肿瘤生物治疗最新进展.ppt

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1、肿瘤生物治疗最新进展肿瘤生物治疗最新进展及产业化开发及产业化开发广州蓝星生物科技开发有限公司广州蓝星生物科技开发有限公司 王虹王虹 增强机体抗肿瘤免疫；增强机体抗肿瘤免疫； 诱导肿瘤细胞凋亡；诱导肿瘤细胞凋亡； 抑制肿瘤血管的形成；抑制肿瘤血管的形成； 提高宿主对肿瘤常规治疗的耐受力或加速损伤的恢复。提高宿主对肿瘤常规治疗的耐受力或加速损伤的恢复。肿瘤生物治疗主要策略体现在以下几方面肿瘤生物治疗主要策略体现在以下几方面： 单克隆抗体及其偶联技术单克隆抗体及其偶联技术 以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物治疗产业化开发的热点。治疗产业化开发的热点。

2、19971997年美国上市的利妥昔单年美国上市的利妥昔单抗（抗（rituximabrituximab）为重组嵌合抗为重组嵌合抗CD20CD20单克隆抗体，用于单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图TypeTypeProductProductMarketerMarketerApprovedApprovedChimericChimericRituxanRituxan Non-Hodgkins Non-Hodgkins lymphomalymphoma GenentechGenentech Novemb

3、er 1997November 1997 ChimericChimericSimulectSimulectOrganOrgan rejection rejection prophylaxisprophylaxis NovartisNovartisMay 1998May 1998ChimericChimericRemicadeRemicadeRheumatoidRheumatoid arthritis,arthritis,CrohnCrohns diseases diseaseohnsonohnson & Johnson & JohnsonAugust 1998August 1998CDR-gr

4、aftedCDR-graftedZenapaxZenapaxOrgan rejection prophylaxisOrgan rejection prophylaxisRocheRocheDecember 1997December 1997CDR-graftedCDR-graftedSynagisSynagisRespiratoryRespiratory syncytial syncytial virus virus MedimmuneMedimmuneJune 1998June 1998CDR-graftedCDR-graftedHerceptinHerceptinMetastaticMet

5、astatic breast cancer breast cancerGenentechGenentechSeptember 1998September 1998CDR-graftedCDR-graftedHerceptinHerceptinMetastaticMetastatic breast cancer breast cancerGenentechGenentechSeptember 1998September 1998CDR-graftedCDR-graftedMylotargMylotargAcute myeloid leukemiaAcute myeloid leukemiaAme

6、rican Home American Home ProductsProductsMay 2000May 2000Monoclonal Antibodies on the MarketMonoclonal Antibodies on the Market TypeTypeProductProductMarketerMarketerApprovedApprovedMurineMurineRadiolabeledRadiolabeledZevalinZevalinNon-Hodgkins Lymphoma Non-Hodgkins Lymphoma IDEC IDEC Pharmaceutical

7、s Pharmaceuticals andand Schering Schering AG AGMarch 2002March 2002Phage DisplayPhage DisplayHumiraHumiraRheumatoid arthritisRheumatoid arthritisAbbott LaboratoriesAbbott LaboratoriesDecember 2002December 2002CDR-graftedCDR-graftedXolairXolairModerate to severe Moderate to severe persistent asthmap

8、ersistent asthmaGenentechGenentech and and NovartisNovartisJune 2003June 2003MurineMurineRadiolabeledRadiolabeledBexxarBexxarCD20 CD20 positive, positive, follicular, follicular, Non-Hodgkins Lymphoma Non-Hodgkins Lymphoma CorixaCorixa and and GlaxoSmithKlineGlaxoSmithKlineJune 2003June 2003CDR-graf

9、tedCDR-graftedRaptivaRaptivaChronic Chronic moderate-to-moderate-to-severe psoriasissevere psoriasisGenentechGenentech and and XomaXomaOctober 2003October 2003ChimericChimericErbituxErbituxColorectal cancerColorectal cancerImcloneImclone and and Bristol-Myers SquibbBristol-Myers SquibbFebruary 2004F

10、ebruary 2004CDR-graftedCDR-grafted AvastinAvastin（BevacizumabBevacizumab）colon and rectum colon and rectum cancercancer GenentechGenentechFebruary 2004February 2004Monoclonal Antibodies on the MarketMonoclonal Antibodies on the Market 20032003年治疗用单抗的销售总额已超过年治疗用单抗的销售总额已超过5252亿美元。亿美元。 2 0 0 62 0 0 6年

11、预 计年 预 计5 0 6 05 0 6 0个 治 疗 性 单 抗 上 市 。个 治 疗 性 单 抗 上 市 。 2 0 1 02 0 1 0年 预 计 单 抗 销 售 额年 预 计 单 抗 销 售 额2 0 02 0 0亿 美 元 。亿 美 元 。 美 国 已 占 全 球 单 抗 市 场美 国 已 占 全 球 单 抗 市 场9 0 % 9 0 % 一 支 独 秀 。一 支 独 秀 。 完 全 人 源 化 单 抗 现 有 多 个 处 于 临 床 前 阶 段 。完 全 人 源 化 单 抗 现 有 多 个 处 于 临 床 前 阶 段 。抗单抗单抗药物两大类抗药物两大类 抗抗肿瘤单抗肿瘤单抗 拮抗血

