpolylinker 通过定点诱变技术封闭重复的重要限制性
26、酶切口；通过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口； 引入合适的选择性标记基因；引入合适的选择性标记基因；引入合适的选择性标记基因；引入合适的选择性标记基因； 在在MCSMCS接头片段的两侧区域改为统一的接头片段的两侧区域改为统一的DNADNA测序引物。测序引物。 加入加入MCSMCS；考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNADNA的装的装载量。载量。 将噬菌体将噬菌体DNADNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组能最大限度地
27、缩短载体的长度，同时又能保证重组DNADNA分子在分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。粒载体的思路。1.1.考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid） 考斯质粒载体的构建考斯质粒载体的构建考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有pHC79pHC796100 6100 bpbpTcTcrrll fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalIl l-DNA -DNA coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子
28、的特殊类型的载体。特殊类型的载体。1.1.7 kb7 kb的的l l-DNA-DNA片段片段 + + pBR322pBR322片段片段装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb。 考斯质粒载体的特点考斯质粒载体的特点 能像能像l l-DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。 装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围。且克隆片段具有一定的大小范围。 能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制。中自主复制。 重组操作简便，筛选容易。重组操作简便，筛选容易。 不能体内包装，不裂解不能体内包装
29、，不裂解受体细胞。受体细胞。pUC118 pUC118 pUC18 pUC18 + + M13M13间隔区间隔区 IGIGpUC119 pUC119 pUC19 pUC19 + + M13M13间隔区间隔区 IGIG500 500 个拷贝个拷贝3200 3200 bpbpMCSMCSlacZlacZlacIlacIorioriApAprrM13-IGM13-IGpUC118 / 119pUC118 / 119表示表示M13M13辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA2.2.噬菌粒（噬菌粒（phagemidphagemid or or phasmidphasmid） 噬菌粒载体的构建噬菌粒载体的构建
30、噬菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体间隔区（间隔区（IGIG）以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 噬菌粒载体的特点噬菌粒载体的特点 具有质粒的基本性质，便于外源具有质粒的基本性质，便于外源DNADNA片段的克隆及重组片段的克隆及重组子的筛选子的筛选; ; M13-DNAM13-DNA的重组分子在复制时常会发生的重组分子在复制时常会发生DNADNA缺失，而噬菌缺失，而噬菌粒重组分子则相对稳定；粒重组分子则相对稳定； 在一定程度上提高了外源在一定程度上提高了外源DNADNA片段的装载量；片段的
31、装载量； 通过克隆双链通过克隆双链DNADNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNADNA。人造染色体载体人造染色体载体 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常
32、用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）1.1.细菌人造染色体细菌人造染色体(Bacterial Artificial Chromosomes BAC)(Bacterial Artificial Chromosomes BAC)细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的基础上质粒的基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在50 - 300 50 - 300 kbkb之间。之间。pBACspBACs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clus
33、tergene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库2.2.酵母人造染色体酵母人造染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC)(Yeast Artificial Chromosomes YAC)YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建酵母人造染色体的构建pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染
34、色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb 酵母人造染色体的使用酵母人造染色体的使用pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体2.2 DNA2.2 DNA的体
35、外重组的体外重组限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶其他用于其他用于DNADNA重组的工具酶重组的工具酶DNADNA切接反应的影响因素切接反应的影响因素DNADNA分子重组的方法分子重组的方法限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1. 1. 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用hsdhsd R R：编码限制性核酸
36、内切酶编码限制性核酸内切酶hsdhsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsdhsd S S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968 1968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIIHind III 2. 2. 限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP
37、MgATP Mg2+2+ SAM SAMATP MgATP Mg2+2+ SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n dH i n d III IIIH Haemophilusaemoph
38、ilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3. II 3. II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4 - 84 - 8对碱基的特定序列对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3
39、 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoREcoR I I的识别序列的识别序列EcoREcoR I I的切割位点的切割位点II II 型限制性核酸内切酶的识别序列型限制性核酸内切酶的识别序列nnII II 型限制性核酸内切酶的切割方式型限制性核酸内切酶的切割方式 同位酶：识别序列相同，切点不同；同位酶：识别序列相同，切点不同； 同裂酶：识别位点与切割位点相同，来源不同；同裂酶：识别位点与切割位点相同，来源不同； 同尾酶：识别位点不同，但切出的同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同片段具有相同的末
40、端；的末端； 少数酶切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作少数酶切割活性依赖于识别序列内部碱基的甲基化作用。用。EcoRIEcoRI等产生的等产生的55粘性末端粘性末端5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5C 5EcoRIEcoRI 37 37 5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -
41、GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG- -CC- -T T- -GG AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA GG- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPPII II 型限制性核酸内切酶的切割方式型限制性核酸内切酶的切割方式PstIPstI等产生的等
42、产生的33粘性末端粘性末端5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5PstIPstI 37 37 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -OHOH PP- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -PP OHOH- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -C
