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1、实验一实验一分光光度技术及蛋白含量分光光度技术及蛋白含量测定测定n n理论理论理论理论掌握分光光度技术的基本原理掌握分光光度技术的基本原理掌握分光光度技术的基本原理掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造n n实验实验实验实验利用分光光度计进行蛋白质定量测定利用分光光度计进行蛋白质定量测定利用分光光度计进行蛋白质定量测定利用分光光度计进行蛋白质定量测定 1.1.1.1.双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 2.2.2.2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮
2、兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.3.3.3.紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量 本次实验内容本次实验内容分光光度技术分光光度技术（Spectrophotography） 一、基本定义一、基本定义利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。应用：定性、定量优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速二、工作原理二、工作原理 1.1.物质对光线有选择性吸收作用。物质对光线有选择性吸收作用。 2.2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。每种物质都具有其特征性的
3、吸收光谱。 3.3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。的浓度成正比。 分光光度法所使用的光谱范围： 200nm - 10m200-400nm 400-760nm 760-10 000nm紫外光区 可见光区 红外光区 如何定性？如何定性？ 利用吸收光谱鉴定化合物利用吸收光谱鉴定化合物利用吸收光谱鉴定化合物利用吸收光谱鉴定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线利用分光光度计绘制吸收光谱曲线利用分光光度计绘制吸收光谱曲线利用分光光度计绘制吸收光谱曲线 用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶
4、液用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度纵坐标绘制吸光度纵坐标绘制吸光度纵坐标绘制吸光度- - - -波长曲线，即吸收光谱曲线。波长曲线，即吸收光谱曲线。波长曲线，即吸收光谱曲线。波长曲线，即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性的吸收光谱每种物质有其特征性的吸收光谱每种物质有其特征性的吸收光谱每种物质有其特征性的吸收光谱 1. 1.
5、 朗伯（朗伯（朗伯（朗伯（LambertLambertLambertLambert）定律）定律）定律）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的介质的厚度厚度增加呈指数减少。增加呈指数减少。 I/II/I0 0=e=e-K1-K1l l I I I I0 0 : :入射光强度；入射光强度； I I I I : :透射光强度；透射光强度；l l ：介质厚度：介质厚度 如何定量？如何定量？ Lambert - Beer定律定律2 2比尔（比尔（BeerBeer）定律）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收一束单色光通过一光吸
6、收介质时，其光强度随吸收光介质的光介质的浓度浓度的增加呈指数减少。的增加呈指数减少。 I/II/I0 0=e=e-K2-K2C C I I I I0 0 : :入射光强度；入射光强度； I I I I : :透射光强度；透射光强度；C C ：介质浓度：介质浓度3.Lambert-beerLambert-beers laws law的合并的合并 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。I/II/II/II/I0 0=e-=e-cl cl A=-lg I/ I
7、 A=-lg I/ I 0= = cl cl A A：吸光度；：吸光度； C C：溶液浓度；：溶液浓度； L L：液层厚度：液层厚度 ：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为 mol/L,mol/L,光程为光程为1cm1cm时的消光系数时的消光系数4.4.计算计算（1）标准管法标准管法（标准比较法）实际测定过程中，用一实际测定过程中，用一已知浓度已知浓度的测定物按测的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准=标准C标准L标准 A样品=样品C样品L样品 A A：吸光度；：吸光度；
8、 ：摩尔吸光度；：摩尔吸光度；C C：溶液浓度；：溶液浓度；L L：液层厚度：液层厚度 因标准液和样品液中溶质为同一物质，因标准液和样品液中溶质为同一物质， 样品样品= = 标准标准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L L样品样品=L=L标准标准 故上二式可写成：故上二式可写成： A A标准标准/A/A样品样品= = 标准标准C C标准标准/ / 样品样品C C样品样品 C C C C样品样品样品样品=A=A=A=A样品样品样品样品/A/A/A/A标准标准标准标准 C C C C标准标准标准标准（2 2）标准曲线法）标准曲线法配制配制一系列已知不同浓度一系
9、列已知不同浓度的测定物溶液，按的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。准曲线上读得测定物的浓度。标准曲线使用注意事项标准曲线使用注意事项标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。吸光度在吸光度在0.05-1.00.05-1.0范围内。范围内。所作标准曲线仅供所作标准曲线仅供短期短期使用。使用。标准曲