12、管生成单抗拮抗血管生成单抗AvastinAvastin（20042004年）年） 抗肿瘤单抗偶联物抗肿瘤单抗偶联物 抗生素与单抗偶联抗生素与单抗偶联MylolargMylolarg（20012001年）年） 性单抗性单抗ZevalinZevalin（20022002年）年） 内皮因子内皮因子（EndoglinEndoglin）：）： 膜结合性糖蛋白；膜结合性糖蛋白； 分子量分子量180180KDKD； 肿瘤组织边缘血管，尤其是新生血管内皮细胞高表达。肿瘤组织边缘血管，尤其是新生血管内皮细胞高表达。近年来单抗药物研究具有以下特点：近年来单抗药物研究具有以下特点：近年来单抗药物研究具有以下特点：近

13、年来单抗药物研究具有以下特点：第一、寻找新的分子靶点第一、寻找新的分子靶点第一、寻找新的分子靶点第一、寻找新的分子靶点 内内皮皮因子因子EndoglinEndoglin（又称又称CD105CD105）作为生成血管内作为生成血管内皮细胞特异标记物，正成为抑制肿瘤血管生成、治疗皮细胞特异标记物，正成为抑制肿瘤血管生成、治疗肿瘤的重要靶分子；动物实验表明：抗肿瘤的重要靶分子；动物实验表明：抗CD105CD105单抗与单抗与免疫毒素连接，可使肿瘤完全消失，现已进入临床试免疫毒素连接，可使肿瘤完全消失，现已进入临床试验阶段。多种内皮细胞生长因子的单抗也显示了较好验阶段。多种内皮细胞生长因子的单抗也显示了

14、较好的实验效果，如人抗的实验效果，如人抗血管内皮生长因子（血管内皮生长因子（VEGFVEGF）现已现已进入了人体临床试验。进入了人体临床试验。 目前人源化单抗的产业化技术已较为成熟。目前人源化单抗的产业化技术已较为成熟。 转基因小鼠产生人源化单抗（转基因小鼠产生人源化单抗（19971997年）；年）； 核糖体展示技术（核糖体展示技术（19991999年）年）; ; 噬菌体表达系统；噬菌体表达系统； 第二、抗体的人源第二、抗体的人源第二、抗体的人源第二、抗体的人源化化化化转转基因小鼠：基因小鼠： 灭活小鼠灭活小鼠IgIg基因；基因； 克隆并完整转入全部或大部分人克隆并完整转入全部或大部分人IgI

15、g基因座，并在小鼠体基因座，并在小鼠体内表达；内表达； 产生单抗具有产生单抗具有“ “鼠糖基化模式鼠糖基化模式” ”； 操作程序复杂。操作程序复杂。核糖体展示核糖体展示 (ribosome display) 核核糖糖体体展展示示技技术术的的核核心心是是利利用用体体外外核核糖糖体体表表达达载载体体构构建建 sc sc FvFv抗抗体体库库 , ,并并于于体体外外转转录录为为 m m RNA,RNA,体体外外翻翻译译表表达达 , ,随随后后以以固固相相化化的的抗抗原原分分子子亲亲和和筛筛选选出出核核糖糖体体 - -m m RNA-sc RNA-sc FvFv复复合合物物中中的的高高亲亲和和力力 s

16、c sc FvFv。这这种种技技术术在在实实验验中中不不用用任任何何细细胞胞 , ,是是第第一一个个完完全全在在体外筛选有功能蛋白的方法。体外筛选有功能蛋白的方法。 该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术 ( (如噬菌体展如噬菌体展示示 ) )需转化细菌或真核细胞需转化细菌或真核细胞 , ,因效率不高而降低库容因效率不高而降低库容 , ,减少减少抗体多样性的局限抗体多样性的局限 , ,并避免了宿主随细胞基因组复制过程中并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降可能丢失而产生的库容下降 , ,同时亦解决了因抗体筛选条件同时亦解决了因抗体筛选条件不利于

17、宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于核糖体不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点展示技术的体外翻译、体外筛选的特点 , ,大大缩短了实验周大大缩短了实验周期期 , ,具有省时省力、方便快速的特点。具有省时省力、方便快速的特点。v噬菌体抗体库噬菌体抗体库原理：原理：采用采用RTPCRRTPCR技术将全套人抗体重链技术将全套人抗体重链V V区基因克隆区基因克隆出来，在噬菌体表面以抗体出来，在噬菌体表面以抗体外壳融合蛋白的形式表外壳融合蛋白的形式表达分泌，经筛选后获得特异性抗体。该技术不经过繁达分泌，经筛选后获得特异性抗体。该技术不经过繁杂的杂交瘤

18、途径，即可获得全人源化抗体。从理论上杂的杂交瘤途径，即可获得全人源化抗体。从理论上讲该抗体库可筛选出任何一种单抗。讲该抗体库可筛选出任何一种单抗。v噬菌体抗体库噬菌体抗体库 与传统杂交瘤技术相比有极大的优越性，现正取代杂交瘤技术。与传统杂交瘤技术相比有极大的优越性，现正取代杂交瘤技术。主要特点：主要特点： 简单易行，采用经典的简单易行，采用经典的PCRPCR分子克隆等技术，即可操作；分子克隆等技术，即可操作； 在短期内（数周）可筛选在短期内（数周）可筛选10106 610108 8个克隆；个克隆； 筛选获得的抗体库抗体可用原核表达系统表达，无需组织培筛选获得的抗体库抗体可用原核表达系统表达，无