43、C- -T T- -C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPPPvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC-
44、-GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5PvuIIPvuII 37 37 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -OHOH PP- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -PP OHOH- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -C 5 C 5 4. 4. 甲基化酶的基本特性甲基化酶的基本特性 甲基化酶识别位点与限制性内切酶相同，命名方法在内甲基化酶识别位点与限制性内切酶相同，命名方法在内切酶前加切酶前加M. 一种甲基化酶在封闭一
45、个内切酶切口的同时，可能会产一种甲基化酶在封闭一个内切酶切口的同时，可能会产生另一种酶的切口；生另一种酶的切口； 大肠杆菌的甲基化酶有两种，大肠杆菌的甲基化酶有两种，Dam和和Dcm； 特殊情况。例：特殊情况。例：Cla 5-ATCGAT-3DNADNA连接酶连接酶1. T4-DNA1. T4-DNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质 修复双链修复双链DNADNA上缺刻处的磷酸二酯键上缺刻处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -A
46、A- -GG AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5nicknicknicknick 修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺刻处的磷酸二酯键链上缺刻处的磷酸二酯键3 3 CC- -GG- -AA- -GG AA- -CC- -GG- -GG
47、- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5PPT4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG- -CC- -UU- -CC- -UU- -GG- -CC- -CC- -GG- -GG- -AA- -GG 3 3OHOHnicknick5 5 GG- -CC- -UU- -CC- -UU- -GG- -CC- -CC- -GG- -GG- -AA- -GG 3 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -AA- -CC- -GG- -GG- -CC- -CC- -T T- -C 5C 5 连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子分子5 5 GG- -CC- -T T- -
48、CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG 333 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC 5 55 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -OHOH PP- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG 333 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -PP OHOH- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶其他用于其他用于DNADNA重
49、组的工具酶重组的工具酶1. 1. 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I（ DNA DNA polpol I I ） 5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活聚合酶活性性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I的基本性质：的基本性质：3 3 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -A 5A 55 5 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -OHOH5 5 pppppp dNdN Mg Mg2+2+3 3 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC
50、- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -A 5A 55 5 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -OHOHDNA DNA polpol I I5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G 5 5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性 3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性C切口前移标记切口前移标记DNADNA 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的
51、基本用途：2. 2. 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（ KlenowKlenow ） KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质：5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性无5 533的核酸外切酶活性 补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T
52、- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 KlenowKlenowdATPdATP dTTPdTTP5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OH-OH-T T- -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 KlenowKlenow酶的基本用
53、途：酶的基本用途： DNADNA片段片段3 3 末端的同位素标末端的同位素标记记5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -OHOH PP- -AA- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OHOH- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 KlenowKlenowaa-3232P-ppP-ppppdA dA dTTPdTTP5 5 GG- -CC- -T T- -GG- -AA- -AA- -T T- -T T- -OHOH PP- -AA
54、- -AA- -T T- -T T- -CC- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -CC- -T T- -T T- -AA- -AA- -PP OH-OH-T T- -T T- -AA- -AA- -GG- -CC- -T T- -C 5 C 5 cDNAcDNA第二链的合第二链的合成成 双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列2.2.末端脱氧核苷酰转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶（TdTTdT）不需要模板的不需要模板的DNADNA聚合酶，聚合酶，随机掺入随机掺入dNTPsdNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTMgMg2+2+
55、 dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 5 p3 HOOH 3 p 5 TdTTdTCoCo2+2+ dATPdATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 AAAAAAAAAAA5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -T T- -GG- -AA- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 3S1S1
56、ZnZn2+2+5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -C TC T- -T T- -GG- -AA- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 35 5 GG- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -CC- -T T- -C TC T- -T T- -GG- -AA- -G GG G- -AA- -GG- -T 3T 35 5 dNMPsdNMPs 或或 5 5 NMPsNMPs 内切单链DNA或RNA3. S13. S1核酸酶核酸酶 内切带缺口或缺刻的双链内切带缺口或缺刻的双链DNADNA或或RNARNA5 5 G
57、G- -CC- -T T- -CC- -AA- -G CG C- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 nicknickgapgapS1S1ZnZ
