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1、玉米诱导单倍体玉米诱导单倍体育种技术与应用育种技术与应用陈绍江陈绍江中国农业大学中国农业大学1 内容提纲内容提纲单倍体育种（单倍体育种（DH）背景介绍）背景介绍单倍体育种基本程序单倍体育种基本程序国内单倍体育种研究进展国内单倍体育种研究进展系统化与工程化问题系统化与工程化问题2无融合生殖类型无融合生殖类型一一、无无性性幼幼胚胚起起源源细细胞胞发发生生的的部部位位和和幼幼胚胚的的发发育育方方式式，可可以以进进一一步步把把无无融融合合结结实实或或无无融融合合生生殖殖再再分分为为4种种不不同的类型同的类型:1.无孢子形成（无孢子形成（apospory）2.二倍性孢子形成（二倍性孢子形成（diplos
2、pory）3.不定胚生殖（不定胚生殖（adventitiousembryny）4.单性生殖（单性生殖（parthenogenesis）3 有性生殖与各种无融合生殖方式的比较4单性生殖单性生殖孤孤雌雌生生殖殖：在在正正常常的的有有性性胚胚囊囊中中，卵卵细细胞胞未未经经受受精精而而直直接接发发育育成成胚胚的的现现象象称称为为单单性性生生殖殖或或雌雌核核发发育育（gynogenesisgynogenesis）。由由单性生殖产生的胚或植株，都是单倍体。单性生殖产生的胚或植株，都是单倍体。孤孤雄雄生生殖殖：与与雌雌核核发发育育相相对对应应的的另另一一种种单单性性生生殖殖的的形形式式是是雄雄核核发发育育（
3、androgenesisandrogenesis）。这这是是一一种种更更为为稀稀有有的的遗遗传传现现象象，正正常常有有性性胚胚囊囊中中的的卵卵细细胞胞，因因某某种种原原因因丧丧失失功功能能，未未能能和和精精子子结结合合，进进入入胚胚囊囊的的一一个个精精子子占占据据卵卵细细胞胞的的位位置置，发发育育为为单单倍倍体的胚。体的胚。5产生玉米单倍体的途径产生玉米单倍体的途径1)品种间杂交自发产生的孤雌生殖单倍体品种间杂交自发产生的孤雌生殖单倍体2)不定配子体基因不定配子体基因ig诱导的孤雄生殖单倍体诱导的孤雄生殖单倍体3)化学和物理方法诱导的单倍体化学和物理方法诱导的单倍体4)花药组织和花粉培养产生的
4、单倍体花药组织和花粉培养产生的单倍体5)5)雌穗、子房或胚珠的离体培养雌穗、子房或胚珠的离体培养 6)孤雌生殖诱导系杂交诱导产生单倍体孤雌生殖诱导系杂交诱导产生单倍体一、背景介绍一、背景介绍6基本应用：基本应用：1)育种平台：育种平台：快速获得纯系，缩短育种年限快速获得纯系，缩短育种年限亲本与高代系纯化亲本与高代系纯化种质改良种质改良育种技术育种技术遗传纯合度遗传纯合度% %世代世代传统育种传统育种5050757587.5087.5093.7593.7596.8896.8898.4498.4499.2899.287 7代代DHDH技术技术50501001002 2代代78育种程序比较育种程序比
5、较季季DH育种进度育种进度常规常规1D0S02D1测配，系选测配，系选S13D2鉴定选择鉴定选择S24D3复配，行比复配，行比S3测配，系株选测配，系株选5D4预试预试S4鉴定，系株选鉴定，系株选6D5区试区试S5复配鉴定，系株选复配鉴定，系株选7D6区试区试S6复配行比复配行比8D7生试生试S7预试预试92)遗传研究：遗传研究：突变鉴定，淘汰有害的隐性基因突变鉴定，淘汰有害的隐性基因基因定位（基因定位（DH群体）群体）生殖遗传生殖遗传-双胚苗等双胚苗等101112特点特点多多-易于规模化易于规模化快快-选系速度快选系速度快好好-纯度高纯度高省省-133）单倍体育种应用状况）单倍体育种应用状况
6、国内：国内：2013250万个单倍体以上万个单倍体以上规模化单倍体育种规模化单倍体育种14国外应用国外应用先锋、孟山都、先正达、利马格兰、先锋、孟山都、先正达、利马格兰、KWS等均有大规模应用等均有大规模应用,DH系占新选系可以达到系占新选系可以达到90%，已经替代传统选系成为主要的选系，已经替代传统选系成为主要的选系方法方法现代育种技术的新体系三大核心技术现代育种技术的新体系三大核心技术 单倍体育种单倍体育种+分子育种分子育种+转基因转基因 15国外大规模国外大规模单倍体育种单倍体育种16二、单倍体育种基本程序二、单倍体育种基本程序17基础材料基础材料2n=202n=20单倍体单倍体 n=1