19、需组织培养，极大降低了成本；养，极大降低了成本； 制备的抗体通常为制备的抗体通常为FabFab片段或片段或ScFvScFv抗体，没有抗体，没有FcFc段，亲和力有段，亲和力有一定影响（某些肿瘤治疗性单抗亲和力太强反而不好），但如果对某一定影响（某些肿瘤治疗性单抗亲和力太强反而不好），但如果对某些抗体基因进行改构，同样可获得亲和力强的抗体。些抗体基因进行改构，同样可获得亲和力强的抗体。第三、偶联物分子的小型第三、偶联物分子的小型第三、偶联物分子的小型第三、偶联物分子的小型化化化化 研制小型化单抗药物对提高药物疗效有重要意义，研制小型化单抗药物对提高药物疗效有重要意义，通过酶切方法获得的通过酶切方

20、法获得的FabFab片断，其分子量相当于完整单片断，其分子量相当于完整单抗的抗的1/31/3，而通过基因工程技术制备的单链单抗，而通过基因工程技术制备的单链单抗ScFvScFv，相当于完整单抗的相当于完整单抗的1/61/6。例如单抗。例如单抗FabFab片段与平阳霉素构片段与平阳霉素构成的偶联物有显著抑制肿瘤生长和转移的作用。成的偶联物有显著抑制肿瘤生长和转移的作用。 近年发现抗肿瘤抗生素近年发现抗肿瘤抗生素CalicheamicinCalicheamicin对肿瘤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强的杀伤活性比阿霉素强10001000倍。倍。CalicheamicinCalicheamicin

21、与单抗构与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；20002000年美国年美国FDAFDA批准用于治疗免疫髓性白血病批准用于治疗免疫髓性白血病的的MylotargMylotarg就是单抗与就是单抗与CalicheamicinCalicheamicin的偶联物。的偶联物。第四、单抗药物的高效化第四、单抗药物的高效化第四、单抗药物的高效化第四、单抗药物的高效化第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞 双特异性抗体的理想目标是当细胞毒性效应细胞接近肿瘤细双特异性抗体的

22、理想目标是当细胞毒性效应细胞接近肿瘤细胞时增强抗体介导的肿瘤杀伤功能，是改善抗体治疗效果的又一胞时增强抗体介导的肿瘤杀伤功能，是改善抗体治疗效果的又一发展方向。该抗体的特异性一方面是针对肿瘤细胞，另一方面是发展方向。该抗体的特异性一方面是针对肿瘤细胞，另一方面是针对宿主细胞上的某些受体。理论上，使用双特异性抗体可征募针对宿主细胞上的某些受体。理论上，使用双特异性抗体可征募众多效应细胞。众多效应细胞。第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力 定向诱变可变区的特定氨基酸，可以提高抗体的亲

23、和力，这定向诱变可变区的特定氨基酸，可以提高抗体的亲和力，这可通过分子遗传手段结合噬菌体展示文库来实现。先创建一个突可通过分子遗传手段结合噬菌体展示文库来实现。先创建一个突变体文库，分离对特定抗原具有最高亲和力的噬菌体。这种方法变体文库，分离对特定抗原具有最高亲和力的噬菌体。这种方法一般需耗时一般需耗时4646个月，抗体的亲和力可提高约个月，抗体的亲和力可提高约5050倍左右。当然抗倍左右。当然抗体亲和力太高，抗体易聚体在肿瘤组织外周，反而影响活性。体亲和力太高，抗体易聚体在肿瘤组织外周，反而影响活性。第七、抗体导向的酶活化前体药物技术第七、抗体导向的酶活化前体药物技术第七、抗体导向的酶活化前

24、体药物技术第七、抗体导向的酶活化前体药物技术 前体药物前体药物（ProProdrugdrug）是指该药物无治疗活性或仅有较低活是指该药物无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；其优点性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；其优点是可降低毒性和延长药物体内的作用时间。在单抗治疗中运用此是可降低毒性和延长药物体内的作用时间。在单抗治疗中运用此策略是将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间策略是将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤肿瘤细隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤

25、肿瘤细胞。现已有单抗碱性胞。现已有单抗碱性磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单抗磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单抗胞嘧啶脱氨酶偶联物合并胞嘧啶脱氨酶偶联物合并5 5FuFu；在临床试验中取得了较好效果。在临床试验中取得了较好效果。 尽尽管管美美国国在在治治疗疗性性单单抗抗的的研研究究方方面面处处于于绝绝对对优优势势；但但大大多多数数单单克克隆隆抗抗体体药药物物的的靶靶标标没没有有专专利利保保护护或或者者专专利利保保护护已已过过期期。更更为为重重要要的的是是，单单抗抗药药物物的的研研发发具具有有自自己己的的特特点点，即即众众多多公公司司可可以以针针对对同同一一靶靶标标研研究究单单抗抗药药物物，它它可

26、可以以根根据据同同一一靶靶标标的的不不同同抗抗体体表表位位研研发发具具有有自自主主知知识识产产权权的的药药物物而而又又不不侵侵犯犯别别人人专专利利，这这一一点点也也会会被被我我国国SFDASFDA认认证证为为新新药药，因此治疗性单抗在我国其有广阔的应用前景。因此治疗性单抗在我国其有广阔的应用前景。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗 具有良好前景具有良好前景，目前研究主要集中在：目前研究主要集中在： 对肿瘤免疫原的研究，包括寻找新的肿瘤特异性抗对肿瘤免疫原的研究，包括寻找新的肿瘤特异性抗原，以及利用基因工程方法制备或改构某些肿瘤抗原，以及利用基因工程方法制备或改构某些肿瘤抗原。以达到激活免疫效应细胞