10、线制作与测定管测定应在标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器同一台仪器上进上进行，避免误差产生。行，避免误差产生。5 5应用中注意的问题应用中注意的问题 Lambert-beerLambert-beer s laws law的偏离：该定律只适应于一定浓的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A A宜在宜在0.050.051.01.0之间之间，超过该范围，超过该范围偏离偏离计算结果与实际浓度不相符计算结果与实际浓度不相符 选择波长：选择波长：最大吸收波长最大吸收波长，因为，因为a.a.灵敏；灵敏；b.b.避免杂质干避免杂质干 扰扰 参比溶液
11、（空白管）参比溶液（空白管）：消除背景效应，：消除背景效应，应包含除待测溶应包含除待测溶质以外所有的成分。质以外所有的成分。 空白管：空白管：测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个定的光吸收，故设置一个空白管空白管，即其中除了待测溶质以，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零调零，既消除，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。所测值
12、即为待测物造成的光吸收。分光光度计分光光度计一基本部件一基本部件一基本部件一基本部件1 1光源光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯 ( (或氘灯或氘灯) )。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨 灯；在紫外光区，多使用氢灯。灯；在紫外光区，多使用氢灯。 2 2单色器单色器 棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。 3 3吸收池（比色皿、比色池）吸收池（比色皿、比色池） 选用合适的比色皿（可见选用合适的比色皿（可见 光光玻璃；紫外光玻璃；紫外光 石英；规格、
13、新旧程度一致）石英；规格、新旧程度一致） 4 4检测器检测器 5 5测量装置测量装置 二二. . 分光光度计使用步骤（示教）分光光度计使用步骤（示教）三三. . 使用时注意事项使用时注意事项 1. 1. 1. 1. 波长选择。波长选择。波长选择。波长选择。 2. 2. 2. 2. 机器预热。机器预热。机器预热。机器预热。 3. 3. 3. 3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光 电管疲劳。电管疲劳。电管疲劳。电管疲劳。 4. 4. 4. 4.
14、不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。 5. 5. 5. 5. 比色皿使用注意事项比色皿使用注意事项比色皿使用注意事项比色皿使用注意事项 1. 1.由于紫外光不能透过玻璃比色皿，由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石紫外光区测量时要用石英比色皿。英比色皿。 2.2.同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。 3.3.比色皿比色皿2 2光面与光面与2 2毛面，光滑表面对准光路，不能有任何污毛面，光滑表面
15、对准光路，不能有任何污损，损，否则会引起光吸收的增加。否则会引起光吸收的增加。 4.4.比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液不能太少不能太少，也，也不能太多不能太多，一般所盛液体，一般所盛液体约占全部容积的约占全部容积的2/32/3。 5.5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。 6.6.每次使用后每次使用后, ,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿比色皿3 34 4次。次。本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。色，酒精浸泡后清洗。蛋白质定量分析实验蛋白质定量分析实验
16、 实验一实验一 双缩脲法双缩脲法测定蛋白质含量测定蛋白质含量实验三考马斯亮兰结合法考马斯亮兰结合法测定蛋白质含测定蛋白质含量量实验四实验四 紫外分光光度法紫外分光光度法测定蛋白质含量测定蛋白质含量 实验一实验一 双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量【基本原理基本原理】 蛋白质分子中含有许多蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似肽键，与双缩脲结构类似，在碱在碱性溶液中能与铜离子结合成性溶液中能与铜离子结合成紫色紫色的化合物的化合物（称双缩脲反应）（称双缩脲反应）。 在一定浓度范围，在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可故可用比色法测定蛋白质的
17、含量。用比色法测定蛋白质的含量。 含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 双缩脲法的灵敏度为双缩脲法的灵敏度为1-20mg1-20mg。CO肽键结构肽键结构双缩脲结构双缩脲结构NH2CNHCNHOONH2CNHCR1HR2HCO试试 剂剂 （mlml） 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液0.10.10.30.30.50.50.70.70.90.9生理盐水生理盐水0.90.90.70.70.50.50.30.30.10.11.01.0双缩脲试剂双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04