7、0n=10单倍体的鉴定单倍体的鉴定加倍加倍DHDH系系2n=202n=20单单倍倍体体育育种种程程序序单倍体产生单倍体产生单倍体加倍单倍体加倍DH系评价与应用系评价与应用18（一）、单倍体诱导（一）、单倍体诱导诱导母本材料诱导母本材料诱导系与杂交种诱导系与杂交种诱导机理诱导机理19 基础材料基础材料 孤雌生殖诱导系孤雌生殖诱导系 无色糊粉层无色糊粉层 紫色糊粉层紫色糊粉层 无色胚芽无色胚芽 紫色胚芽紫色胚芽 绿色植株绿色植株 正常杂交籽粒正常杂交籽粒 准单倍体籽粒准单倍体籽粒 紫色糊粉层紫色糊粉层 紫色糊粉层紫色糊粉层 紫色胚芽紫色胚芽 无色胚芽无色胚芽 假单倍体假单倍体 单倍体单倍体 紫色植
8、株紫色植株 绿色植株绿色植株 加倍加倍 DH系系201、基础材料选择、基础材料选择群体遗传构成：群体遗传构成：杂合群体：单交种，群体等杂合群体：单交种，群体等分离群体：分离群体：F2, F3,F4等等近纯合群体：自交系等近纯合群体：自交系等种质类型：种质类型：硬粒硬粒80以上以上马齿马齿90以上以上212、玉米孤雌生殖诱导系、玉米孤雌生殖诱导系1)Coe(1959)Stock6是是第一个孤雌生殖诱导系第一个孤雌生殖诱导系, ,诱导率诱导率1%-2%1%-2%。 2)Lashermes(1988)孤雌生殖诱导系孤雌生殖诱导系WS14,诱导率诱导率3.5%3.5% 。3)Tyrnov等等(1994
9、)(1994)孤雌生殖诱导系孤雌生殖诱导系ZMS,单倍体诱导频率达到单倍体诱导频率达到2%2%左右。左右。4 4）张铭堂、德国所用诱导系）张铭堂、德国所用诱导系RWS,UH400RWS,UH400等诱导率等诱导率8 8左右左右5 5）吉林农科院吉诱）吉林农科院吉诱3 3号号6 6）其它研究单位也开展了研究）其它研究单位也开展了研究7 7）中中国国农农业业大大学学在在BH0BH0Stock6Stock6后后代代选选育育出出高高油油型型孤孤雌雌生生殖殖单单倍倍体诱导系农大高诱体诱导系农大高诱1 1号等。最近新的诱导系农大高诱号等。最近新的诱导系农大高诱2-52-5号，号， 诱导率诱导率8-18%8
10、-18%，诱导杂交种农大杂诱，诱导杂交种农大杂诱1 1号，号，2 2号诱导率在号诱导率在5-10%5-10%。22诱导系诱导系InducerRate(%)Stock62.3Coe,1959ZMS0.6 63.4Tyrnov&Zavalishina,1984WS143.05.0Lashermes&Beckert,19885329C 3.0518.57Sarkar,1994KEMS6.3Shatskaya,1994MHI5.56.7Chalyk,1994RWS8.6513.39Geiger&Rber,2005UH400815Melchinger,2003CAUHOI1.99.2Liu,2000；C
11、hen，200323农大高诱农大高诱2-5号与杂交种号与杂交种新系新系25号基本稳定号基本稳定 诱导率在诱导率在5-18%242520112011年年7 7月月 北京上庄北京上庄2620112011年年1010月月至至20122012年年2 2月月2828日日 海南南滨海南南滨272012012 2年年1212月月1515日日 海南南滨海南南滨282012013 3年年0202月月2525日日 海南南滨海南南滨292012013 3年年0202月月2525日日 海南南滨海南南滨302012013 3年年0202月月2020日日 海南南滨海南南滨31农大高诱农大高诱5 5号号(C(CAUHI5A
