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1、实验五 乳制品中金黄色葡萄球菌检测生物学特性-菌体形态及培养特征革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长生物学特性-菌体形态及培养特征大多数菌株能生长在6.5-46之间（最适温度30-37）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.0-7.5）；大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化生物学特性-菌体形态及培养特征好氧生长的细胞产生接触酶；产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水
2、解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。致病性金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为为条件致病菌，菌株致病力的条件致病菌，菌株致病力的条件致病菌，菌株致病力的条件致病菌，菌株致病力的强强弱弱弱弱主要取主要取决于其决于其产产生的生的毒素和侵毒素和侵毒素和侵毒素和侵袭袭性性性性酶酶：a.a.溶血素溶血素溶血素溶血素：外毒素，分：外毒素，分 、 、 、 四种，能四种，能损伤损伤血小板，血小板，破坏溶破坏溶酶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；体
3、，引起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀杀白白白白细细胞素胞素胞素胞素：可破坏人的白：可破坏人的白细细胞和巨噬胞和巨噬细细胞；胞；c.c.血血血血浆浆凝固凝固凝固凝固酶酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体：当金黄色葡萄球菌侵入人体时时，该酶该酶使使血液或血血液或血浆浆中的中的纤维纤维蛋白沉蛋白沉积积于菌体表面或凝固，阻碍吞于菌体表面或凝固，阻碍吞噬噬细细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶酶有关；有关；d.d.脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸酶酶：金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌产产生的脱氧核糖核生的脱氧核糖核酸酸酶酶能耐受高温，可用来作
4、能耐受高温，可用来作为为依据依据鉴鉴定金黄色葡萄球菌；定金黄色葡萄球菌；e.e.肠肠毒素毒素毒素毒素：金黄色葡萄球菌能：金黄色葡萄球菌能产产生数种引起急性胃生数种引起急性胃肠肠炎炎的蛋白的蛋白质质性性肠肠毒素，分毒素，分为为A A、B B、C C、D D、E E五种。五种。致病性葡萄球菌性葡萄球菌性食物中毒食物中毒是葡萄球菌是葡萄球菌肠肠毒素所引起的毒素所引起的疾病，可引疾病，可引发发不同程度的急性胃不同程度的急性胃肠肠炎症状，炎症状，恶恶心、心、呕吐最呕吐最为为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌当金黄色葡萄球菌污污染了含淀粉及水分染了含淀粉及水分较较
5、多的食多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜宜时时，经经8-108-10小小时时即可相当数量的即可相当数量的肠肠毒素。毒素。分布在自然界中广泛存在，空气、水、灰在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘尘及人和及人和动动物的排泄物的排泄物中都可找到。物中都可找到。作作为为人和人和动动物的常物的常见见病原菌，其主要存在于人和病原菌，其主要存在于人和动动物的鼻物的鼻腔、咽喉、腔、咽喉、头发头发上，上，50%50%以上健康人的皮肤上都有金黄色以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其葡萄球菌存在。因而，食品受其污污染的机会很多。染的机会很多