58、n2+2+5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG3 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CCT T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 3AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 特征：特征： 降解单链降解单链DNA或或RNA，包括不能形成双链的区域，降解，包括不能形成双链的区域，降解DNA的速度大于降解的速度大于降解RNA的速度；的速度； 降解反应的方式为内切或外切；降解反应的方式为内切或外切； 酶量过大时会伴有双链核酸的降解；酶量过大时会伴有双链核酸的降解； S1核酸酶常用来切平突出的单链末端及制作核
59、酸酶常用来切平突出的单链末端及制作S1图谱。图谱。4. 4. 单链内切双链外切的核酸酶：单链内切双链外切的核酸酶：Bal31Bal31核酸酶核酸酶CaCa2+2+5 5 dNMPsdNMPs 或或 5 5 NMPsNMPsssDNAssDNA or RNA or RNACaCa2+2+双链3端外切活性，伴有单链内切活性Bal31Bal31CaCa2+2+Bal31+可控性地截短可控性地截短DNA分子分子5.T4-5.T4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（T4-PNPT4-PNP） 催化催化ATPATP的的g g- -磷酸基团转移至磷酸基团转移至DNADNA或或RNARNA的的5 5 末末端
60、端5 HO3 HOOH 3 OH 5 T T4 4-PNP-PNPMgMg2+2+ p pppATPppATP（g g- -3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5 核酸杂交探针分子的同位素标记核酸杂交探针分子的同位素标记 磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应6.6.碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIPCIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAPBAP）5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dN5 pppNBAP / CIPBAP / CIPOH 3 5 HO5 HO dN5
61、HO N催化DNA、RNA 5 端除磷反应去除载体或外源片段去除载体或外源片段5端的磷酸基团端的磷酸基团7. T4-DNA7. T4-DNA聚合酶聚合酶 T4-DNA T4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何3-3-OHOH端外切端外切在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5 5 5 5 3333 的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核酸外切的核酸外切酶活性酶活性 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP5335 T4-DNA T4-DNA
62、聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -T T- -GG- -CC- -AA- -OHOH PP- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -PP HOHO- -AA- -CC- -GG- -T T- -CC- -CC- -T T- -C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 5 GG- -CC- -T T- -CC- - OHOH PP- -GG- -GG- -AA- -G 3G 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -PP HOHO - -CC- -CC- -T T- -
63、C 5C 5 切平由核酸内切酶产生的3粘性末端 DNADNA片段片段3 3 末端的同位素标记末端的同位素标记5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 MgMg2+ 2+ 5 5 pppppp dNdN 5 5 ppppp p dA dA（a a- -3232P-dATPP-dATP） 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG
64、- -CC- -T T- -GG- -OHOH HO HO- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 T4-DNA T4-DNA polpolT4-DNA T4-DNA polpol5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T T 333 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 1. II 1. II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性
65、核酸内切酶酶解反应的操作 大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 50 mMmM pH 7.5 pH 7.5MgClMgCl2210 10 mMmMNaClNaCl50 - 150 50 - 150 mMmMDTTDTT1 1 mMmM50 50 mMmM 低盐酶低盐酶100 100 mMmM 中盐酶中盐酶150 150 mMmM 高盐酶高盐酶VolumeVolume20 - 100 20 - 100 m ml lT TT T37 37 1 - 1.5 1 - 1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活
66、性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全水解水解 1 1 m mg pBR322 DNAg pBR322 DNA所需的酶量。所需的酶量。DNADNA切接反应的影响因素切接反应的影响因素 II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 5 GCTACATGCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCA
67、AGCGTA5AAGCGTA5BamHIBamHI SmaISmaI5 5 GCTACATGCTACATGG GATCCCGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT3 3 3 CGATGTACGATGTACCTAGCCTAG GGCCCGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA55 5 GCTACATGCTACATGGATCCCGGATCCC GGGGGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCTAGGG CCCCCCAAGCGTA5AAGCGTA5对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶
68、的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切； 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切i. 0.1i. 0.1倍体积的倍体积的 5 5 M M NaAcNaAc pH 5.4 pH 5.4ii. 2ii. 2倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇iii. iii. 冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥 限制性核酸内切酶的星号活性限制性核酸内切酶的星号活性 高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的甘油、
69、低离子强度、极端pHpH值等，会使值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的Star activityStar activity现象。现象。 EcoEcoR R BamBamHH 2. DNA2. DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50 - 100 50 - 100 mMmM pH 7.5 pH 7.5MgClMgCl2210 10 mMmMATPATP0.5 - 1 0.5 - 1 mMmMDTTDTT5 5 mMmMVolumeVolume10 - 20 10 - 20 m ml l
70、T TT T4 - 15 4 - 15 4 - 16 4 - 16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小时，小时，完全连接完全连接 1 1 m mg g l l-DNA-DNA（HindHind III III片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。连接温度与时间常用下列组合：连接温度与时间常用下列组合：15 -2h; 12 -8h；7 过夜。过夜。重组率及其影响因素重组率及其影响因素1.1.重组率的定义重组率的定义重组率重组率 = = 含有外源含有外源DNADNA的重组分子数的重组分子数 / / 载体
71、分子总数载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%25 - 75% 重重组组率率是是衡衡量量连连接接反反应应效效率率的的重重要要指指标标，较较高高的的重重组组率可以大大简化率可以大大简化DNADNA重组的后续操作。重组的后续操作。2.2.提高重组率的方法提高重组率的方法 提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：2 2 : : 1 1 - - 10 10 : : 1 1 载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5G
