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1、第七章第七章 外源化学物致突变作用外源化学物致突变作用第一节第一节概概述述一、基本概念一、基本概念l遗传遗传(inheritance)：生物物种在漫长的自然选择和生生物物种在漫长的自然选择和生物进化过程中，以相对稳定的生命形式存在于自然界中，物进化过程中，以相对稳定的生命形式存在于自然界中，并能持续不断的繁衍后代，这个过程就是遗传。并能持续不断的繁衍后代，这个过程就是遗传。l遗传是保持其种族特性的根本。遗传是保持其种族特性的根本。这种长期保存遗传性状这种长期保存遗传性状相对稳定的能力，与遗传物质相对稳定的能力，与遗传物质DNA的特殊结构及其精确的特殊结构及其精确的复制与修复方式密不可分。的复制
2、与修复方式密不可分。一、基本概念一、基本概念l变异变异(variation)：遗传的稳定是相对的遗传的稳定是相对的l一方面生物的遗传物质在自我复制过程中可能发生改变；一方面生物的遗传物质在自我复制过程中可能发生改变；l另一方面生物个体发育在受到复杂的内外环境条件影响下，另一方面生物个体发育在受到复杂的内外环境条件影响下，性状的发育可能有所不同。于是在亲子之间或子代个体之性状的发育可能有所不同。于是在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。l变异是生物物种推陈出新的来源变异是生物物种推陈出新的来源。从现代基因论的观点出发，。从现代基因论
3、的观点出发，只有起源于基因和染色体的变异才能遗传。只有起源于基因和染色体的变异才能遗传。l突变突变(mutation)：生物体遗传物质发生的突然的、根本的、生物体遗传物质发生的突然的、根本的、可遗传的变化。可遗传的变化。l因为这种变化起源于基因和染色体，所以突变实际上是因为这种变化起源于基因和染色体，所以突变实际上是遗传遗传物质的一种可遗传的变异物质的一种可遗传的变异。一、基本概念一、基本概念l致突变作用致突变作用(mutagenesis)：外源因素特别是化学因子引起外源因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随同细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且这种改变可随
4、同细胞分裂过程而传递。简单的说细胞分裂过程而传递。简单的说，l突变的发生及其过程即为致突变作用；突变的发生及其过程即为致突变作用；l突变突变(mutation)是致突变作用的后果。是致突变作用的后果。l致突变物致突变物(mutagen)：指能够引起突变的物质，又称诱变剂。指能够引起突变的物质，又称诱变剂。一、基本概念一、基本概念致突变性致突变性 “ ” 遗传毒性遗传毒性l致突变性（致突变性（mutagenicity）：）：指引起遗传物质发生突变的能指引起遗传物质发生突变的能力，是精确的概念，在一个实验群体中突变率可定量检测。力，是精确的概念，在一个实验群体中突变率可定量检测。l遗传毒性（遗传毒
5、性（genetictoxicity）：）：指对基因组的损害能力，包指对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性以及其他各种不同效应。括对基因组的毒作用引起的致突变性以及其他各种不同效应。遗传毒性的概念广泛，包括致突变性，其效应可能转变固定遗传毒性的概念广泛，包括致突变性，其效应可能转变固定为突变，也可能被修复。为突变，也可能被修复。l遗遗传传毒毒理理学学(genetictoxicology)：主主要要研研究究化化学学性性和和放放射射性性物物质质的的致致突突变变作作用用以以及及人人类类接接触触致致突突变变物物可可能能引引起起的的健健康损伤效应。康损伤效应。l遗传毒理学主要研究内容：遗