6、。传传播媒介播媒介为为被被该该菌菌污污染的食品，主要染的食品，主要为为淀粉淀粉类类( (如剩如剩饭饭、米面、粥等米面、粥等) )、牛乳及乳制品，以及、牛乳及乳制品，以及鱼鱼、肉、蛋、肉、蛋类类等。被等。被污污染的食物在室温染的食物在室温2020-22-22放置放置5 5小小时时以上以上时时，病菌大量，病菌大量繁殖，并繁殖，并产产生生肠肠毒素。毒素。 流行病学季季节节分布，多分布，多见见于春夏季；于春夏季；中毒食品种中毒食品种类类多，如奶、肉、蛋、多，如奶、肉、蛋、鱼鱼及其制品。及其制品。此外，剩此外，剩饭饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有毒事件也有报报
7、道。上呼吸道感染患者鼻腔道。上呼吸道感染患者鼻腔带带菌率菌率83%83%，所以人畜化，所以人畜化脓脓性感染部位常成性感染部位常成为污为污染源。染源。 流行病学 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠肠毒素毒素毒素毒素是个世界性是个世界性卫卫生生问题问题，在美国由金黄色葡萄球菌在美国由金黄色葡萄球菌肠肠毒素引起的食物中毒毒素引起的食物中毒占整个占整个细细菌性食物中毒的菌性食物中毒的33%33%，加拿大，加拿大则则更多，更多，占占45%45%，我国每年，我国每年发发生的此生的此类类中毒事件也非常多。中毒事件也非常多。流行病学肠肠毒素形成条件：毒素形成条件： 存放温度，在存放温度
8、，在37C37C内，温度越高，内，温度越高，产产毒毒时间时间越越短；短； 存放地点，通存放地点，通风风不良氧分不良氧分压压低易形成低易形成肠肠毒素；毒素； 食物种食物种类类，含蛋白，含蛋白质质丰富，水分多，同丰富，水分多，同时时含一定含一定量淀粉的食物，量淀粉的食物，肠肠毒素易生成。毒素易生成。耐受力几乎所有的消毒几乎所有的消毒试剂试剂以及以及热热加工加工过过程程对对金黄色葡金黄色葡萄球菌都有萄球菌都有严严重的破坏作用重的破坏作用肠肠毒素可耐受毒素可耐受100100 30 30分分钟钟不被破坏。不被破坏。对对于加工于加工过过的食品或食品加工的食品或食品加工设备设备而言，此菌或而言，此菌或其其肠
9、肠毒素的存在通常作毒素的存在通常作为卫为卫生条件差的一种指生条件差的一种指标标。 污染的控制防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌污污染染染染食品食品食品食品 防止防止带带菌人群菌人群对对各种食物的各种食物的污污染：定期染：定期对对生生产产加加工人工人员进员进行健康行健康检查检查，患局部化，患局部化脓脓性感染（如疥性感染（如疥疮疮、手指化、手指化脓脓等）、上呼吸道感染（如鼻等）、上呼吸道感染（如鼻窦窦炎、炎、化化脓脓性肺炎、口腔疾病等）的人性肺炎、口腔疾病等）的人员员要要暂时暂时停止其停止其工作或工作或调换岗调换岗位。位。污染的控制防止金黄色葡萄球菌防止金黄色
10、葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌污污染染染染食品食品食品食品 防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌对对奶及其制品奶及其制品的的污污染：如牛染：如牛奶厂要定期奶厂要定期检查检查奶牛的乳房，不能奶牛的乳房，不能挤挤用患化用患化脓脓性性乳腺炎的牛奶；奶乳腺炎的牛奶；奶挤挤出后，要迅速冷至出后，要迅速冷至-10-10以下，以下，以防毒素生成、以防毒素生成、细细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为为原料，注意低温保存。原料，注意低温保存。污染的控制防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌污污染染染染食品食品食品食品 对对肉制品肉制品加工厂，患