27、。原。以达到激活免疫效应细胞。 应用细胞因子作为疫苗佐剂可明显增加疫苗的治疗应用细胞因子作为疫苗佐剂可明显增加疫苗的治疗效果，如：效果，如：GMCSFGMCSF、CD40LCD40L作佐剂，可活化作佐剂，可活化CTLCTL细胞。细胞。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗 树突状树突状细胞（细胞（DCDC）在肿瘤疫苗诱发机体免疫反应过在肿瘤疫苗诱发机体免疫反应过程中发挥关键性作用。因此用抗原程中发挥关键性作用。因此用抗原改敏的改敏的DCDC治疗肿治疗肿瘤被认为最具有发展前景。瘤被认为最具有发展前景。 基因工程亚单位疫苗、抗原表位的选择是新型肿瘤疫基因工程亚单位疫苗、抗原表位的选择是新型肿瘤疫苗设计的关

28、键。苗设计的关键。 肿瘤疫苗主要以诱导细胞（肿瘤疫苗主要以诱导细胞（CiCi）为主；因此为主；因此T T细胞表细胞表位预测分析在疫苗设计中显得尤为重要。位预测分析在疫苗设计中显得尤为重要。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗 肿瘤的异质性及肿瘤抗原的多样性，使相关抗原的肿瘤的异质性及肿瘤抗原的多样性，使相关抗原的特异性不高，免疫原性不强；特异性不高，免疫原性不强； 用免疫缺陷的裸鼠建立的异体人类肿瘤模型用于肿用免疫缺陷的裸鼠建立的异体人类肿瘤模型用于肿瘤药物筛选（包括疫苗）。瘤药物筛选（包括疫苗）。vDC疫苗疫苗 肿瘤抗原肽或蛋白体外致肿瘤抗原肽或蛋白体外致敏敏DCDC 可产生保护性抗肿瘤可产生保护

29、性抗肿瘤T T细胞介导的免疫，并引起细胞介导的免疫，并引起肿瘤消退，肿瘤消退，如如PSMP2PSMP2肽致敏肽致敏DCDC用于用于3737例前列腺癌例前列腺癌治疗，治疗，30%30%明显好转。明显好转。 细胞溶解物致敏细胞溶解物致敏DCDC 由于肿瘤抗原不清，采用全血细胞溶解物致敏由于肿瘤抗原不清，采用全血细胞溶解物致敏DCDC，可以诱发广泛的可以诱发广泛的T T细胞反应。细胞反应。 此法最大的缺点是：细胞提取物中含有自身抗原，此法最大的缺点是：细胞提取物中含有自身抗原，可诱发自身免疫反应。可诱发自身免疫反应。vDC疫苗疫苗 DCDC与肿瘤细胞融合与肿瘤细胞融合 采用电穿孔法将采用电穿孔法将D

30、CDC与肿瘤细胞融合，保留了与肿瘤细胞融合，保留了DCDC的的生物学特征，可以诱导生物学特征，可以诱导T T细胞对该肿瘤的细胞毒性作用。细胞对该肿瘤的细胞毒性作用。 目前该方法用于个体化治疗，将肿瘤病人的肿瘤目前该方法用于个体化治疗，将肿瘤病人的肿瘤细胞与脐血干细胞来源的细胞与脐血干细胞来源的DCDC融合后回输给肿瘤病人体融合后回输给肿瘤病人体内，具有明显的抗肿瘤效应，临床有效率可达内，具有明显的抗肿瘤效应，临床有效率可达70%70%以以上。上。vDC疫苗疫苗 细胞因子基因或肿瘤抗原基因修饰细胞因子基因或肿瘤抗原基因修饰DCDC 如将如将IL18IL18、IL12IL12基因转基因转染染DCD

31、C，可明显增加特异可明显增加特异性性T T细胞数量。细胞数量。 用肿瘤相关抗原用肿瘤相关抗原（TAATAA）基因修饰基因修饰DCDC，导致导致T T细胞细胞活化，其诱导的抗肿瘤免疫反应效果优于抗原肽致敏活化，其诱导的抗肿瘤免疫反应效果优于抗原肽致敏的的DCDC疫苗。疫苗。vDC疫苗疫苗DC永生化技术 目前目前DCDC回输疗法已经试用于临床，并取得了其它回输疗法已经试用于临床，并取得了其它方法无可比拟的疗效，在国外正用于各种肿瘤，但作方法无可比拟的疗效，在国外正用于各种肿瘤，但作为治疗手段有一重要难题为治疗手段有一重要难题如何大量扩增及保存如何大量扩增及保存DCDC。 DC DC永生化技术永生化

32、技术: : 转染癌基因转染癌基因mycmyc基因基因 转染病毒基因转染病毒基因HPV E7HPV E7基因基因肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗 上市产品：黑色素疫苗（上市产品：黑色素疫苗（CorixaCorixa公司，加拿大）。公司，加拿大）。 临床临床期：期：IMCBEC2IMCBEC2（ImcloneImclone公司），用于肺癌。公司），用于肺癌。 临床临床期：期：HER/HER/NeuNeu基因蛋白疫苗（基因蛋白疫苗（ CorixaCorixa公司），公司）， 用于乳腺癌（用于乳腺癌（20032003年年6 6月）；月）； 质粒质粒DNADNA疫苗（疫苗（ CorixaCorixa公司），

33、用于肺癌。公司），用于肺癌。目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，主要表现在以下几个方面：主要表现在以下几个方面：主要表现在以下几个方面：主要表现在以下几个方面： 第一，众多实体肿瘤缺乏特异性抗原，尽管目前已第一，众多实体肿瘤缺乏特异性抗原，尽管目前已在实体肿瘤中发现了在实体肿瘤中发现了500500多种肿瘤抗原，但只有少数多种肿瘤抗原，但只有少数抗原较为特异，且这些抗原免疫原性较弱。在近几抗原较为特异，且这些抗原免疫原性较弱。在近几年的研究中发现：仅激活年的研究中发