6、传毒理学主要研究内容：l致突变作用及机制；致突变作用及机制；l应用检测系统发现和探究致突变物；应用检测系统发现和探究致突变物；l提出评价致突变物健康危害的方法。提出评价致突变物健康危害的方法。一、基本概念一、基本概念二、遗传学基础二、遗传学基础l1.DNA与基因与基因lDNA：由由脱脱氧氧核核糖糖、磷磷酸酸及及碱碱基基组组成成，其其基基本本成成分分为为四四种种核核苷苷酸酸，形形成成双双螺螺旋旋结结构构，具具有有精精确确复复制制和和高高度度保保真真特特性，储存了所有的遗传信息。性，储存了所有的遗传信息。l基基因因(gene)：是是DNA分分子子中中最最小小的的完完整整功功能能单单位位。基基本本作
7、作用用是是决决定定蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构，即即每每个个基基因因决决定定一一条条多多肽肽链或一种酶。基因是生物遗传信息的携带者。链或一种酶。基因是生物遗传信息的携带者。l基因组基因组(genome)：生物体的一套完整单体的遗传物质。生物体的一套完整单体的遗传物质。二、遗传学基础二、遗传学基础l2.染色质与染色体染色质与染色体l在在分分裂裂间间期期细细胞胞核核中中，光光镜镜下下可可见见一一种种能能被被碱碱性性染染料料着着色色的的物物质质，即即染染色色质质(chromatin)。染染色色质质由由DNA、蛋蛋白白、及及少量的少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。组成，形似串珠状的复合体。l在
8、在间间期期细细胞胞核核中中，一一般般没没有有染染色色体体结结构构，只只有有在在细细胞胞分分裂裂时时，染染色色质质才才螺螺旋旋化化并并折折叠叠成成染染色色体体(chromosome)，故故染染色质与染色体的物质组成是相同的。色质与染色体的物质组成是相同的。l将将体体细细胞胞的的全全部部染染色色体体按按大大小小形形态态等等方方式式排排列列起起来来即即构构成成细胞的核型细胞的核型。每一个生物种属的核型是固定的。每一个生物种属的核型是固定的。二、遗传学基础二、遗传学基础l3.体细胞和生殖细胞体细胞和生殖细胞l体细胞体细胞(somaticcell)：多数是二倍体多数是二倍体(diploid)细胞，含细胞
9、，含有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会传递给下一代。有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会传递给下一代。l生殖细胞生殖细胞(gemcell)：往往是单倍体，其染色体改变可以往往是单倍体，其染色体改变可以传给下一代。传给下一代。l显性突变无论纯合子还是杂合子，均出现表型异常。显性突变无论纯合子还是杂合子，均出现表型异常。l隐性突变如为纯合子，将出现表型异常，如为杂合子，隐性突变如为纯合子，将出现表型异常，如为杂合子，则为表型正常的携带者。则为表型正常的携带者。二、遗传学基础二、遗传学基础l4.基因型与表型基因型与表型l基因型：基因型：指控制生物性状的基因组成，是生物体遗传性指控制生物性状的基
10、因组成，是生物体遗传性状发育的内因，是表型形成的根据。状发育的内因，是表型形成的根据。l表型：表型：指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。表型是不同基因之间以及基因与环境之间复杂的表现。表型是不同基因之间以及基因与环境之间复杂的相互作用的结果。也就是说基因型决定表型可能发育的相互作用的结果。也就是说基因型决定表型可能发育的范围，会产生怎样的表型取决于生长发育所处的环境。范围，会产生怎样的表型取决于生长发育所处的环境。l环境因素对遗传所起的作用必须通过基因型才能实现，环境因素对遗传所起的作用必须通过基因型才能实现，外界环境是基因型转变成具体表型
11、的必要条件。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。二、遗传学基础二、遗传学基础l5.细胞周期、有丝分裂与减数分裂细胞周期、有丝分裂与减数分裂l细胞周期：细胞周期：指细胞一次分裂结束后开始生长，到下一次分指细胞一次分裂结束后开始生长，到下一次分裂终末所经历的过程。裂终末所经历的过程。l细胞周期分为四个时期：细胞周期分为四个时期：lG1期是细胞进行急剧合成的时期期是细胞进行急剧合成的时期lS期完成期完成DNA复制复制lG2期为有丝分裂做准备期为有丝分裂做准备lM期是有丝分裂期期是有丝分裂期l有丝分裂有丝分裂(mitosis)：指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成指细胞核分裂的过程，一个细胞由此