72、CTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶T4-DNA T4-DNA ligaseligase 加装同聚尾末端：加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAG
73、GGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow同种内切酶产生的粘性末端的连接同种内切酶产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAA
74、TTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGDNA分分子子重重组组的的方方法法同尾酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTA
75、GT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT平头末端的连接平头末端的连接 增加连接酶用量，通常为黏性末端连接用量的增加连接酶用量，通常为黏性末端连接用量的10倍；倍； 增加增加DNA平头末端的浓度；平头末端的浓度； 加入加入NaCl或或LiCl以及以及PEG； 适当提高连接反应温度；适当提高连接反应温度； ATP浓度。浓度。不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCA
76、G5 GACGTC3 T4-DNA T4-DNA ligaseligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA T4-DNA polpol切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 Klenow补补3 T4切切人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligase5 5KlenowKlenow补平补
77、平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTCCCCCCCTTAA AATTCCCCCCCTTAAGGGATCGGGGGGCCTAGGATCCGGGGGGCTAGGGAATTCCCCCCGATCCCTTAAGGGGGGCTAGGGGATCGGGGGGAATTCCCTAGCCCCCCTTAAG退火退火BamHBamH I IBamHBamH I IEcoREcoR I IBamHBamH I I5突出末端33突出末端突出末端CTGCA 3 G
78、G3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火PstPst I IPstPst I IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGG
79、GGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPstPst I ISphSph I I平头末端平头末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAA
80、AAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT酶切位点的定点更换酶切位点的定点更换BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseKlenowKlenow补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCCAATTGGGATCCCCTAGGG
81、TTAACCCTAGG5 5EcoREcoR I ICCAATTGGGGTTAACCEcoREcoR I linker I linker 引入酶切引入酶切位点位点 在原有酶在原有酶切位点旁边切位点旁边引入另一个引入另一个酶切位点酶切位点 更换酶切更换酶切位点位点C C 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件 限制缺陷型限制缺陷型 重组整合缺陷型重组整合缺陷型 具有较高的转化效率具有较高的转化效率 具有与载体选择
82、标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性1.1.大肠杆菌大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。单，重组子稳定。2.2.枯草杆菌枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单。但遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。简单。但遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。3.3.链霉菌链霉菌 抗生素的主要生产者，分子操作相对简便。但遗传不稳定，抗生素的主要生产者，分子操作相对简便。但遗传不稳定，生
83、长相对缓慢。生长相对缓慢。4.4.酵母菌酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定，但内源性蛋养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定，但内源性蛋白产物种类繁多且含量高。白产物种类繁多且含量高。5.5.昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物特征，外源基因表达量高，繁殖较快，具有真核生物特征，外源基因表达量高，繁殖较快，培养成本低廉，遗传稳定，但培养成本低廉，遗传稳定，但DNADNA重组操作系统欠完善。重组操作系统欠完善。6.6.哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 CH
84、OCHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统，但细胞培养条件苛刻，生长缓慢。的糖基化修饰系统，但细胞培养条件苛刻，生长缓慢。 7.7.植物细胞（拟南芥菜、烟叶植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，培养简单且成本低廉，但遗传操作繁琐。但遗传操作繁琐。实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体 大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：C600C600、W3110W3110、HB101HB101、JM8
85、3JM83、JM101JM101用于接受用于接受l l-DNA-DNA：LE392LE392、ED8654ED8654 酵母菌酵母菌 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO CHO 毕赤酵母毕赤酵母啤酒酵母啤酒酵母2 2 2 2、DNADNA重组克隆的操作过程重组克隆的操作过程C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）B B 重组重组DNADNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）A A DNA DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）切切接接转转增增检检DNA重组克隆技术的工作流程A DNAA DNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）同种内切酶产生的粘性末
86、端的连接同种内切酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换粘性末端的更换人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率重组率B B 重组重组DNADNA分子分子的转化和扩增（转与增）的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化的原理与技术转化的原理与技术1.Ca1.Ca2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 Ca Ca2+2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌
87、者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。细胞此时的状态叫做感受态。 大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备： 100 100 ml ml 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600 = 0.5= 0.5，离心收集菌体；离心收集菌体； 用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体，离心收集菌体；溶液悬浮菌体，离心收集菌体； 用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体；溶液悬浮菌体； 冰浴放置冰浴放置12 - 2412 - 24小时，备用。小时，备用。 大肠
88、杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：的质粒转化： 取取100 100 m ml l 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 50 ngng 载体的重组载体的重组 冰浴放置半小时；冰浴放置半小时； 在在4242保温保温 2 2 分钟（热脉冲）；分钟（热脉冲）； 快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 21 - 2分钟；分钟； DNADNA连接液，混匀；连接液，混匀； 加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养 1 1 小时（扩增）；小时（扩增）； 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。
