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1、NCBI常用功能与引物设计2010级博士：谢鹏 导师：邹晓庭为何要接触为何要接触NCBI？如何使用如何使用NCBI？如何设计引物？如何设计引物？Your site hereNCBI简介NCBI：National Center for Biotechnology Information 美国国家信息技术中心美国国家信息技术中心 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）1992年年10月，月，NCBI承担起对承担起对GenBank DNA序列数据库的责任。序列数据库的责任。NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国
2、际核酸序列数据库（EMBL和和DDBJ）交换数据建立起数据库）交换数据建立起数据库. Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的序列的注释过的收集。注释过的收集。 GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每以指数形式增长，核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍。最近，个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自拥有来自47,000个物种的个物种的30亿个亿个碱基。碱基。 Your site hereSub titleYour site hereNCBI常用功能查找核酸/氨基酸序列序列相似性分析引物验证Your site he
3、re一、查找核酸、氨基酸序列一、查找核酸、氨基酸序列1.以鸡以鸡FAT/CD36为例，为例，search：2.调整右侧检索目录，调整右侧检索目录，tree-list：Your site here3.浏览信息，下载序列，并以浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存格式保存点击点击Genebank:Your site here氨基酸序列：氨基酸序列：Genebank核酸序列：核酸序列： FASTA格式的核酸序列：格式的核酸序列： Your site here二、序列相似性分析二、序列相似性分析序列相似性分析：序列相似性分析： 就是将待研究序列与就是将待研究序列与DNA或蛋白质序
4、列库进行比较，用于确定该或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等等序列同源性分析：序列同源性分析： 是是将将待待研研究究序序列列加加入入到到一一组组与与之之同同源源，但但来来自自不不同同物物种种的的序序列列中中进进行行多多序序列列同同时时比比较较，以以确确定定该该序序列列与与其其它它序序列列间间的的同同源源性性大大小小。这这是是理理论论分分析析方方法法中中最最
5、关关键键的的一一步步。完完成成这这一一工工作作必必须须使使用用多多序序列列比比较算法。常用的程序包有较算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等等Your site hereBlast简介简介 BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。程序名程序名查询序列查询序列数据库数据库搜索方法搜索方法Blastn核酸核酸核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的
6、序列蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列Blastx核酸核酸蛋白质蛋白质核酸序列核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质蛋白质核酸核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译框翻译后的蛋白质序列逐一比对。后的蛋白质序列逐一比对。TBlastx核酸核酸核酸核酸核酸序列核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一框翻译成的蛋白质序列逐一进行比对。进行比对。主要的Blast程序：Your
7、 site hereBlast 序列相似性分析序列相似性分析1.修改测序结果，剔除克隆载体序列修改测序结果，剔除克隆载体序列在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分以鸽子的I-FABP片段为例：GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGAT TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATC
8、CCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGC
9、GGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT 上游引物：5-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3下游引物： 5- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAYour site here2
10、.进入进入NCBI3.点击点击Basic BLAST中的中的nucleotide blast选项选项Your site hereYour site hereYour site here4.寻找相近物种，比较相似性寻找相近物种，比较相似性Your site here点击点击score，获得相似性比较具体信息，获得相似性比较具体信息NCBI官方说明：官方说明：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.htmlYour site here引物设计与简并引物设计与简并PCR RTPCR原理与技术简介 引物设计过程 简并PCR技术 后续研究
11、Your site hereRTPCR原理与技术简介原理与技术简介DNA mRNA 蛋白质酶活力Western blotNorthern blot半定量RTPCR定量RTPCRYour site hereRTPCR原理与技术简介原理与技术简介12Your site here常规引物设计常规引物设计引物设计原则Primer5和Oligo6进行引物分析Your site here引物设计原则1.引引物物的的长长度度一一般般为为15-30bp，常常用用的的是是18-27bp，但但不不能能大大于于38，因因为为过过长会导致其延伸温度大于长会导致其延伸温度大于74，即，即Taq 酶的最适温度。酶的最适温
12、度。2.引引物物3端端的的序序列列要要比比5端端重重要要。引引物物3端端的的碱碱基基一一般般不不用用A，因因为为A在在错错误误引引发发位位点点的的引引发发效效率率相相对对比比较较高高。另另外外引引物物间间3端端的的互互补补、二二聚聚体体或或发发夹夹结结构构也也可能导致可能导致PCR反应失败。反应失败。5端序列对端序列对PCR 影响不大。影响不大。3.引物的引物的GC含量一般为含量一般为40-60%，以，以45-55为宜，过高或过低都不利于引为宜，过高或过低都不利于引发反应。发反应。PCR引物的引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。比。
13、4.G值值(自由能自由能)反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最值最好呈正弦曲线形状，即好呈正弦曲线形状，即5端和中间端和中间G值较高，而值较高，而3端端G值相对较低，且不要值相对较低，且不要超过超过9（G值为负值，这里取绝对值）。值为负值，这里取绝对值）。 引物二聚体及发夹结构的能量一般引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带。，否则容易产生引物二聚体带。 Your site here以鸡的以鸡的I-FABP为例，设计常规引物：为例，设计常规引物：1.输入I-FABP的已知序列，点击prim
14、er:Your site here2.点击点击search进行引物条件设置：进行引物条件设置：3.Search criteria 筛选筛选Your site here4.选择最优引物选择最优引物5.手动修改，手动修改，调整引物调整引物Your site hereBlast 引物验证引物验证最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试1.登陆NCBIBlastPrimer-BLAST: http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Your site here以文献报道鸡的以文献报道鸡的MUC2的引物为例：的引物为例：Your site hereYour site her
15、eYour site here简并引物设计More of an art than a science降低简并度（500以下）例如：上游 D Y N L F D L L 下游 P V N G N G K Q 1.根据密码子表建立引物系列http:/www.kazusa.or.jp/codon/2.谨慎使用次黄嘌呤Symbol DefinitionB not AD not CH not GI InosineK G or T/UM A or CN A,C,G or T/UR A or GS C or GV not T/UW A or TY C or T/U简并引物：在常规引物的某些位点上以简并核苷酸
16、代替。Your site here简并引物设计过程简并引物设计过程l传统方法（适用于保守度高序列）应用BLAST进行同源序列搜索应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸）简并引物设计原则Primer5和Oligo6进行引物分析lCODEHOP法（适用于保守度低序列）Your site here应用BLAST进行同源序列搜索a.剪切然后粘贴DNA或蛋白序列；b.使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行以其开始处的一个大于号（）与序列数据区分开。说明行以下是序列数据。c.简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号。 http:/www.ncbi.n
17、lm.nih.gov/Your site hereYour site hereDNAMAN分析序列保守区分析序列保守区对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得到保守区序列Your site hereCODEHOP原理原理方法方法：http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.htmlYour site here 简并PCR技术RNAcDNAcDNA反转录反转录合并产物合并产物分装产物分装产物-actin样样 品品PCRYour site here 简并PCR技术v使用标准的反应体系并适当增大引物浓度（1-3 M）v退火温度是最关键点：a.采用Touchdown方法优化条件b.采用梯度PCR优化条件c.使用热启动PCRl循环数增加至50 cyclesl电泳检测至关重要l不用二次扩增重复结果Your site herev应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因表达水平的影响v使用RACE法进行基因cDNA全长扩增v进行蛋白质结构预测v原核表达v系统进化树v为RNAi法研究基因功能提供基础 后续研究Your site hereThank You!