12、生成两个子细胞，每个子细胞具有与亲代细胞完全相同的染色体。两个子细胞，每个子细胞具有与亲代细胞完全相同的染色体。l有丝分裂中期染色体进一步浓缩成典型的形态，且分散排列在有丝分裂中期染色体进一步浓缩成典型的形态，且分散排列在赤道面上，赤道面上，中期很适合做染色体的形态和结构方面的研究中期很适合做染色体的形态和结构方面的研究。l减数分裂减数分裂(meiosis)：是一种特殊的有丝分裂，通过两个细胞周是一种特殊的有丝分裂，通过两个细胞周期，细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，使染色体数目减期，细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，使染色体数目减少一半，成为单倍体。少一半，成为单倍体。二、遗传学基础二、
13、遗传学基础Thecourseofmitosis第二节第二节化学物致突变的类型化学物致突变的类型突变的分类突变的分类l自发突变自发突变(spontaneousmutation)l是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。的突变。l特点：特点：自发突变的发生过程长，频率极低自发突变的发生过程长，频率极低,与物种的进与物种的进化有关。化有关。l诱发突变诱发突变(inducedmutation)l是指人为的造成突变是指人为的造成突变。它已被农、林、牧、渔业和园艺。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。学家利用来培育和选
14、择新种或良种。l特点：特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。对人类产生危害。突变的分类突变的分类l基因突变基因突变(genemutation)：一个或几个一个或几个DNA碱基对的改变。碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。等表型改变来判断。l染色体畸变染色体畸变(chromosomeaberration)：染色体的结构及数目染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。改变，可用光学显微镜进行观察。l染色体结构改变染色体结构改变l染
15、色体数目改变染色体数目改变一、基因突变一、基因突变l基因突变：基因突变：指基因中指基因中DNA序列的变化。因为基因突变限制序列的变化。因为基因突变限制在一个特定的部位，故称为在一个特定的部位，故称为点突变点突变(pointmutation)。l突变基因：突变基因：存在突变的基因存在突变的基因野生型基因：野生型基因：没有发生突变的基因没有发生突变的基因l基因突变可分为两种类型：基因突变可分为两种类型：l碱基置换碱基置换(basesubstitution)l移码突变移码突变(frameshiftmutation)一、基因突变一、基因突变l1.碱基置换碱基置换(basesubstitution)l某
16、一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。l当当DNA链链上上某某一一碱碱基基由由于于致致突突变变物物作作用用而而脱脱落落或或其其配配对对性性能能发发生生改改变变，在在DNA复复制制过过程程中中该该DNA互互补补链链上上的的相相应应位位点点配配上上一一个个错错误误的的碱碱基基，即即错错误误配配对对(mispairing)。这这一一错错误误配配对对的的碱碱基基在在下下一一次次DNA复复制制时时，按按正正常常规规律律配配对对，于是原来的碱基对被错误碱基对所置换，称于是原来的碱基对被错误碱基对所置换，称碱基置换碱基置换。A A C TG G CT TG A C C G