11、局部化加工厂，患局部化脓脓感染的禽、畜尸体感染的禽、畜尸体应应除去病除去病变变部位，部位，经经高温或其他适当方式高温或其他适当方式处处理后理后进进行加工生行加工生产产。污染的控制防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌防止金黄色葡萄球菌肠肠毒素毒素毒素毒素的生成的生成的生成的生成 应应在低温和通在低温和通风风良好的条件下良好的条件下贮贮藏食物，以防藏食物，以防肠肠毒素形成；毒素形成； 在气温高的春夏季，食物置冷藏或通在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风风阴凉地方阴凉地方也不也不应应超超过过6 6小小时时，并且食用前要，并且食用前要彻彻底加底加热热。检测步骤-增菌利用金黄色葡萄球菌利
12、用金黄色葡萄球菌耐耐盐盐的特性（可耐受的特性（可耐受15%15%的的氯氯化化钠钠），用含），用含10%10%氯氯化化钠钠的胰酪的胰酪胨胨大豆肉大豆肉汤汤增增菌。菌。检测步骤-分离血平板血平板：金黄色葡萄球菌可：金黄色葡萄球菌可以以产产生溶血素，因此在血平生溶血素，因此在血平板上板上产产生明生明显显的溶血的溶血环环。血平板上其血平板上其典型菌落典型菌落呈金黄呈金黄色，有色，有时时也也为为白色，大而突白色，大而突起，起，圆圆形，不透明，表面光形，不透明，表面光滑，有溶血圈。滑，有溶血圈。 检测步骤-分离BPBP平板平板：胰蛋白胰蛋白胨胨、牛肉膏牛肉膏和和酵母膏酵母膏提供碳源、氮源、硫、提供碳源、氮
13、源、硫、维维生素和痕量生素和痕量矿矿物元素物元素丙丙酮酮酸酸钠钠是一种生是一种生长长促促进剂进剂亚亚碲酸碲酸盐盐对对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落的菌株有毒性，并使菌落产产生黑色生黑色卵黄卵黄提供提供营营养和有利于养和有利于观观察卵磷脂察卵磷脂环环甘氨酸甘氨酸和和氯氯化化锂锂对对金黄色葡萄球菌以外的其它菌金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。株有抑制作用。检测步骤-分离在在BPBP平板上其平板上其典型菌落典型菌落为为：圆圆形，光滑突起，湿形，光滑突起，湿润润，直径，直径2-3mm2-3mm，颜颜色呈灰色到黑玉色，色呈灰色到黑玉色，边缘边
14、缘常常为为淡色（米黄色或灰白色略淡色（米黄色或灰白色略带带灰色或黄色的白色）灰色或黄色的白色），周，周围为围为一一混混浊带浊带，在其外，在其外缘缘常有一常有一透明圈透明圈。用。用接种接种针针接触菌落似有黄油接触菌落似有黄油树树胶的粘稠感。胶的粘稠感。偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带浊带及透明及透明圈外，其他外圈外，其他外观观基本相同。基本相同。长长期保存的冷期保存的冷冻冻或干燥食品中所分离的菌落，其或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常黑色常较较典型菌落淡些，且外典型菌落淡些，且外观观可能粗燥，可能粗燥，质质地地较较干燥。干燥。 检测步骤-鉴定金黄色葡萄球菌可以
15、金黄色葡萄球菌可以产产生生凝固凝固酶酶，因此，因此对对其其鉴别鉴别的主要的主要实验实验是是测测定其凝固定其凝固酶酶。对对于凝固不完全的菌株，可以通于凝固不完全的菌株，可以通过过一些其他一些其他实验实验来来进进一步一步确确认认，例如：，例如：厌厌氧葡萄糖氧葡萄糖发发酵、溶葡萄酵、溶葡萄球菌球菌酶酶敏感性敏感性实验实验、耐、耐热热核酸核酸酶实验酶实验等。等。所有所有这这些些实验实验不能作不能作为鉴别为鉴别其其产产毒与否的依据。毒与否的依据。一、一、实验目的要求目的要求了解食品的了解食品的质质量与金黄色葡萄球菌量与金黄色葡萄球菌检验检验的意的意义义。掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。掌握金黄色葡萄球菌