34、现：仅激活CD8CD8+ + T T细胞不足以产生有细胞不足以产生有效的细胞免疫，同时需要效的细胞免疫，同时需要CD4CD4+ + T T细胞参与。而目前细胞参与。而目前的疫苗缺乏这种设计的疫苗缺乏这种设计。 第二、疫苗缺乏有效的抗原递呈。现有的疫苗在此第二、疫苗缺乏有效的抗原递呈。现有的疫苗在此环节上存在两个严重问题：一是进入的大部分疫苗环节上存在两个严重问题：一是进入的大部分疫苗与与APCAPC不能充分接触难以实现抗原递呈；二是即使不能充分接触难以实现抗原递呈；二是即使有少量疫苗被有少量疫苗被APCAPC捕获，也因抗原表达量甚微难以捕获，也因抗原表达量甚微难以发挥有效的抗原递呈。发挥有效的

35、抗原递呈。 第第三三、如如何何打打破破机机体体免免疫疫耐耐受受。肿肿瘤瘤细细胞胞通通过过下下调调FasFas的的表表达达来来逃逃避避FasFas介介导导的的细细胞胞凋凋亡亡。尽尽管管目目前前通通过过采采用用共共刺刺激激分分子子修修饰饰的的疫疫苗苗有有可可能能打打破破机机体体对对肿肿瘤瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的实验数据。的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的实验数据。v新的肿瘤靶基因新的肿瘤靶基因 针对肿瘤相关抗原的靶向治疗（又称分子靶药物）针对肿瘤相关抗原的靶向治疗（又称分子靶药物）是提高肿瘤治疗效果的重要途径。随着分子生物学的是提高肿瘤治疗效果的重要途径。随着分子生物学的发展，肿瘤新靶基因被不

36、断发现。发展，肿瘤新靶基因被不断发现。 生存素（生存素（SurvivinSurvivin）是近年来新发现的凋亡蛋白抑制因子；阻断生存素的是近年来新发现的凋亡蛋白抑制因子；阻断生存素的活化（如采用反义核酸技术），可导致肿瘤细胞的凋活化（如采用反义核酸技术），可导致肿瘤细胞的凋亡。亡。v新的肿瘤靶基因新的肿瘤靶基因 2002 2002年美国科学家在胚胎干细胞、神经干细胞、多年美国科学家在胚胎干细胞、神经干细胞、多种人类肿瘤细胞中发现了一种大量存在于细胞核中的种人类肿瘤细胞中发现了一种大量存在于细胞核中的蛋白质（蛋白质（nucleosteminnucleostemin）及其基因，该基因位于人类及其基

37、因，该基因位于人类3 3号染色体，表达号染色体，表达550550个氨基酸；目前众多的科学家一致个氨基酸；目前众多的科学家一致认为该基因亦是某些肿瘤治疗的又一靶基因。认为该基因亦是某些肿瘤治疗的又一靶基因。 综上所述，疫苗、细胞因子、肿瘤血管生成综上所述，疫苗、细胞因子、肿瘤血管生成抑制剂及单克隆抗体已成为肿瘤治疗的有效方法。它抑制剂及单克隆抗体已成为肿瘤治疗的有效方法。它们均涉及到生物医药的重要领域们均涉及到生物医药的重要领域蛋白质表达与纯蛋白质表达与纯化技术，化技术，这正是生物医药产业化开发的关键所在。这正是生物医药产业化开发的关键所在。 我国目前生物技术产业化最大难点。我国目前生物技术产业

38、化最大难点。v蛋白表达载体蛋白表达载体 原核原核大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 真核真核a a 酵母酵母 b b 哺乳动物细胞哺乳动物细胞CHOCHO细胞细胞 c c 昆虫昆虫 大肠杆菌表达是目前最成熟的表达体系。大肠杆菌表达是目前最成熟的表达体系。具有操作简具有操作简单、成本低产量高（表达量单、成本低产量高（表达量10%70%10%70%）。）。 缺点：缺点：a a、大多以包涵体形式出现（尽管设计成分泌型）大多以包涵体形式出现（尽管设计成分泌型） b b、产物缺乏糖基化产物缺乏糖基化 c c、含有大量内毒素，给纯化带来极大不方便含有大量内毒素，给纯化带来极大不方便 酵母是外源基因表达最理想

39、的真核表达体系酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系它具有许多优点：它具有许多优点： 遗传背景清楚遗传背景清楚 具有翻译后修饰加工系统，如糖基化具有翻译后修饰加工系统，如糖基化 不产生毒素，不含特异性的病毒不产生毒素，不含特异性的病毒 大规模发酵简单，成本低大规模发酵简单，成本低 表达产物分泌到胞外，有利于纯化表达产物分泌到胞外，有利于纯化 表达量可达菌体蛋白表达量可达菌体蛋白10%30%10%30%v蛋白质表达蛋白质表达蛋白一级结构的改构蛋白一级结构的改构 （改变或不改变氨基酸）（改变或不改变氨基酸） 增加生物活性或

40、（和）减毒增加生物活性或（和）减毒 改变与某些物质的亲和力改变与某些物质的亲和力 增加在体内的半衰期增加在体内的半衰期 增加在表达体系的表达量增加在表达体系的表达量 （原核或真核表达）（原核或真核表达） 增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应 肿瘤的治疗，主要是增加细胞免疫功能。肿瘤的治疗，主要是增加细胞免疫功能。 如如CEACEA肿瘤病人体内肿瘤病人体内的的CEACEA是抑制患者细胞免是抑制患者细胞免疫功能的蛋白。但如果疫功能的蛋白。但如果对对CEACEA的某些氨基酸改的某些氨基酸改构可以明显增加活化构