17、A A C T G G CT TG A T C GT TG A C C GA A CT G G CA A C T G G CT T G A C C GT T G A TC GA A C T A G CA A C T G G CT T G A C C GT T G A C C GA A C T G G CParental DNADNA replicationFirst generation progeny3553Second generation progenyWild typeMUTANTWild typeWild typeDNA replicationMismatch (about 1/10
18、00 base additions)碱基置换的分类碱基置换的分类l转换转换(transition)：指原来的嘌呤被另一个嘌呤所取代或指原来的嘌呤被另一个嘌呤所取代或原来的嘧啶被另一个嘧啶所取代。原来的嘧啶被另一个嘧啶所取代。l颠换颠换(transvertion)：指原来的嘌呤被另一个嘧啶所取代指原来的嘌呤被另一个嘧啶所取代或原来的嘧啶被另一个嘌呤所取代。或原来的嘧啶被另一个嘌呤所取代。碱基置换的后果碱基置换的后果l同义突变：同义突变：一个氨基酸可有一个氨基酸可有26种密码子，当密码子种密码子，当密码子的一个碱基被另一个碱基所取代时，密码子的意义恰恰没的一个碱基被另一个碱基所取代时，密码子的意义
19、恰恰没有改变，即同义突变。有改变，即同义突变。l丝氨酸的密码子是丝氨酸的密码子是UCU、UCC、UCA、CCG、AUG、AGC共有共有6种，由于碱基取代，使种，由于碱基取代，使mRNA上的上的UCG转换成转换成UCU、UCC、UCA，仍是其密码子。，仍是其密码子。l错义突变：错义突变：密码子中某一碱基为另一碱基取代后，密码子的密码子中某一碱基为另一碱基取代后，密码子的意义改变，成为另一种氨基酸的密码子。如意义改变，成为另一种氨基酸的密码子。如AGU（丝氨酸）变（丝氨酸）变成了成了GGU（甘氨酸），则（甘氨酸），则mRNA指导合成的肽链中的丝氨酸变指导合成的肽链中的丝氨酸变成了甘氨酸。成了甘氨酸
20、。l致死突变：致死突变：发生在必需基团上，严重影响蛋白质功能。发生在必需基团上，严重影响蛋白质功能。l渗漏突变：渗漏突变：突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与突变的产物仍有部分活性，表现型介于突变型与野生型之间。野生型之间。l中性突变：中性突变：突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改突变不影响或基本不影响蛋白质的功能，性状改变不明显。变不明显。l无义突变：无义突变：碱基取代的结果是使碱基取代的结果是使mRNA上的密码子转上的密码子转变成为终止密码变成为终止密码UAA、UAG、UGA时，出现翻译过程停时，出现翻译过程停止，肽链延长提前结束。止，肽链延长提前结束。l链终止突变：链终止突变
21、：指无义突变使肽链过早终止。指无义突变使肽链过早终止。l终止密码突变：终止密码突变：碱基取代的结果是使碱基取代的结果是使mRNA的终止密码的终止密码转变成某种氨基酸的密码，则合成的肽链将延长到出现下转变成某种氨基酸的密码，则合成的肽链将延长到出现下一个终止密码才结束。一个终止密码才结束。l延长突变：延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象。结果产生过长的肽链的现象。l2.移码突变移码突变(frameshiftmutation)l发生一对或几对发生一对或几对（3对除外）对除外）碱基减少或增加，以致从受损碱基减少或增加，以致从受
22、损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。正常的氨基酸。l由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变。符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变。l如果减少或增加的碱基对刚好是如果减少或增加的碱基对刚好是3对，则基因产物的肽链中对，则基因产物的肽链中仅减少或增加一个氨基酸，其后果与碱基置换相似，故不包仅减少或增加一个氨基酸，其后果与碱基置换相似，故不包括在移码突变范畴。括在移码突变范畴。一、基因突变一、