89、2.2.细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌接纳外源革兰氏阳性细菌接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体转化的方法转移质粒或重因而这类细菌通常采用原生质体转化的方法转移质粒或重组组DNADNA分子。分子。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法原生质体法进行转化。进行转化。 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如细菌需生长在高渗培养基中（如34%34%的蔗糖溶液，并加入甘氨的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对
90、溶菌酶的敏感性）。在制备过程中，菌酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性）。在制备过程中，菌体应始终悬浮在体应始终悬浮在10.3%10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。所有器皿应保持无水无去污剂。 细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备： 取取0.2 - 10.2 - 1mlml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 88 8-10-109 99 9个原生质体），个原生质体），加入加入10 - 20 10 - 20 m ml DNAl DNA重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有PEG1000PEG1000和和C
91、aCa2+2+的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。 细菌原生质体细菌原生质体的转化：的转化：转化后的悬液涂在再生平板上让原生质体再生。3. l3. l噬菌体噬菌体DNADNA的转染的转染 感受态细胞的培养感受态细胞的培养 吸附吸附 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟。分钟。 转染裂解转染裂解 加入加入2020倍体积的新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，3030培养培养2 2小时，直至培养液小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。4.4.电穿孔转化电穿孔转化 将将待待转
92、转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场，在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜产产生生缝缝隙隙，质质粒粒或或DNADNA重重组组分分子子便便可可进入细胞内。进入细胞内。 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。转化率转化率1.1.转化率的定义转化率的定义 每每微克微克载体载体DNADNA在最佳转化条件下进入受体细胞的在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。或每分子数。或每微克微克载体载体DNADNA转化后，受体细胞接
93、纳转化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，即克隆数。的个数，即克隆数。 例例如如，pUC18pUC18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率率为为101088，即即每每微微克克pUC18pUC18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克pUC18pUC18共共有有3.43.4X10X101111个个分分子子，也也就就是是说说，每每34003400个个pUC18pUC18分分子子才才有有一一个个分分子子进进入入受受体体细细胞。胞。 另另一一方方面面，在在实实际际操操作作过过程程中中，转转化化一一微微克克pUC18pUC18共共需需2 2mlml感感受受态态细细胞
94、胞，大大约约含含有有2 2X10X101010个个大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，也也就就是是说说，每每200200个细胞只有个细胞只有一一个细胞能接纳个细胞能接纳pUC18 DNApUC18 DNA。2.2.转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNADNA重组实验规模重组实验规模例如，例如，某一某一DNADNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%20%，转化率为，转化率为101077/ /m mg g载体，载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100100倍，倍，欲获得欲获得10104
95、 44 4个个 重组克隆，需投入多少载体重组克隆，需投入多少载体DNADNA进行重组实验？进行重组实验？ 若重组率为若重组率为100%100%，则转化后产生，则转化后产生101044个重组克隆需要：个重组克隆需要： 10 1044 / 10 / 1077 X 10 X 10 - 2- 2 = 0.1 = 0.1 m mg g 载体载体DNADNA 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.50.1 / 20% = 0.5 m mg g 载体载体DNADNA 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外
96、源DNADNA的投入量即可按的投入量即可按1010 1 1的要求算的要求算出（出（5 5 m mg g）。 3.3.转化率的影响因素转化率的影响因素 载体及载体及DNADNA重组分子方面：重组分子方面： 载体本身的性质载体本身的性质载体的空间构象载体的空间构象插入片段的大小插入片段的大小 受体细胞方面：受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322pBR322转化大转化大肠杆菌肠杆菌JM83JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767ED8767株的株的转化率则较高。转化率则较高。 转化方法方面：转化方法方面： 受体
97、细胞的预处理受体细胞的预处理：影响最大：影响最大供受体的比例供受体的比例：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 0.1 0.1 ml ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ngng DNA DNA 转化方法转化方法：CaCa2+2+诱导转化诱导转化 101066 - 10 - 1077 / / m mg DNAg DNA 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ngng DNA DNA 原生质体转化原生质体转化 101055 - 10 - 1066 / / m mg DNAg DNA l l-DNA-DNA转染转染 101077 - 10 - 1088 / /
98、m mg DNAg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 101066 - 10 - 1099 / / m mg DNAg DNA 转化细胞的扩增转化细胞的扩增1.1.扩增操作扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起。养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起。2.2.扩增操作的目的扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。
99、表达外源基因，便于筛选和鉴定。表达外源基因，便于筛选和鉴定。 C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测载体遗传标记检测克隆克隆DNADNA序列检测序列检测外源基因产物检测外源基因产物检测 区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。组子与非目的重组子。转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子载体遗传标记检测载体遗传标记检测1.1.抗药性筛选法抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr
100、抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理： pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。转化子、重组子与非重组子。将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcrr 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcrr 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcrr 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcss 抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有先
101、将转化液涂布含有ApAp的平板，的平板，再将再将ApAp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有ApAp和和TcTc的平板上。的平板上。 在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平平板上板上不长的转化子即为重组子不长的转化子即为重组子。ApApApAp + + TcTc影印影印挑选挑选2.2.营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种能区分重组子与非重组子。其原理是：