41、可以明显增加活化T T细胞的功能细胞的功能。 增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应 人人TNFTNF突变体突变体较原型较原型TNFNTNFN端缺失端缺失7 7个个氨基酸氨基酸第第8 8位脯氨酸位脯氨酸 精氨酸精氨酸第第9 9位脯氨酸位脯氨酸 赖氨酸赖氨酸第第1010位脯氨酸位脯氨酸 精氨酸精氨酸 其生物学活性提高数百倍，毒性减少几十倍。其生物学活性提高数百倍，毒性减少几十倍。生长因子受体生长因子受体（EGFR EGFR ）的突变株（的突变株（ EGFRV EGFRV ） 第第2727外显子中外显子中80

42、1801碱基被去除（胞外区碱基被去除（胞外区62736273位位氨基酸缺失），而在融合部位新产生一个甘氨酸。氨基酸缺失），而在融合部位新产生一个甘氨酸。这种缺失融合仅在使肿瘤细胞检测到这种缺失融合仅在使肿瘤细胞检测到EGFR EGFR 。 因此因此EGFRV EGFRV 单抗在单抗在动物实验中证实仅能结合动物实验中证实仅能结合EGFR EGFR 阳性的肿瘤细胞，其特异性较好。阳性的肿瘤细胞，其特异性较好。 改变与某些物质的亲和力改变与某些物质的亲和力改变与某些物质的亲和力改变与某些物质的亲和力 1 1L18L18是是19951995年发现的新细胞因子，在结构和功年发现的新细胞因子，在结构和功能

43、上与能上与IL12IL12相似。相似。 1 1L18L18的前体蛋白的前体蛋白（Pro-1L-18Pro-1L-18）为为193193个氨基酸，个氨基酸，2424KDKD。无生物学活性，成熟的无生物学活性，成熟的1 1L-18L-18为为153153个氨基酸，个氨基酸，1818KDKD，并以单体形式表现生物学活性，具有抗肿瘤并以单体形式表现生物学活性，具有抗肿瘤及抗病毒活性。目前的实验表明，及抗病毒活性。目前的实验表明，1 1L-18L-18有极强的抗有极强的抗肿瘤作用，肿瘤作用，并由并由CD4+TCD4+T细胞和细胞和NKNK细胞介导的。细胞介导的。1L18有两种拮抗剂有两种拮抗剂 1 1L

44、18L18受体（受体（1 1L18RL18R） 可溶性可溶性1 1L18L18结合蛋白（结合蛋白（ 1 1L18 BPL18 BP） 1L18 1L18与与1 1L18L18受体的结合力要明显低于其它细胞因受体的结合力要明显低于其它细胞因子与受体的结合力。子与受体的结合力。 1 1L18L18与与1 1L18RL18R结合蛋白的结合蛋白的解离常数解离常数（KDKD）为为18.518.5nmolnmol/ / L L。而其它细胞因子一而其它细胞因子一般为般为4545 nmolnmol/ / L L左右，左右， 1 1L18BPL18BP能能消除消除1 1L18 L18 消杀的消杀的生物学活性反应

45、，生物学活性反应， 1 1L18 BPL18 BP这这1 1L18 L18 的的主要拮抗剂，维持主要拮抗剂，维持1 1L18 L18 在在体内的活性水平。体内的活性水平。1L18BP 某些肿瘤组织可持续分泌查溶性某些肿瘤组织可持续分泌查溶性1 1L18 BPL18 BP，从而从而明显降低血清中明显降低血清中1 1L18 L18 的的水平。如果单纯采用水平。如果单纯采用1 1L18 L18 治疗肿瘤病人，治疗肿瘤病人， 1 1L18 BPL18 BP含大量中和含大量中和1 1L18 L18 而达不而达不到到治疗效果。治疗效果。 如果将如果将1 1L18 L18 未点未点突变（突变（ 1 1L18

46、 L18 突变株），而维突变株），而维持或增加持或增加1 1L18 L18 的生物学活性而这种的生物学活性而这种1 1L18 L18 突变体与突变体与1 1L18 BPL18 BP的的结合力大为降低，即可达到结合力大为降低，即可达到“ “一石二鸟一石二鸟” ”的作用。的作用。增加在体内的半衰期增加在体内的半衰期 黑色素瘤相关的抗原黑色素瘤相关的抗原MART1MART1肽表位氨基酸进行肽表位氨基酸进行置换，该抗原刺激靶置换，该抗原刺激靶CTLCTL活性在活性在3 3h h内失活，而原抗原内失活，而原抗原的半衰期仅的半衰期仅2222秒。秒。单链单链抗体（抗体（SCFVSCFV） 是抗体可变区的重链

47、和轻链通过连接肽（约是抗体可变区的重链和轻链通过连接肽（约2020aaaa左右）相连的融合蛋白。左右）相连的融合蛋白。具有：具有： 分子量小，可迅速渗透到肿瘤内部或其它靶组织；分子量小，可迅速渗透到肿瘤内部或其它靶组织； 避免了避免了FCFC段引起的非特异性细胞毒性及负段原性；段引起的非特异性细胞毒性及负段原性； 制备工艺简单。制备工艺简单。 尽管尽管ScFvScFv在肿瘤生物治疗中具有极其广泛的在肿瘤生物治疗中具有极其广泛的应用前景，但在临床中仍存在几个主要问题：应用前景，但在临床中仍存在几个主要问题： 缺乏缺乏FcFc段，亲和力大多下降段，亲和力大多下降 半衰期短，很快从血液清除半衰期短，