23、基因突变移码突变的结果移码突变的结果l错义突变：错义突变：从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变。酸序列完全改变。l无义突变：无义突变：使读码框架改变其中某一点，形成无义密码使读码框架改变其中某一点，形成无义密码（UAA，UAG及及UGA），不代表任何氨基酸，产生一个无），不代表任何氨基酸，产生一个无功能的肽链片段。功能的肽链片段。l移码突变较易成为致死性突变。移码突变较易成为致死性突变。二、染色体结构畸变二、染色体结构畸变l染色体结构畸变染色体结构畸变(chromosomeaberration)：指染色体的结构改变，指染色体的结构改
24、变，它是指遗传物质大的改变，一般可在细胞有丝分裂中期通过光它是指遗传物质大的改变，一般可在细胞有丝分裂中期通过光学显微镜检查发现。学显微镜检查发现。l染色单体型畸变染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)：畸变涉及复制畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的一条，损伤发生在染色体中两条染色单体中的一条，损伤发生在DNA复制后；复制后；l染色体型畸变染色体型畸变(chromosome-typeaberration)：畸变涉及复制畸变涉及复制染色体中两条染色单体，损伤发生在染色体中两条染色单体，损伤发生在DNA复制前。复制前。l染色体结构异常是染色体或染色单体断裂所致。当断端
25、不发染色体结构异常是染色体或染色单体断裂所致。当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常。生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常。染色体结构异常的类型染色体结构异常的类型l缺失缺失(deletion)：染色体上丢失了一个片段。染色体上丢失了一个片段。l重复重复(duplication)：在一套染色体里，一个染色体片在一套染色体里，一个染色体片段出现不止一次。段出现不止一次。l倒位倒位(inversion)：一个染色体片段被颠倒了，如颠倒一个染色体片段被颠倒了，如颠倒的片段包括着丝点，称为的片段包括着丝点，称为臂间倒位臂间倒位(pericentdcimer-Sion)；
26、如不包括着丝点则称为如不包括着丝点则称为臂内倒位臂内倒位(paracentricinversion)。l易位易位(translocation)：一个染色体片段的位置发生改一个染色体片段的位置发生改变。最常见的是变。最常见的是相互易位相互易位(recipromo），涉及两个非同源，涉及两个非同源染色体片段的交换。染色体片段的交换。染色体畸变染色体畸变裂裂隙隙(gap)断断裂裂(break)断断片片(fragment)和和缺缺失失(deletion)微微小小体体(minutebody)无无着着丝丝点点环环环环状状染染色色体体双双着着丝丝点点染染色色体体倒倒位位(inversion)易易位位(tra
27、nslocation)插插入入(insertion)和和重重复复(duplication)辐辐射射体体三、染色体数目改变三、染色体数目改变l非整倍体非整倍体(aneuploidy)和多倍体和多倍体(polyploidy)细胞的染色细胞的染色体数目不同于正常细胞染色体数目，称为基因组突变，即体数目不同于正常细胞染色体数目，称为基因组突变，即基因组中染色体数目改变。基因组中染色体数目改变。l非整倍体：非整倍体：指增加或减少一条或几条染色体；指增加或减少一条或几条染色体；l多倍体：多倍体：指染色体数目成倍增加。指染色体数目成倍增加。第三节第三节化学物致突变作用化学物致突变作用的机制及后果的机制及后果