18、.04.04.04.04.04.0【操作步骤操作步骤】（一）（一）标准曲线的绘制标准曲线的绘制1. 1. 取小试管取小试管6 6支，编号按下表操作支，编号按下表操作 2混合后，于37水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色，以 第6管调零，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵 座标，蛋白质浓度的克数为横座标，绘成曲线。（二）样品测定：（二）样品测定：取血清样品取血清样品0.1ml0.1ml，加生理盐水，加生理盐水0.9m10.9m1，再加双缩脲，再加双缩脲试剂试剂4m14m1，于，于3737水浴中放置水浴中放置1515分钟，测其吸光度，根据吸分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算
19、得出光度值查标准曲线并计算得出每每l00mll00ml血清（样品）中蛋白血清（样品）中蛋白质的克数。质的克数。 注意：注意：注意：注意：双缩脲法的灵敏度为双缩脲法的灵敏度为1-20mg1-20mg， 取蛋白标准液时取蛋白标准液时注意浓度注意浓度实验时，实验时， 样品管可与标准管同时处理样品管可与标准管同时处理【基本原理基本原理】 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从色由红色转变成蓝色，最大吸收
20、峰从465nm465nm变成变成595nm595nm，能过，能过测定测定595nm595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 优点：优点：灵敏度高，灵敏度高，1-51-5g g；测定速度快；干扰物质少。；测定速度快；干扰物质少。 现已被广泛使用。现已被广泛使用。实验三实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量1 1取试管取试管3 3支，编号按下表操作支，编号按下表操作试试 剂（剂（mlml） 空白空白 标准标准 标标本本 生理盐水生理盐水 0.1 0.1 蛋白标准液蛋白标准液(50ug(50ugml) 0.1 ml)
21、 0.1 样样 品品 0.10.1 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.05.0 5.0 5.02.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测定各管的吸光度。【操作步骤操作步骤】3. 计算A标本/A标准50 （g/ml）= 样品中蛋白质的含量（g/ml）注意：蛋白标准液浓度蛋白标准液浓度50 50 g/mlg/ml实验四实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理基本原理】 由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在酸，因而蛋白质具有吸收紫
22、外光的性质，吸收高峰在280nm280nm280nm280nm波长波长波长波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。度成正比关系，可作定量测定。 灵敏度：灵敏度：50-10050-100g g【操作步骤操作步骤】（一）制作标准曲线（一）制作标准曲线 1.1.取试管取试管6 6支，编号，按下表操作。支，编号，按下表操作。 试剂（试剂（mlml） 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液 0.5
23、1.0 1.5 2.0 2.5 00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.03.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0 混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6 6管调管调“0” ，在，在280nm280nm280nm280nm波长波长波长波长下测定各管光密度，以各管的光密度下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图。值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图。（二）标本测定：取标本（二）标本测定：取标本1.0ml1.0ml，加入生理盐水，
24、加入生理盐水3.0ml3.0ml，测，测A A280标准曲线上读出浓度。小鼠肝脏组织总蛋白的提取小鼠肝脏组织总蛋白的提取1. 颈椎脱臼处死小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏组织，称取组织，称取100mg，置于平皿中用预冷，置于平皿中用预冷0.9%NaCl清洗。清洗。2. 在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。3. 适当量的蛋白裂解液（适当量的蛋白裂解液（RIPA），），(在使用前加入在使用前加入PMSF，使终，使终浓度为浓度为1mM)。4. 将将1mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下
25、充分研预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。将组织研磨液转移到磨。将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中。的离心管中。5. 4离心（离心（1 4000rpm，5min），取上清液转移至一新的），取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。离心管中，即为组织蛋白粗提取液。6. 蛋白定量：双缩脲法、考马斯亮蓝法及紫外分光光度法蛋白定量：双缩脲法、考马斯亮蓝法及紫外分光光度法1ml裂解液裂解液/4组组0.1ml 原液原液 4组组 =0.4ml 双缩脲法双缩脲法0.2ml原液中加入原液中加入10ml裂解缓冲液稀释裂解缓冲液稀释50倍倍0.1ml 4组组 =0.4ml 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 1ml 4组组 =4ml 紫外分光光度法紫外分光光度法