102、载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的便是转化子。便是转化子。 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trptrp+。3.3.显色筛选法显色筛选法 显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其与
103、非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒肠杆菌质粒pUC18pUC18携带的携带的lacZlacZ 基因（蓝色反应）。基因（蓝色反应）。 显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作： pUC18AprlacZoriApAp + X-gal + X-gal重组子（重组子（ApAprr + + lacZlacZ-） 将将外外源源基基因因克克隆隆在在pUC18pUC18的的lacZlacZ 标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组组子子呈呈ApAprr、
104、lacZlacZ-，白白色色菌菌落落；而而非非重重组子则呈组子则呈ApAprr、lacZlacZ+，蓝色菌落。蓝色菌落。 克隆克隆DNADNA序列检测序列检测1.1.限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法 对载体上插入的外源对载体上插入的外源DNADNA片段进行酶切图谱分析，并片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比。可以区分重组子与非重以此与目的基因的已知图谱对比。可以区分重组子与非重组子，还能鉴定目的重组子。组子，还能鉴定目的重组子。全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalIS
105、alI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子：区分重组子与非重组子：用用BamHIBamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA电泳观察酶解产物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子： 2.7 2.7 kb + 4.0 kbkb + 4.0 kb非重组子：非重组子： 2.7 2.7 kbkbpUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI
106、SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriS SS SB BP P4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb经济因素pUC18 pUC18 2.7 kb2.7 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEEPP4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的
107、重组子：区分目的重组子与非目的重组子：用用EcoRIEcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子： 3.0 3.0 kb + 3.7 kbkb + 3.7 kb 或者：或者： 1.0 1.0 kb + 5.7 kbkb + 5.7 kb用用PstIPstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNADNA目的重组子：目的重组子： 3.2 3.2 kb + 3.5 kbkb + 3.5 kb 或者：或者： 0.8 0.8 kb + 5.9 kbkb + 5.9 kbB BB BP PE E1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kbpUC18 pUC18 2.7 kb2.7
108、 kbHindIIIHindIII SphISphI PstIPstI SalISalI BamHIBamHI SmaISmaI KpnIKpnI EcoRIEcoRIApAprrlacZlacZorioriBBBBEE4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.7 kb2.7 kb2.0 kb2.0 kbEE2.2.菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法 根据克隆的目的基因或根据克隆的目的基因或DNADNA片段的同源序列设计并片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，其中，DNA
109、DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。基本理论依据。 菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：影印影印 用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板； 洗涤洗涤杂交杂交感光感光 用用0.40.4NN的的NaOHNaOH溶液浸泡影印薄膜溶液浸泡影印薄膜； 用用SSCSSC溶液浸泡清洗影印薄膜；溶液浸泡清洗影印薄膜； 8080烘干固定影印薄膜；烘干固定影印薄膜； 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温； 用用SSC-SDSSSC-SDS液洗涤杂交薄膜；液洗涤杂交薄膜； 用用XX光胶片覆盖
110、薄膜感光。光胶片覆盖薄膜感光。 杂交探针的制备：杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链单链结构（双链DNADNA可用碱变性）可用碱变性） 足够长度足够长度 内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cDNAcDNA合成合成 同源序列同源序列 mRNA 杂交探针的标记：杂交探针的标记：5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+ p pppATPppATP（g g- -3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3
111、 p 5 T4-PNP介导的末端标记逆转录酶逆转录酶介导的反转录标记介导的反转录标记3 3 AAAAAAAAAAACCAGCTTCCAAAAAAAAAAACCAGCTTCCGGAACTGATTTAGGCTAACTGATTTAGGCT 55mRNAmRNA反转录酶反转录酶MgMg2+2+ dNTPdNTP + + p pp pp pd dATPATP（a a- -3232P-dATPP-dATP）5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT55mRNAmRNA33cDNAcDNA3 3 AAAAAAAAAAACCAGCTTCCAAAAAAAAAAACCAGCTTCCGGAACTGATTT
112、AGGCTAACTGATTTAGGCT5 5 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTCGGGTCGAAAAGGGGCTTGCTTGA ACTCTAAAAAATCCGTCCGA ADNADNA聚合酶聚合酶介导的缺刻前移标记介导的缺刻前移标记5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -AA- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 MgMg2+ 2+ 5 5 dNTPdNTP 5 5 pp
113、ppp p dA dA（a a- -3232P-dATPP-dATP）5 5 GG- -CC- -T T- -C AC A- -GG- -CC- -T T- -GG- -GG AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC- -T T- -CC- -A A 5 5 5 5 GG- -CC- -T T- -CC- -A-GA-G- -CC- -T T- -GG- -GG- -AA- -GG- -T 3T 33 3 CC- -GG- -AA- -GG- -T T- -CC- -GG- -AA- -CC- -CC-
114、 -T T- -CC- -A A 5 5 DNaseDNase I IDNA DNA polpol I IABCABC荧光标记荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTGGCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺荧光胺Biotin Biotin 生物素生物素AvidinAvidin生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂ABCABC显色酶标记显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTGGCTTGAGCAGTAACCTG显色酶显色酶Biotin Biotin 生物素生物素AvidinAvidin 生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂生色底物生色底物颜色产物颜色产物地高辛系统标记地
115、高辛系统标记dUTPdUTP- -连接臂连接臂- -甾醇半抗原甾醇半抗原digoxigenindigoxigenin DIG DIG抗体抗体- -显色酶显色酶交联复合物交联复合物3.DNA3.DNA序列分析法序列分析法 双脱氧末端终止测序法的基本原理：双脱氧末端终止测序法的基本原理： 在在DNADNA聚聚合合反反应应的的进进程程中中，通通过过位位点点特特异异性性终终止止测测定定DNADNA序序列。其关键技术有：列。其关键技术有：DNADNA链聚合反应时的定点随机中断（链聚合反应时的定点随机中断（ddNTPddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 600 b