16、的生物学特性。掌握金黄色葡萄球菌掌握金黄色葡萄球菌检验检验的生化的生化试验试验的操作方法的操作方法和和结结果的判断。果的判断。掌握食品中金黄色葡萄球菌掌握食品中金黄色葡萄球菌检验检验的方法和技的方法和技术术。二、原理二、原理二、原理二、原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲饲料、食料、食品品( (剩剩饭饭、糕点、牛奶、肉品等、糕点、牛奶、肉品等) )以及人和以及人和动动物的体表粘膜物的体表粘膜等等处处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤金黄色葡
17、萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织组织炎炎症，症，还还能能产产生生肠肠毒素。如果在食品中大量生毒素。如果在食品中大量生长长繁殖，繁殖，产产生生毒素，人毒素，人误误食了含有毒素的食品，就会食了含有毒素的食品，就会发发生食物中毒，故生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌食品中存在金黄色葡萄球菌对对人的健康是一种潜在危人的健康是一种潜在危险险，检查检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际实际意意义义。金黄色葡萄球菌能金黄色葡萄球菌能产产生凝固生凝固酶酶，使血，使血浆浆凝固，多数致病菌凝固，多数致病菌株能株能产产生溶血毒素，使血生溶血毒素，使血琼琼脂平板菌落周脂平板菌
18、落周围围出出现现溶血溶血环环，在在试试管中出管中出现现溶血反溶血反应应。这这些是些是鉴鉴定致病性金黄色葡萄球定致病性金黄色葡萄球菌的重要指菌的重要指标标。三、三、三、三、试剂试剂和和和和仪仪器器器器（一）最先准（一）最先准（一）最先准（一）最先准备备的器材的器材的器材的器材规规格名称格名称数量数量用途用途1、500ml三角瓶1个7.5%氯化钠肉汤2、500ml三角瓶1个10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 3、250ml三角瓶4个制血培养基等4、10100mm试管6支血浆凝固酶试验5、1ml移液管2支6、10ml移液管2 支7、直径为90mm平皿 12套 制血平板、B-P平板8、250ml量筒1支（二）
19、应灭菌的其它器材剪刀1把不锈钢汤匙1把 称量纸适量（三）（三）应制制备的培养基的培养基培养基总量所用容器7.5%7.5%氯化化钠肉肉汤 225ml/225ml/瓶瓶1 1瓶瓶 500ml500ml三角瓶三角瓶10%10%氯化化钠胰酪胰酪胨大豆肉大豆肉汤 225ml/225ml/瓶瓶1 1瓶瓶 500ml500ml三角瓶三角瓶血血琼脂脂 100ml/100ml/瓶瓶1 1瓶瓶 250ml250ml三角瓶三角瓶B BP P培养基培养基 95ml/95ml/瓶瓶1 1瓶瓶 250ml250ml三角瓶三角瓶兔血液兔血液 5ml5mlA.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤A.1.1 A.
20、1.1 成分成分胰酪胰酪胨胨（或胰蛋白（或胰蛋白胨胨） 17.0 g 17.0 g 植物蛋白植物蛋白胨胨（或（或大豆蛋白大豆蛋白胨胨） 3.0 g 3.0 g 氯氯化化钠钠 100.0 g 100.0 g 磷酸磷酸氢氢二二钾钾 2.5 g 2.5 g 丙丙酮酮酸酸钠钠 10.0 g 10.0 g 葡萄糖葡萄糖 2.5 g 2.5 g 蒸蒸馏馏水水 1 000 mL pH 7.30.21 000 mL pH 7.30.2A.1.2 A.1.2 制法制法将上述成分混合，加将上述成分混合，加热热，轻轻搅轻轻搅拌并溶解，拌并溶解，调节调节 pHpH，分装，每瓶，分装，每瓶 225 mL225 mL，1
21、21 121 高高压灭压灭菌菌 15 15 minmin。A.2 7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤A.2.1 成分蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 75 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4A.2.2 制法将上述成分加热溶解，调节 pH，分装，每瓶 225 mL，121 高压灭菌 15 min。A.3 血琼脂平板血琼脂平板A.3.1 A.3.1 成分：豆粉成分：豆粉琼琼脂（脂（pH7.4pH7.47.67.6） 100 mL 100 mL 脱脱纤维纤维羊羊血（或兔血）血（或兔血） 5 mL5 mL10 mL10 mLA.3.2 A.3.2 制法：加制法：加热热溶化溶化琼琼脂，