12、UHI5) )果穗与植株果穗与植株生产上应用的诱导系类型生产上应用的诱导系类型32关联群体自交系与诱导系关联群体自交系与诱导系CAUHI5杂交后表现杂交后表现33籽粒标记籽粒标记R-nj遗传遗传-花粉直感花粉直感34 果穗中的单倍体果穗中的单倍体35单倍体产生的生物学机理：单倍体产生的生物学机理：36雄配子体发育雄配子体发育37双受精示意图双受精示意图(引自引自Frede ric Berger等，等，2008)38（二）、单倍体鉴定（二）、单倍体鉴定 田间鉴定田间鉴定（早期）（早期） 细胞遗传学方法细胞遗传学方法 形态学方法形态学方法 放射性方法放射性方法 除草剂除草剂 方法方法 分子标记法分
13、子标记法 遗传标记法遗传标记法 油份鉴定法油份鉴定法39孤雌单倍体的标记孤雌单倍体的标记R-njR-nj40根色鉴别41植株颜色鉴别植株颜色鉴别42（三）、单倍体加倍（三）、单倍体加倍自然加倍自然加倍与小麦、水稻等不同，玉米单倍体自然加倍率一般低于与小麦、水稻等不同，玉米单倍体自然加倍率一般低于10，有些材料不发生自然加倍（有些材料不发生自然加倍（Zabirova,1993;Shatskaya,1994）气体气体N2O加倍加倍（A.Kato，2002）组培加倍组培加倍药剂化学加倍药剂化学加倍 除草剂除草剂(APM,Pronamide,Oryzalin,Trifluralin等等) 秋水仙素秋水
14、仙素配方的优化配方的优化加倍环节的优化（加倍环节的优化（时间、温度等）时间、温度等）43 药剂加倍药剂加倍除草剂：除草剂：APM(amiprophosmethy1)、拿草特、拿草特(pronamide）、安磺灵）、安磺灵(oryzalin)、氟乐灵、氟乐灵(trifluralin)等；等；秋水仙素秋水仙素多种因素影响（药剂浓度、多种因素影响（药剂浓度、处理时间、处理温度等）。处理时间、处理温度等）。44田间加倍田间加倍45（四）、（四）、DH系系464748三、中国农业大学单倍体研究三、中国农业大学单倍体研究1995开始开始-诱导技术诱导技术鉴别与加倍鉴别与加倍DH系高效应用系高效应用单单倍倍
15、体体育育种种技技术术体体系系生物学机理生物学机理应应用用研研究究理理论论研研究究遗传学学机理遗传学学机理花粉直感与竞争花粉直感与竞争系系统统与与工工程程化化技技术术优优化化49理论研究理论研究生物学机理：染色体排除生物学机理：染色体排除-B染色体诱导系染色体诱导系遗传机理：遗传方式、诱导基因精细定位遗传机理：遗传方式、诱导基因精细定位花粉直感：油份直感效应和当代杂种优势花粉直感：油份直感效应和当代杂种优势50诱导生物学机理：染色体干扰与排除诱导生物学机理：染色体干扰与排除特殊籽粒类型的发现特殊籽粒类型的发现51特殊籽粒的频率及倍性鉴定特殊籽粒的频率及倍性鉴定籽粒数籽粒数频频率率(%)单单倍倍体
16、数体数鉴鉴定效率定效率(%)单单倍体倍体频频率率(%)可能可能单单倍体倍体3131.2527587.861.10特殊籽粒特殊籽粒3551.4227778.031.11杂杂交籽粒交籽粒2435297.410100.000.0052SSR分子标记检测分子标记检测53DGAT1-2 测序结果测序结果54玉米小孢子第二次分裂中玉米小孢子第二次分裂中B染色体的不分离现象染色体的不分离现象B染色体传递染色体传递55玉米染色体荧光免疫染色结果（金危危教授提供）玉米染色体荧光免疫染色结果（金危危教授提供）黄绿色信号为CENH3抗体，箭头所指为玉米B染色体（信号相对较弱）如果有如果有B染色体说明不是单受精，诱导
17、系染色体说明不是单受精，诱导系A染色体消失为排除所致染色体消失为排除所致56单倍体诱导机理模式图单倍体诱导机理模式图57A1: B73UH400; A2: UH400; B 不同子粒类型诱导性状生殖遗传机制诱导性状生殖遗传机制58诱导性状与败育性状同为雄配子表达性状诱导性状与败育性状同为雄配子表达性状A: 诱导系诱导系常规系常规系B: 诱导系自交诱导系自交C: 常规系常规系诱导系诱导系59单倍体诱导基因作用模型单倍体诱导基因作用模型? ?（A A）诱导基因在雄配）诱导基因在雄配子中表达，并可能受到子中表达，并可能受到表观修饰（用灰色表示）表观修饰（用灰色表示）。其产物对于花粉的竞。其产物对于花