48、很快从血液清除 稳定性不够稳定性不够 ScFvScFv基因基因改构改构ScFvScFv与人与人IgIgG G1 1FcFc段连接成融段连接成融合蛋白，改构合蛋白，改构后后ScFvScFv半衰期延长半衰期延长3030倍，生物活性倍，生物活性没有下降。没有下降。 在在ScFvScFv轻链和重链的轻链和重链的可变性适当各加入一个可变性适当各加入一个半胱氨酸形成以二硫键固定的半胱氨酸形成以二硫键固定的FcFc段而构成段而构成DsFvDsFv，证实证实DsFvDsFv结合能力与稳定性均优于结合能力与稳定性均优于ScFvScFv蛋白纯化蛋白纯化 不同的治疗目的对不同载体表达蛋白的纯度要求不不同的治疗目的对

49、不同载体表达蛋白的纯度要求不一样。一样。 如肿瘤疫苗如肿瘤疫苗 原核表达原核表达95%95% 真核表达真核表达98%98% 双水相双水相双水相双水相萃取技术萃取技术萃取技术萃取技术 方法：向水相中加入溶入水的高分子大化合物方法：向水相中加入溶入水的高分子大化合物PEGPEG等，可形成密度不同的两相。因两相均含有水，等，可形成密度不同的两相。因两相均含有水，称为双水相。称为双水相。 轻相轻相含某种高分子化合物含某种高分子化合物 重相重相含盐类或一种化合物含盐类或一种化合物 体系：体系：PEG/PEG/盐（硫酸铵等）；盐（硫酸铵等）； PEG/PEG/葡聚糖。葡聚糖。双水相双水相萃取技术萃取技术从

50、从实用角度来讲，细胞碎片分配在下相适宜。实用角度来讲，细胞碎片分配在下相适宜。 核酸等大部分杂质一般在下相，可以同时除去核酸等大部分杂质一般在下相，可以同时除去 下相为无机盐，去除成本低下相为无机盐，去除成本低 蛋白质位于上相有利保护活性（蛋白质位于上相有利保护活性（PEGPEG保护），而保护），而下相的高浓度盐会造成蛋白失活。下相的高浓度盐会造成蛋白失活。 双水相萃取技术特点双水相萃取技术特点双水相萃取技术特点双水相萃取技术特点 清除细胞碎片的效率优于一般的离心法和过滤法清除细胞碎片的效率优于一般的离心法和过滤法 ； 该方法关键是把蛋白产物层尽可能分在上层，而细该方法关键是把蛋白产物层尽可能

51、分在上层，而细胞碎片分在下层；胞碎片分在下层； 分离的纯度与色谱层析还有一定的距离。因此该技分离的纯度与色谱层析还有一定的距离。因此该技术用于初步纯化。术用于初步纯化。 高效疏水色谱（高效疏水色谱（高效疏水色谱（高效疏水色谱（HICHIC） 原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。 HI

52、CHIC的特征的特征的特征的特征 对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，孔径在团，孔径在2510025100umum 避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离物质的生物活性。离物质的生物活性。 具有具有“ “一石四鸟一石四鸟” ”的作用，尤其是纯化大肠杆菌表的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达产物时具有除去变性剂（盐酸胍）、使蛋白质折达产物时具有除去变性剂（盐酸胍）、使蛋白质折叠（复性）去除杂蛋白，便于变性剂回收。叠（复性）去除杂蛋白，便于变性剂回收。HIC： 采用高盐时上样、低盐时洗脱。故大多在

53、硫酸铵沉采用高盐时上样、低盐时洗脱。故大多在硫酸铵沉淀或离子交换层析后使用。淀或离子交换层析后使用。 洗脱条件温和洗脱条件温和-降低盐浓度降低盐浓度 调整溶液的调整溶液的pHpH可调整该蛋白的疏水性，因为蛋白可调整该蛋白的疏水性，因为蛋白在接近等电点时具有最大的疏水性。在接近等电点时具有最大的疏水性。HIC 疏疏水柱经过再生后，通常可使用水柱经过再生后，通常可使用20302030次；次； 具有高蛋白质的结合容量（具有高蛋白质的结合容量（1010010100mgmlmgml）；）； 操作简单，自动化程度高；操作简单，自动化程度高； 产业化程度极高，目前正广泛用于生物制药。产业化程度极高，目前正广

54、泛用于生物制药。 高效亲和液相色谱（高效亲和液相色谱（高效亲和液相色谱（高效亲和液相色谱（HPACHPAC） 19781978年，年，DhlsonDhlson首次报道采用首次报道采用HPACHPAC分离分离LDHLDH同工同工酶及人血清白蛋白。酶及人血清白蛋白。 特点：特点： 配体与分离物特异性亲和力配体与分离物特异性亲和力 分离选择性强，纯化倍数优于其它层析分离选择性强，纯化倍数优于其它层析 与其它与其它HPLCHPLC不同，不同，HPACHPAC不遵循其它色谱具有的理论塔不遵循其它色谱具有的理论塔板规律板规律HPACHPAC 柱子的专用性强。柱子的专用性强。 载体为能耐高压的硅酸、有机聚合