116、pbp / 601 / 601 bpbp）电脑自动检测、记录、编辑程序电脑自动检测、记录、编辑程序用于用于DNADNA测序的专一性试剂盒（测序的专一性试剂盒（KitKit） 双脱氧末端终止测序法的基本操作：双脱氧末端终止测序法的基本操作： AA CC GG TT ssDNAssDNA ssDNAssDNA ssDNAssDNA ssDNAssDNA PrimerPrimer PrimerPrimer PrimerPrimer PrimerPrimer KlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsdNTP
117、sdNTPsdNTPsdNTPsddATPddATPddCTPddCTPddGTPddGTPddTTPddTTPAA GG TT CC DNADNA聚合反应聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 双脱氧末端终止测序法的基本反应：双脱氧末端终止测序法的基本反应： KlenowOH 35 PTdNTP + ddATP TTTTTOH 35 PAA GG TT CC 5 GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 35 GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA 3外源基因产物检测外源基因产物检测1.1.蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法 淀粉酶目的基因的鉴定：淀粉酶目的
118、基因的鉴定： 目的重组子菌落周围会形成透明圈。目的重组子菌落周围会形成透明圈。 抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因的鉴定： 理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。抗菌素抗性基因的鉴定抗菌素抗性基因的鉴定目的重组子目的重组子 诱导抗性诱导抗性 抽取重组质粒抽取重组质粒再次转化再次转化2.2.蛋白质生物结构鉴定法蛋白质生物结构鉴定法 放射免疫原位杂交放射免疫原位杂交鉴定：鉴定： 影印影印 用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印洗涤洗涤与与II125125标记的标记的IgGIgG保温保温感光感光 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定；轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定； 与与I
119、I125125标记的标记的IgGIgG保温；保温； 洗涤、干燥、感光。洗涤、干燥、感光。 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板；用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板； 含抗体的聚乙烯膜 裂解平板；裂解平板； 3.3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，采用无现成的抗体使用，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。略的筛选。3 3 3 3、目的基因的克隆与基因文库构建目的基因的克隆与基因文库构建C C PCR PCR法法B B cDNAcDNA法法A A 鸟枪法鸟枪法D
120、D 化学合成化学合成法法E E 基因文库的构建基因文库的构建A A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性4. 4. 筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。重组子，进而获得目的基因。
121、1.1.染色体染色体DNADNA的切断的切断 2.2.与载体连接与载体连接 3.3.转化受体细胞转化受体细胞 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 1.8 kbkb的的SalISalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNA用用SalISalI切开，琼脂糖凝胶电泳分切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于离，用刀片切下相当于1.6 - 2.01.6 - 2.0 kbkb大小区域内的凝胶块。大小区域内的凝胶块。2.2.在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb1.1.使用特征性限制
122、性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法3.3.凝胶凝胶DNADNA片段片段回收技术回收技术 4.4.连接、转化扩增、筛选连接、转化扩增、筛选 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构B B cDNAcDNA法法cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略cDNAc
123、DNA法克隆目的基因的基本程序法克隆目的基因的基本程序mRNAmRNA1.c1.cDNADNA第一链的合成第一链的合成 55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆
124、转录酶dNTPsdNTPscDNAcDNA法分离目的基因的基本战略法分离目的基因的基本战略2.c2.cDNADNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOHNaOH 自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNAcDNA 会有几对碱基缺失会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
125、Tpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1DNApolDNApol dNTPsdNTPsRNaesHRNaesH 置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNAcDNA 会有几对碱基缺失会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55
126、55S1S1 AAAAA AAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5555AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3333T4-DNA T4-DNA ligaseligasedCTPdCTPTdTTdT 引物合成法：引物合成法：获得的双链获得的双链cDNAcDNA 能保留完整能保留完整55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pp
127、pppp55G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPs3.3.双链双链c cDNADNA的克隆的克隆 平头
128、末端直接与载体连接。平头末端直接与载体连接。 平头两端分别接同聚物尾。平头两端分别接同聚物尾。 加装人工接头。加装人工接头。 cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序1.1.完备分离程序完备分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，合合成成总总cDNAcDNA，将将之之全全部部克克隆隆，然然后后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mRNAmRNA，由此合成双链由此合成双链cDNAcDNA，然后进行克隆。然后进行克隆。 2.2.特异分离程
129、序特异分离程序 3.3.差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNAmRNA所所对应的对应的cDNAcDNA。 例如：例如：正常的大鼠正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmR
130、NA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDNA提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA产物过柱产物过柱杂交杂交原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆C PCRC PCR法法PCRPCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序 PCRPCR（PolymerasePolymerase Chain Reaction Chain Reaction）法，又称为法，又称为聚合酶聚合酶链反应或链反应
131、或PCRPCR扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序。聚合程序。 使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或基因或DNADNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物。需的双引物。 PCRPCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理5555目的基因目的基因55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性5555555555555555555555555555
132、5555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233 PCR PCR产物末端带一个产物末端带一个A A，克隆时即可以采取克隆时即可以采取TdTTdT末端加同聚末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T T载体载体克隆。克隆。 PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAAPCRPCR扩增产物扩增产物D D 化学合成法化学合成法化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成的单元操作化学合成的单元操作DNADNA化学合成的用途化学合成的用途化