18、粉的竞争性会有影响争性会有影响? ?（B B）父本染色体的高）父本染色体的高度修饰可能会造成子粒度修饰可能会造成子粒中染色体消除或败育的中染色体消除或败育的发生。对于其余的轻度发生。对于其余的轻度修饰的花粉将不会影响修饰的花粉将不会影响双受精过程，并最终形双受精过程，并最终形成正常子粒。成正常子粒。60诱导基因分子标记可以用于辅助选育诱导系诱导基因分子标记可以用于辅助选育诱导系在第在第1和第和第9染色体上发现诱导基因染色体上发现诱导基因611号染色体诱导基因精细定号染色体诱导基因精细定位位 单倍体油份单倍体油份玉米玉米85%左右的油份存在于玉米胚之中，而油份具有一定的花粉直感效应，如左右的油份
19、存在于玉米胚之中，而油份具有一定的花粉直感效应，如以高油型诱导系进行诱导，双受精的杂交籽粒具有较高油份，而孤雌生殖单倍以高油型诱导系进行诱导，双受精的杂交籽粒具有较高油份，而孤雌生殖单倍体则油份较低。体则油份较低。72HO115NM B7373油份鉴定值的确定油份鉴定值的确定单倍体平均油份单倍体平均油份杂交后平均油份杂交后平均油份鉴定效率鉴定效率油份鉴定值油份鉴定值4.00% 4.00% 6.00%6.00%0.60 0.60 5.14% 5.14% 4.00% 4.00% 6.00% 6.00% 0.70 0.70 5.00% 5.00% 4.00% 4.00% 6.00% 6.00% 0.
20、80 0.80 4.85% 4.85% 4.00% 4.00% 6.00% 6.00% 0.90 0.90 4.64%4.64%74人工测油人工测油-速度慢速度慢1000粒左右粒左右/天天天天平平75油份自动核磁共振测定仪鉴定单倍体油份自动核磁共振测定仪鉴定单倍体 以农大高油高诱一号为父本与普通玉米杂交，杂交以农大高油高诱一号为父本与普通玉米杂交，杂交当代籽粒含油量显著提高，花粉直感的增油率在当代籽粒含油量显著提高，花粉直感的增油率在30以以上。利用此法进行单倍体鉴定，准确率可以超过上。利用此法进行单倍体鉴定，准确率可以超过90 ，速度可以达到每天速度可以达到每天2万粒万粒. 也可以用于其他作
21、物的选择也可以用于其他作物的选择与鉴别。与鉴别。76YFP荧光基因诱导荧光基因诱导系系根尖与籽粒中根尖与籽粒中YFP标记的表现情况标记的表现情况红色箭头所指为携带有红色箭头所指为携带有YFP基因的子粒，其余不含基因的子粒，其余不含YFP77 YFP荧光标记鉴定单倍体荧光标记鉴定单倍体 在在OLYMPUS DP72体式荧光显微镜下，通过测定杂交幼体式荧光显微镜下，通过测定杂交幼 胚的荧光强度鉴别其中的单倍体。胚的荧光强度鉴别其中的单倍体。杂合体杂合体单倍体单倍体783、单倍体加倍技术、单倍体加倍技术化学加倍技术化学加倍技术-芽苗化学加倍芽苗化学加倍自然加倍技术自然加倍技术-自然加倍基地自然加倍基
22、地79海南单倍体育种海南单倍体育种80化学加倍化学加倍（加倍可以达到散粉率（加倍可以达到散粉率30-80%）81单倍体单倍体 自然加倍自然加倍秋水仙素秋水仙素单倍单倍体数体数散粉散粉株数株数散粉散粉率率% %变异范围变异范围单倍单倍体数体数散粉散粉株数株数散粉散粉率率变异范围变异范围农大农大1081081051051 10.95 0.95 0.00-0.00-1.901.906666262639.39 39.39 23.53-23.53-56.2556.25郑单郑单9589581051054 43.81 3.81 1.92-1.92-5.665.668989333337.08 37.08 13
23、.21-13.21-72.2272.22均值均值- - -2.38 2.38 - - - -38.24- -变幅变幅- - -2.86 2.86 - - - -2.31 2.31 - -不同基础材料单倍体处理与对照的散粉情况比较（不同基础材料单倍体处理与对照的散粉情况比较（2009）加倍效果加倍效果处理后单倍体的平均散粉率高于对照近处理后单倍体的平均散粉率高于对照近10倍，一般倍，一般5-6倍倍82大规模自然加倍基地（西北）大规模自然加倍基地（西北）83自然加倍自然加倍自然加倍重点：自然加倍重点：条件好：保证单倍体正常生长发育条件好：保证单倍体正常生长发育环境稳：可控性强环境稳：可控性强-设施