22、冷却至脂，冷却至 50 50 ，以无菌操作，以无菌操作加入脱加入脱纤维纤维羊血，羊血，摇摇匀，匀，倾倾注平板。注平板。血血琼琼脂平板：脂平板：蛋白蛋白胨胨10g 10g 牛肉膏牛肉膏5g 5g 氯氯化化钠钠5g 5g 琼琼脂脂1020g 1020g 蒸蒸馏馏水水1000ml 1000ml 煮沸至充分溶解，高煮沸至充分溶解，高压灭压灭菌菌1520min 1520min 待冷却至待冷却至5050 左左右右时时加入加入50ml50ml抗凝羊血（除去抗凝羊血（除去纤维纤维）或兔血。）或兔血。摇摇匀或匀或搅搅匀匀倒平板或倒平板或试试管斜面。管斜面。 温度温度过过高，培养基呈棕褐色；温度高，培养基呈棕褐色
23、；温度过过低低则则不利于血液与培养基混匀。不利于血液与培养基混匀。 A.4 BairdParker琼脂平板琼脂平板A.4.1 成分胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 酵母膏 1.0 g 丙酮酸钠 10.0 g 甘氨酸 12.0 g氯化锂（LiCl6H2O） 5.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 950 mL pH 7.00.2A.4.2 增菌剂的配法30%卵黄盐水 50 mL 与经过除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10 mL 混合，保存于冰箱内。A.4.3 制法将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节 pH。分装每瓶 95 mL，121 高压灭菌 15 min。临用时加热溶化琼脂
24、，冷至 50 ，每 95 mL 加入预热至 50 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48 h。称取本品63 克,加入950ml蒸馏水中,加热煮沸溶解，分装,121高压灭菌15分钟备用。冷至50，每95ml加入预热至50的卵黄亚碲酸钾增菌液(04-025)配套试剂（用法与用量见配套试剂说明）。摇匀后倾注平皿。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h）四、四、实验内容内容 （一）、增菌培养法（一）、增菌培养法样品品处理理选择性增菌性增菌选择性平板分性平板分离离血血浆凝固凝固酶试验鉴别结果果报告告第一天第一天 样品品处理和
25、增菌培养理和增菌培养（一）、（一）、（一）、（一）、样样品品品品处处理理理理固体或半固体食品：固体或半固体食品：固体或半固体食品：固体或半固体食品：以无菌操作称取以无菌操作称取25g25g样样品，放入装有品，放入装有225mL225mL灭灭菌生理菌生理盐盐水的水的灭灭菌均菌均 质质杯内，于杯内，于8000r/min8000r/min均均质质1 12min2min，制成，制成1:101:10样样品匀液。品匀液。 液体食品液体食品液体食品液体食品: :：用：用灭灭菌吸管吸取菌吸管吸取25mL25mL样样品，放入装有品，放入装有225mL225mL灭灭菌生理菌生理盐盐水的水的灭灭菌玻璃瓶内菌玻璃瓶内
26、 ( (瓶内瓶内预预置适当数量的置适当数量的玻璃珠玻璃珠) )，经经充分振充分振摇摇制成制成1:101:10样样品匀液。品匀液。（二）、增菌培养（二）、增菌培养（二）、增菌培养（二）、增菌培养接种操作接种操作接种操作接种操作：吸取：吸取5mL5mL稀稀释释液接入液接入7.5%NaCl7.5%NaCl肉肉肉肉汤汤或胰蛋白或胰蛋白胨胨肉肉汤汤中。中。37C37C培养培养2424小小时时。培养：培养：培养：培养：放于放于361361培养培养24h24h。培养培养培养培养结结果：果：果：果：在在NaClNaCl肉肉肉肉汤汤中呈混中呈混浊浊生生长长，胰蛋白，胰蛋白胨胨肉肉汤汤中有中有时时液体澄清，菌量多
