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1、微生物遗传试验ppt课件Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望紫外线(U、V)诱变营养缺陷型筛选o实验目的o掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理o学习筛选、检出、鉴定营养缺陷型的方法实验原理o根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物等因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度。又根据基因突变的规律，即微生物的基因突变与环境条件没有直接对应的关系，要想得到某一特定类型的突变株，关键不是选用某种特定的诱变剂，而是采用特定的筛选方法。o
2、为了得到大肠杆菌的某一营养缺陷型，本实验以UV作为诱变因素，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。又根据营养缺陷型在基本(MM)培养基上不能生长，只有在完全(CM)或(MM)培养基上加上它所缺陷的那种物质才能生长的原理，我们采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，最后用生长谱法加以鉴定。o 本实验要掌握的基本概念包括： 完全培养基，基本培养基，野生型菌株， 缺陷型菌株，诱变育种，诱变因素。oo诱变育种：根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物的因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选人们所需要的菌株，这一过程称诱变育种。oo诱变因素：凡是能引起微生
3、物突变或是将突变频率提高到自发突变水平以上的因素称诱变因素。UV诱变的原理oUV作用机制 o照射剂量oo绝对剂量绝对剂量：以单位面积接受的能量进行计算(尔格mm2或伦琴mm2)。oo相对剂量相对剂量：表示的方法很多照射时间、距离、杀菌率等。一般实验中微生物受U.V照射的剂量方法是采用相对剂量，即固定紫外灯管的功率(15W-20W)，固定距离(30cm)照射不同时间，也有采用杀菌率作为相对剂量的。 ooU UV V处理的条件处理的条件1.细菌一定要成单细胞状态、均匀的悬浮液。真菌和放线菌一般处理孢子悬液。2.处理细菌细胞时，浓度一般为108ml，并且以对数生长期为好，处理真菌和放线菌的孢子时，浓
4、度为106ml。3.处理的菌液都以生理盐水配制。ooU UV V照射后的处理照射后的处理 o避光培养o要进行饥饿培养(考虑表型迟延作用) 营养缺陷型筛选的步骤(按图操作)E.Coli K128ml肉汤37振荡培养1416hrs添加新鲜肉汤8ml，分装2只转入离心管，4000rpm离心5分钟1.菌体制备2.杀菌曲线制作和诱变处理先打匀沉淀，各加8ml生理盐水分装到5个皿，每皿3 3mlUV处理（不同剂量）向其中一个向其中一个向其中一个向其中一个60s60s处理添处理添处理添处理添加加加加3ml23ml2肉汤肉汤肉汤肉汤37避光培养12hrs在红灯下操作，将不同处理时间的菌液涂LB平板，避光培养1
5、2hrs计数，制备杀菌曲线4000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次取取0.1ml0.1ml洗涤干净洗涤干净的菌液加的菌液加入到无氮入到无氮5ml无氮培养基37，12hrs饥饿培养饥饿培养3.青霉素淘汰野生型5ml 2氮培养基加青霉素到终浓度500U/ml12hrs12hrs、16hrs16hrs、24hrs24hrs分别取样0.1ml，涂布MM和CM培养基，培养3648hrs每个时段涂布每个时段涂布8686个个完全培养基平板和完全培养基平板和1 1个个基本培养基平板基本培养基平板 8+1 8+1 6+14.缺陷型检出o取青霉素法CM和MM培养基上菌落数量差异最大的那一组，从CM板上用无菌
6、牙签点种100个菌落到MM和CM培养基上，3712hrs培养。MMCMMMCM复证接种5ml肉汤5.生长谱鉴定5ml肉汤将可能的缺陷型菌落接入肉汤，37培养1416hrs。4000rpm离心5min，洗涤3次取菌液1ml，混菌于基本培养基皿底划格，各区放入混合氨基酸等，培养24hrs，观察生长圈培养基oo完全培养基完全培养基和22肉汤肉汤 每组以1500ml的量称取药品。先加750ml水溶解，调节pH7.5，取3ml于试管中即为22肉汤肉汤，每组2支。余下添加744ml水，摇匀，分装6个三角瓶，每瓶200ml，并在瓶内加入2的琼脂粉。剩余的液体培养基分装2个三角瓶，是为肉汤培养基肉汤培养基。o
7、o基本培养基基本培养基1.10A缓冲液100ml：K2HPO4 10.5g，KH2PO4 4.5g，(NH4)2SO4 1.0g，柠檬酸钠0.5g2.20%葡萄糖50ml3.0.25mol/LMgSO4 : 100ml4.素琼脂每组2瓶：进口琼脂粉3.5g175ml蒸馏水。临用前融化素琼脂，添加20ml 10A缓冲液、20葡萄糖4ml， MgSO4 1ml混合倒皿。oo无氮培养基无氮培养基 每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。oo22氮培养基氮培养基每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。无无N N培养基配方培养基配方( (100ml100ml) )：K2HPO4 0.7g，KH2PO