133、学合成法的基本战略化学合成法的基本战略 全基因合成全基因合成前提条件：基因的前提条件：基因的DNADNA序列已知序列已知 小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段。小片段。T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 补钉延长法：补钉延长法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链
134、碱基长的单链DNADNA中片段。中片段。T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合 大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段。片段。T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合化学合成的单元操作化学合成的单元操作 化化学学合合成成DNADNA的的实实质质是是按按照照序序列列要要求求将将脱脱氧氧核核苷苷酸酸单单体体一一个个个个接接上
135、上去去，每每接接一一个个单单体体就就是是一一个个循循环环反反应应，包包括括：基基团保护、激活、缩合、氧化、去保护五大操作单元。团保护、激活、缩合、氧化、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，目前从反应机理上来讲，目前DNADNA化学合成大多采用磷酸亚化学合成大多采用磷酸亚酰胺固相合成法；具体操作过程有液相合成和固相合成两种酰胺固相合成法；具体操作过程有液相合成和固相合成两种形式。形式。OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠CPGCPG连接臂连接臂寡聚核苷酸单链的的化
136、学合成寡聚核苷酸单链的的化学合成磷酸亚酰胺酯核苷酸 DNADNA化学合成的用途化学合成的用途1.1.合成天然基因合成天然基因2.2.设计新型基因设计新型基因 3.3.制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 E E 基因文库的构建基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因文库的基本概念基因文库的基本概念1.1.基因库与基因文库基因库与基因文库基因库（基因库（gene poolgene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）。特定生物体全基因组的集合（天然存在）。 基因文库（基因文库（gen
137、e library or gene bankgene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）基因组文库（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNAcDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 2.2.基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNADNA。用用c
138、DNAcDNA法构建法构建cDNAcDNA文库，材料来自文库，材料来自mRNAmRNA。cDNA文库 基因组文库3.3.基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数NN之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N = N = lnln ( 1 P ) / ( 1 P ) / lnln ( 1 f ) ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f
139、 = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，例如，人的单倍体人的单倍体DNADNA总长为总长为2.9 2.9 x 10x 1099 bpbp，基因文库中基因文库中克隆片段克隆片段的平均大小为的平均大小为15 15 kbkb，则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.90.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要4545万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.99990.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180180万个克隆万个克隆4.4.基因文库的质量标准基因文库的质量标准 重组克隆的总数不宜过大。重组克隆的总数
140、不宜过大。 载体的装载量最好大于基因的长度。载体的装载量最好大于基因的长度。 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域。 克隆片段易于从载体分子上完整卸下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因文库的构建程序基因文库的构建程序1.1.基因组基因组DNADNA的制备的制备 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的的断裂。制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则分子量越大，经切割处理后样品
141、中含有不规则末端的末端的DNADNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 基因组基因组DNADNA的切割一般采用超声波处理和的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：酶切两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNADNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNADNA片段大小均一片段大小均一 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片
142、段随机连为一体！将待连接的将待连接的DNADNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNADNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用TdTTdT酶在酶在DNADNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 2.2.载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组文库文库构建的构建的载体通常选载体通常选装载量较大的装载量较大的l l-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用人类）需使用YACYAC或或BA
143、CBAC载体。载体。ll-DNA-DNA 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于cDNAcDNA文库文库构构建的载体建的载体通常选通常选质粒。质粒。 上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒质粒考斯质粒考斯质粒15 15 kbkb25 25 kbkb45 45 kbkbBACBAC300 300 kbkbYACYAC400 400 kbkb受体一般使用大肠杆菌或酵母菌受体一般使用大肠杆菌或酵母菌3.3.从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 除一些具有特殊功能的蛋白质编码基因可以采用特殊筛选程
144、序直接筛选，一般基因组文库的筛选均采用菌落原位杂交法或免疫原位杂交法。从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（5000-15000-1万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板杂杂交交目的重组克隆目的重组克隆基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体成一个像天然染色体DNADNA上所表现出的信息顺序。这项工作上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作。期制作。
145、 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在亚克隆片段在0.5 - 2.0 0.5 - 2.0 kbkb范围内。范围内。 分别以上述亚克隆分别以上述亚克隆DNADNA片段为探针，杂交同一基因文库，片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入杂交阳性克隆中的插入DNADNA片段必定与起点克隆所含的片段必定与起点克隆所含的DNADNA片片段连锁在一起。段连锁在一起。 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体读，直至线型染色体DNADNA的端点。的端点。 染色体走读法染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）染色体走读法染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁侧序列亚克隆旁侧序列探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交第二轮杂交染色体走读法（染色体走读法（chromosome walkingchromosome walking）走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段