27、液体澄清，菌量多时时呈混呈混浊浊生生长长。第二天第二天第二天第二天 接种接种接种接种选择选择性平板性平板性平板性平板进进行分离培养行分离培养行分离培养行分离培养（一）、接种（一）、接种（一）、接种（一）、接种选择选择性平板性平板性平板性平板取增菌液取增菌液1 1环环，划，划线线接种于接种于血平板血平板血平板血平板或或B BP P平板平板平板平板。（二）、培养（二）、培养（二）、培养（二）、培养 放于放于361361培养培养24h24h。第三天第三天第三天第三天 观观察分离察分离察分离察分离结结果、果、果、果、镜检镜检、做血、做血、做血、做血浆浆凝固凝固凝固凝固酶试酶试验验（一）、（一）、（一）
28、、（一）、观观察分离察分离察分离察分离结结果果果果结结果果果果：金黄色葡萄球菌，在：金黄色葡萄球菌，在血平板血平板血平板血平板上呈：金黄或上呈：金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围围有溶血圈；有溶血圈；在在Baird-ParkerBaird-Parker平板平板平板平板上：菌落上：菌落为圆为圆形，直径形，直径2-2-3mm3mm，颜颜色灰或黑色，周色灰或黑色，周围围有一有一浑浊带浑浊带，在其外，在其外层层有一透明圈。有一透明圈。 （二）、革（二）、革（二）、革（二）、革兰兰氏染色、氏染色、氏染色、氏染色、镜检镜检操作：革操作：革操作：革操作：革兰兰氏染色氏染
29、色氏染色氏染色镜检镜检结结果：果：果：果：金黄色葡萄球菌，革金黄色葡萄球菌，革兰兰氏阳性，氏阳性，显显微微镜镜下下呈葡萄状排列无芽胞，直径呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5-1m0.5-1m。（三）、（三）、（三）、（三）、结结果果果果报报告：告：告：告：综综合形合形态态特征，血平板情况以及血特征，血平板情况以及血浆浆凝固凝固酶试验酶试验结结果，判果，判别检样别检样有否金黄色葡萄球菌作出有否金黄色葡萄球菌作出报报告。告。金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验取肉汤培养物0.5mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合,置 361培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,
30、以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或0.9无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。 阳性和阴性对照阳性和阴性对照血浆凝固酶试验(1)取洁净玻片一张，于两端各加兔血浆一滴。(2)用接种环取金黄色葡萄球菌苔一环，在玻片一端兔血浆中研磨混匀，接种环灭菌后再取白色葡萄球菌苔一环，在另一端兔血浆中研磨均匀。(3)观察兔血浆有无凝集现象。四四四四. .检验检验和控制和控制和控制和控制1 1金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的检验检验样样品品处处理：无菌取理：无菌取25g25g或或25mL25mL食品食品样样品
31、，放品，放入入225mL225mL灭灭菌生理菌生理盐盐水中均水中均质质，制成，制成10-110-1稀稀释释液。液。增菌培养：将增菌培养：将10-110-1稀稀释释液接入液接入7.5%NaCl7.5%NaCl肉肉汤汤或胰蛋白或胰蛋白胨胨肉肉汤汤中，中，37C37C培养培养2424小小时时。分离培养：将上述稀分离培养：将上述稀释释液或培养液分液或培养液分别别划划线线血平板和血平板和Baird-ParkerBaird-Parker平板，置平板，置37C37C培养培养24-4824-48小小时时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周落