24、加倍设施加倍-温室、组培温室、组培基地加倍基地加倍-西北、西南、海南西北、西南、海南 844、单倍体与、单倍体与DH应用和管理应用和管理单倍体管理单倍体管理DH系管理系管理-规模化规模化DH系管理方法系管理方法遗传研究遗传研究抗青枯病抗青枯病DH群体群体1145Y331（2001-03年）年）选择方法研究选择方法研究亲本纯化与种子生产亲本纯化与种子生产-8586资源的优化配置资源的优化配置875、系统化与工程化育种、系统化与工程化育种单倍体技术发展阶段单倍体技术发展阶段：点：关键环节突破点：关键环节突破-重点技术重点技术线：操作程序规范线：操作程序规范-流程化管理流程化管理面：技术体系形成面：
25、技术体系形成-选系主导技术选系主导技术体：系统工程构建体：系统工程构建-包括与其他技术结合包括与其他技术结合 借鉴航天科技创新经验借鉴航天科技创新经验88系统工程化内容系统工程化内容系统工程理论系统工程理论 （钱学森系统科学理论与创新思想钱学森系统科学理论与创新思想） 发展软件和硬件发展软件和硬件系统构建系统构建-专业化、自动化、信息化专业化、自动化、信息化系统优化系统优化-8990系统优化系统优化 与转基因、分子育种结合乃至融合与转基因、分子育种结合乃至融合 全全DH化：现有亲本纯化应用于种子生产化：现有亲本纯化应用于种子生产* 全单倍体育种（全单倍体育种（TH）-Total Haploid
26、 Breeding AH,BH,CH,DH EH（早期加倍单倍体早期加倍单倍体/Early doubled haploid)*- 91单倍体胚诱导产生的单倍体胚性愈伤组织单倍体幼胚组织培养单倍体幼胚组织培养 有可能作为纯化转基因后代或转基因受体材料？92不同材料不同材料EHEH昌昌7-2EH7-2EH87-1EH垦自垦自167-7EH167-7EH郑郑58EH58EHEHEH再诱导再诱导87-1EH87-1EH郑单郑单958F958F1 1EHEH孤孤雌雌生生殖殖二二倍倍体体？93E EH H群体群体94中国农业大学通过项目发放诱导系，技术培训等途径使全国主要育种企事业单中国农业大学通过项目发
27、放诱导系，技术培训等途径使全国主要育种企事业单中国农业大学通过项目发放诱导系，技术培训等途径使全国主要育种企事业单中国农业大学通过项目发放诱导系，技术培训等途径使全国主要育种企事业单位掌握了单倍体育种技术位掌握了单倍体育种技术位掌握了单倍体育种技术位掌握了单倍体育种技术中国农大技术特点和应用：中国农大技术特点和应用：中国农大技术特点和应用：中国农大技术特点和应用：独立选育的高油型单倍体诱导系及系列普通诱导系和杂交种独立选育的高油型单倍体诱导系及系列普通诱导系和杂交种独立选育的高油型单倍体诱导系及系列普通诱导系和杂交种独立选育的高油型单倍体诱导系及系列普通诱导系和杂交种提出油分花粉直感鉴别单倍体
28、技术并实现自动化鉴别提出油分花粉直感鉴别单倍体技术并实现自动化鉴别提出油分花粉直感鉴别单倍体技术并实现自动化鉴别提出油分花粉直感鉴别单倍体技术并实现自动化鉴别提出以单倍体为基础的工程化育种提出以单倍体为基础的工程化育种提出以单倍体为基础的工程化育种提出以单倍体为基础的工程化育种单倍体产生的生物学和遗传机理单倍体产生的生物学和遗传机理单倍体产生的生物学和遗传机理单倍体产生的生物学和遗传机理发现花粉竞争等现象发现花粉竞争等现象发现花粉竞争等现象发现花粉竞争等现象隐性黄苗诱导率遗传测验种隐性黄苗诱导率遗传测验种隐性黄苗诱导率遗传测验种隐性黄苗诱导率遗传测验种建立诱导系分子育种方法建立诱导系分子育种方法建立诱导系分子育种方法建立诱导系分子育种方法实现自然加倍与化学加倍规模化实现自然加倍与化学加倍规模化实现自然加倍与化学加倍规模化实现自然加倍与化学加倍规模化近近近近5050个单位以中国农大技术为基础年产单倍体近个单位以中国农大技术为基础年产单倍体近个单位以中国农大技术为基础年产单倍体近个单位以中国农大技术为基础年产单倍体近200200万个万个万个万个出版书籍出版书籍出版书籍出版书籍95单倍体技术方兴未艾单倍体技术方兴未艾96现场技术咨询与培训现场技术咨询与培训979899