55、物载体为能耐高压的硅酸、有机聚合物 目前仅目前仅HPACHPAC常常在纯化的最后一步或中间来使用以提常常在纯化的最后一步或中间来使用以提高产品纯度，适用于小批量样品分析和制备，目前产高产品纯度，适用于小批量样品分析和制备，目前产业化有一定难度。业化有一定难度。HPAC 亲亲和柱的和柱的制备制备交联配体到介质上交联配体到介质上 分两步：第一步活化介质分两步：第一步活化介质 第二步将配体交联到介质上。第二步将配体交联到介质上。HPAC配基配基合成基团合成基团合成基团合成基团 亲和配基亲和配基亲和配基亲和配基 金属离子金属离子（ZnZn、NiNi） 染料（三嗪类染料）染料（三嗪类染料）专一性差、价廉

56、、稳定性好。专一性差、价廉、稳定性好。HPAC配基配基 天然基团配基天然基团配基天然基团配基天然基团配基化学稳定性差化学稳定性差化学稳定性差化学稳定性差 核苷酸配基（核苷酸配基（ATPATP） 氨基酸配基（组氨碱）氨基酸配基（组氨碱） 植物凝集素植物凝集素能可逆性结合碳水化合物的蛋白质，能可逆性结合碳水化合物的蛋白质，由于凝集素洗脱条件温合，易于操作，现应用日渐由于凝集素洗脱条件温合，易于操作，现应用日渐广泛，有较好的产业化趋势。广泛，有较好的产业化趋势。凝集凝集素素 至少每个分子有两个碳水化合物结合部位，可以用作至少每个分子有两个碳水化合物结合部位，可以用作糖蛋白的亲和配基。糖蛋白的亲和配基

57、。 每毫升年度可偶联每毫升年度可偶联11001100mgmg凝集素，凝集素， 这种活化的介质（溴化氢等）既有商品购买，也可自这种活化的介质（溴化氢等）既有商品购买，也可自行活化，可降低成本行活化，可降低成本50605060倍；倍； 上样时减慢速度有助于凝集素上样时减慢速度有助于凝集素糖蛋白结合；糖蛋白结合； 增加柱温到增加柱温到3737 有助于结合，降低柱温有助于洗脱。有助于结合，降低柱温有助于洗脱。凝集素凝集素 上样前用高盐洗柱可减少非特异性结合；上样前用高盐洗柱可减少非特异性结合； 硼酸盐缓冲液有助于困难的洗脱。因为它能结合某些糖硼酸盐缓冲液有助于困难的洗脱。因为它能结合某些糖蛋白；蛋白；

58、 在整个过程中应避免使用磷酸盐缓冲液。因为它易于二在整个过程中应避免使用磷酸盐缓冲液。因为它易于二价离子产生沉淀。价离子产生沉淀。HPAC配基配基 生物专一性配基生物专一性配基生物专一性配基生物专一性配基优点：抗原优点：抗原抗体专一亲和作用，结合力；抗体专一亲和作用，结合力；缺点：缺点： 洗脱困难，添加变性剂会影响蛋白活性；洗脱困难，添加变性剂会影响蛋白活性； 一种蛋白质一种分离柱，成本高；一种蛋白质一种分离柱，成本高； 单抗与载体的偶联有时不太牢固，会在剧单抗与载体的偶联有时不太牢固，会在剧烈洗脱时脱落。烈洗脱时脱落。HPAC配基配基 由于配基的脱落，对蛋白质的纯度有较大影响，增加了由于配基

59、的脱落，对蛋白质的纯度有较大影响，增加了纯化步骤；纯化步骤； 这种介质的使用寿命只能使用这种介质的使用寿命只能使用2323次（尽管说明书说次（尽管说明书说明可使用明可使用510510次）；次）； 目前在科研上采用的竞争性洗脱，尽管洗脱条件温和，目前在科研上采用的竞争性洗脱，尽管洗脱条件温和，但又一次增加了纯化步骤及成本；但又一次增加了纯化步骤及成本； 目前目前HPACHPAC用于产品化报道的文献极少，而用于科研的用于产品化报道的文献极少，而用于科研的报道极多。报道极多。配基活化化合物及介质配基活化化合物及介质配基结合基团配基结合基团 偶联试剂偶联试剂 适合的介质适合的介质 供应商供应商氨基氨基

60、 溴化氰溴化氰 琼脂糖琼脂糖 pharmaciapharmacia 聚丙烯聚丙烯氨基氨基 戊二醛戊二醛 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺- -琼脂糖琼脂糖 IBF IBF SepracorSepracor氨基氨基 羟基琥珀酰胺羟基琥珀酰胺 交联琼脂糖交联琼脂糖 pharmaciapharmacia氨基或硫基氨基或硫基 甲苯磺酰基或甲苯磺酰基或tresyltresyl氯化物氯化物 琼脂糖琼脂糖 Pierce SigmaPierce Sigma氨基或羧基氨基或羧基 碳二亚胺碳二亚胺 琼脂糖琼脂糖 Bio-Bio-Rad pharmacia Rad pharmacia 交联交联琼脂糖琼脂糖 PiercePier

61、ce碳水化合物碳水化合物 酰肼酰肼 交联琼脂糖交联琼脂糖 Bio-Bio-Rad Rad PiercePierce 聚苯乙烯聚苯乙烯 SigmaSigma目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发 CEA TCEA T细胞表位改构疫苗在原核与真核表达体系的细胞表位改构疫苗在原核与真核表达体系的表达表达 高效低毒突变型高效低毒突变型TNF-TNF-在原核系统的表达在原核系统的表达 类风湿性关节炎融合蛋白在真核系统的表达类风湿性关节炎融合蛋白在真核系统的表达广州蓝星生物科技开发限公司广州蓝星生物科技开发限公司 电话：电话：电话：电话：020-87644610 61647224020-87644610 61647224网址：网址：网址：网址：电邮：电邮：电邮：电邮：