32、，大而凸起，表面光滑，周围围有溶血圈。在有溶血圈。在Baird-ParkerBaird-Parker平板上菌落平板上菌落为圆为圆形，直径形，直径2-3mm2-3mm，颜颜色灰或黑色，周色灰或黑色，周围围有一有一浑浊带浑浊带。染色染色观观察：从平板上挑取可疑性菌落察：从平板上挑取可疑性菌落进进行革行革兰兰氏染色，金黄色葡萄球菌氏染色，金黄色葡萄球菌为为革革兰兰氏阳性，氏阳性，显显微微镜镜下呈葡萄状排列无芽胞、下呈葡萄状排列无芽胞、荚荚膜，直径膜，直径0.5-1m0.5-1m。血血浆浆凝固凝固酶试验酶试验：吸取：吸取0.5mL0.5mL兔血兔血浆浆与与0.5mL0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉金黄
33、色葡萄球菌肉浸液肉汤汤2424小小时时培养物充分混培养物充分混匀，置匀，置361C361C培养，每隔半小培养，每隔半小时观时观察一次，察一次，连续连续观观察察6 6小小时时，出，出现现凝固，即将小凝固，即将小试试管管倾倾斜或倒置斜或倒置时时，内容物不流内容物不流动动，判，判为为阳性。同阳性。同时时做阴阳性做阴阳性对对照。照。耐耐热热核酸核酸酶试验酶试验：将：将2424小小时时肉肉汤汤培养物沸水培养物沸水浴浴处处理理15min15min，用接种，用接种环环划划线线刺种于甲苯胺刺种于甲苯胺兰兰- -DNADNA平板，平板，361C361C培养培养2424小小时时，在刺种，在刺种线线周周围围出出现现
34、淡粉色者淡粉色者为为阳性。本阳性。本试验试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为为阳阳性。性。血血浆浆凝固凝固酶试验酶试验：吸取：吸取0.5mL0.5mL兔血兔血浆浆与与0.5mL0.5mL金金黄色葡萄球菌肉浸液肉黄色葡萄球菌肉浸液肉汤汤2424小小时时培养物充分混匀，培养物充分混匀，置置361C361C培养，每隔半小培养，每隔半小时观时观察一次，察一次，连续观连续观察察6 6小小时时，出，出现现凝固，即将小凝固，即将小试试管管倾倾斜或倒置斜或倒置时时，内，内容物不流容物不流动动，判，判为为阳性。同阳性。同时时做阴阳性做阴阳性对对照。照。耐耐热热核酸核酸酶试验酶试验：将：将2424小小时时肉肉汤汤培
35、养物沸水培养物沸水浴浴处处理理15min15min，用接种，用接种环环划划线线刺种于甲苯胺刺种于甲苯胺兰兰- -DNADNA平板，平板，361C361C培养培养2424小小时时，在刺种，在刺种线线周周围围出出现现淡粉色者淡粉色者为为阳性。本阳性。本试验试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为为阳阳性。性。问题问题与与讨论讨论：1.1.血血浆浆与血清的区与血清的区别别是什么？是什么？为为何凝固何凝固酶试验酶试验需要用血需要用血浆浆而而不是血清？不是血清？2.2.葡萄球菌葡萄球菌产产生的凝固生的凝固酶酶有几种？有几种？实验实验室室检测检测血血浆浆凝固凝固酶酶的的试验试验方法有几种？每种方法方法有几种？每
36、种方法测测定的物定的物质质有何不同？哪种方法有何不同？哪种方法最好？最好？3.3.血血浆浆中的抗凝中的抗凝剂剂常用的有肝素、枸常用的有肝素、枸橼橼酸酸盐盐、EDTAEDTA等，血等，血浆浆凝固凝固酶试验酶试验中所用的血中所用的血浆浆抗凝抗凝剂剂以哪种以哪种为为最佳？是否可用最佳？是否可用脱脱纤维纤维血血浆浆？为为什么？什么？4.4.血血浆浆凝固凝固酶试验对酶试验对血血浆浆来源是否有要求？比如来源是否有要求？比如动动物血、人物血、人血等，哪种血源最佳？血等，哪种血源最佳？为为什么？什么？5.5.做血做血浆浆凝固凝固酶试验时酶试验时需需对对血血浆进浆进行稀行稀释释，你，你认为认为血血浆浆的最的最佳稀佳稀释释比例是多少？血比例是多少？血浆过浆过稀或稀或过浓对结过浓对结果有影响果有影响吗吗？6.6.待待测测的疑似葡萄球菌的疑似葡萄球菌为为何要配制成何要配制成浓浓菌液？菌液？浓浓度低了度低了对结对结果果观观察有影响察有影响吗吗？是否可直接将待？是否可直接将待测测菌加入稀菌加入稀释释血血浆浆中？中？7.7.用用Slidex Staph-kitSlidex Staph-kit（葡萄球菌凝聚（葡萄球菌凝聚鉴鉴定定试剂试剂盒）盒）检测时检测时，哪些菌可能引起假阳性？此哪些菌可能引起假阳性？此时时你如何辨你如何辨别别？