8、4 0.3g，葡萄糖2g，柠檬酸钠0.5g， MgSO4 0.1g, pH7.0。2N2N培养基配方培养基配方( (100ml100ml) )：在无氮培养基基础上添加(NH4)2SO4 0.2goo生理盐水生理盐水200ml分装2瓶：0.85 NaCl，蒸馏水配制。另：每组准备6个空三角瓶灭菌备用。实验结果o杀菌曲线时间S0 20 40 60 80 90菌落数处理组0(CK)20“40“60“80“稀释度10-710-610-510-610-510-410-510-410-310-410-310-210-310-210-1菌落数杀菌曲线制作合并2管共16ml菌液，每个待照平皿加3ml。20”4
9、0”60”60”80”CK余液照射后在避光条件下稀释，稀释倍数如下表所示处 理 组0（CK）20s40s60s80s稀释倍数10-710-610-510-410-3每个处理取最后3个稀释度（如CK取10-7、 10-6、10-5，以此类推）涂布平皿，37避光培养12hrs以上，取出进行菌落计数。照射完立即添加照射完立即添加3ml23ml2加富肉加富肉汤汤，用黑布包好，放在铝盒中，用黑布包好，放在铝盒中，3737培养培养12hr12hr备用备用。红灯下的稀释操作稀释完毕后取最后3个稀释度涂平板，每个稀释度2个重复，共30套。ssss实验二 细菌转化细菌转化o目的：o1.将体外的重组质粒作为转化因
10、子引入到相应的受体细胞中，然后从中筛选出特定的转化子。o2掌握化学法转化的基本方法二.原理o转化因子有不同的存在形式。无论那一种转化因子都存在于细胞内，要进行转化，首先必须从细胞中将转化因子抽提出来。o不同的转化因子转化不同的细菌有不同的转化效率，转化率的高低关键取决于受体的感受态，只有具备有感受态的细菌才能摄取外来的DNA分子。而且细菌的感受态是在短时间内发生的，一般出现在对数生长的后期。 o本实验是对大肠杆菌的质粒PRF作为转化因子，将它从大肠杆菌中抽提出来，此质粒PRF上代有氨卞青霉素的标记，以大肠杆菌DH5 作为受体，大肠杆菌DH5对氨卞是敏感的，若将PRF转化到DH5 中就能在选择性
11、平板LB+AP上长出转化子来。三.步骤o(一)抽提质粒的原理o本实验抽提质粒采用的是碱抽提法。原理是基于染色体DNA与质粒DNA在变性与复性的过程中的差异而达到分离的目的。o一般情况下，染色体DNA在pH7.0-9.0之间，结构是比较稳定的。当pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结构松开。o质粒DNA在这样的pH环境下大部分氢键也断裂，但质粒仍保持超螺旋的闭合环状结构，虽氢键断裂但构型不变。用pH4.8醋酸缓冲液调pH至中性时，质粒DNA很快复性恢复原状，而悬浮在液相中。而染色体DNA不能复性变成长短不一的片段，形成缠绕的网状结构，与细胞中的大分子RNA、蛋白质、SDS等化合
12、物形成复合物在高速离心力的作用下被沉淀下来，从而达到分开的作用，最后用无水乙醇在-20条件下，使质粒沉淀。溶液配方o碱抽提质粒需用三种溶液，分别称为溶液I、III。ooSolution Solution I I 50mM葡萄糖，10mMEDTA(乙二胺四乙酸二钠) 25mm Tris-Hce(PH80) 2mgme溶葡酶ooSolution Solution IIII 200mMNaOH，1SDS(十二烷基硫酸钠)ooSolution Solution IIIIII 3MKAE-HAE的缓冲液(PH4.8) 抽提质粒的步骤1.将菌株(含PRF质粒)挑取一环接种于10 ml肉汤溶液中(含AP10
13、0微克毫升)于37摇床过夜。 2.将长好的菌取5ml倒入5ml离心管中，以4000rpm离心5分钟。3.弃上清，打匀沉淀，加300微升溶液I在冰上放15分钟。(反复轻轻转动)4.加600微升溶液(现配)在冰上5分钟(轻轻转动)。5.再加450微升溶液III，在冰上15分钟(轻轻转动)。6.13000rpm5min，转上清液于另一5ml离心管中 7.用等体积的PCI(约13ml)抽提 (即混匀、摇动后离心分离)8.小心用移液器将上层转入另一离心管中，加2倍体积(26ml)无水乙醇，混匀后放入-20冰箱过夜，以沉淀质粒。9.第二天取出沉淀的离心管，以13000rpm离心5min，倾去乙醇，略微干燥
14、后加100微升无菌水溶解质粒。大肠杆菌感受态的制备（化学法）1.用无菌牙签从平板挑取一个单菌落，转到含有5ml的LB培养基的试管内，37下振摇过夜，次日取菌液1ml到100ml的LB培养基中，37，培养23hrs，然后将菌液在200300rpm培养。待OD6000.30.4时，取出，冰浴1015min。 2.无菌条件下，将菌液转移到灭菌处理过的预冷50ml离心管中。 3.4离心，4000rpm10mins，回收细胞。4.用冰冷的0.1MCaCl210ml重悬菌体，冰浴30min。 5.4离心，4000rpm10mins，弃去上清。 6.加0.3mlCaCl2重新悬浮菌体。 7.4保存，12到24hrs有效。转化的步骤1.混合：吸取100l感受态细胞悬液，加入DNA（V10l，mDNA50ng）轻混，冰浴30min；2.热激：在42热水浴90s，立即冰浴冷却；3.复苏：加入肉汤培养基，在37摇床培养45min；4.涂皿：在倒好的抗性平板上加0.1ml的菌液，涂布均匀，37培养1224hrs。