28、一、引起突变的一、引起突变的DNA变化变化l碱基损伤碱基损伤l碱基错配碱基错配l平面大分子嵌入平面大分子嵌入DNA链链l碱基类似物取代碱基类似物取代l碱基的化学结构改变或破坏碱基的化学结构改变或破坏lDNA链受损链受损l二聚体的形成二聚体的形成lDNA加合物形成加合物形成lDNA-蛋白质交联物蛋白质交联物（一）碱基损伤（一）碱基损伤l1.碱基错配碱基错配l指指烷烷化化剂剂提提供供甲甲基基或或乙乙基基等等烷烷基基与与DNA共共价价结结合合，所所引起的甲基损伤表现为错配。引起的甲基损伤表现为错配。l一般情况下，发生频率：甲基化一般情况下，发生频率：甲基化乙基化乙基化高碳烷基化高碳烷基化l目前认为最
29、常受到烷化的是：目前认为最常受到烷化的是：l鸟嘌呤的鸟嘌呤的N-7位，位，O-6位位l腺嘌呤的腺嘌呤的N-1，N-7位位l烷烷化化的的碱碱基基既既可可表表现现出出像像正正常常碱碱基基一一样样的的配配对对特特性性，也也可可有不同的配对特性，主要取决于烷化的位置。有不同的配对特性，主要取决于烷化的位置。l通通常常在在鸟鸟嘌嘌呤呤7位位氮氮(N-7)上上的的烷烷化化有有正正常常配配对对特特性性，而而在在鸟嘌呤鸟嘌呤6位氧位氧(O-6)上的烷化易错配，引起上的烷化易错配，引起G:C-A:T转换转换。l烷化剂不但可引起碱基错配，还可引起烷化剂不但可引起碱基错配，还可引起DNA二级结构改变。二级结构改变。
30、l某某些些烷烷基基(如如鸟鸟嘌嘌呤呤N-7位位上上的的烷烷基基)，它它是是由由许许多多烷烷化化剂剂形形成成的的主主要要加加合合物物，造造成成碱碱基基与与脱脱氧氧核核糖糖之之间间的的连连接接键键不不稳稳定定，使使碱碱基基丢丢失失。丢丢失失碱碱基基的的DNA留留下下了了一一个个无无嘌嘌呤呤或或无无嘧嘧啶啶的的位位点点，通通常常称称AP位位点点(apurinicorapyrimidinicsite)。如如果果不不正正确确的的碱碱基基插插入入AP位位点点，可可引引起起突突变变，且且大大部分是颠换。部分是颠换。（一）碱基损伤（一）碱基损伤l2.平面大分子嵌入平面大分子嵌入DNA链链l嵌嵌入入剂剂以以静静
31、电电吸吸附附形形式式嵌嵌入入DNA单单链链的的碱碱基基之之间间或或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸链之间。双螺旋结构的相邻核苷酸链之间。l吖吖啶啶分分子子多多数数是是多多环环的的平平面面结结构构，特特别别是是三三环环结结构构，其其长长度度是是680nm，恰恰好好是是DNA单单链链相相邻邻碱碱基基距距离离的的两两倍倍。它它能能够够结结合合到到DNA分分子子上上，插插入入相相邻邻的的碱碱基基对对，使使它它们们分分开开，产产生生两两个个重重组组子子，一一个个碱碱基基对对增增多多，一一个个碱碱基基对对减减少少，即即造造成成碱碱基基对对的的缺缺失失或或者者额额外外碱碱基基对对的的插插入入。通通常常引引起起移
32、移码突变。码突变。（一）碱基损伤（一）碱基损伤l3.碱基类似物取代碱基类似物取代l碱基类似物在碱基类似物在DNA合成期即合成期即S期，与正常的碱基竞争，取期，与正常的碱基竞争，取代其位置。取代后会造成错误配对，即发生碱基置换。代其位置。取代后会造成错误配对，即发生碱基置换。l常见的例子是常见的例子是5-溴脱氧尿嘧啶取代胸腺嘧啶，溴脱氧尿嘧啶取代胸腺嘧啶，2-氨基嘌呤氨基嘌呤取代鸟嘌呤。取代鸟嘌呤。（一）碱基损伤（一）碱基损伤l4.碱基的化学结构改变或破坏碱基的化学结构改变或破坏l有有些些化化学学物物可可对对碱碱基基产产生生氧氧化化作作用用，改改变变或或破破坏坏碱碱基基的的结结构构，有有时时还还
33、可可引引起起链链断断裂裂。它它们们主主要要改改变变核核苷苷酸酸的的化化学组成。学组成。l亚亚硝硝酸酸盐盐能能使使腺腺嘌嘌呤呤和和胞胞嘧嘧啶啶发发生生氧氧化化性性脱脱氨氨，相相应应生生成次黄嘌呤和尿嘧啶。成次黄嘌呤和尿嘧啶。l甲甲醛醛可可在在体体内内形形成成有有机机过过氧氧化化物物或或自自由由基基，间间接接使使嘌嘌呤呤的化学结构破坏，最终导致的化学结构破坏，最终导致DNA链的断裂。链的断裂。（二）（二）DNA链受损链受损l1.二聚体的形成二聚体的形成l紫紫 外外 线线 环环 丁丁 烷烷 嘧嘧 啶啶 二二 聚聚 体体 和和 (4-6)光光 产产 物物 (4-6-photoproduct)阻止阻止D
34、NA的复制的复制引起细胞死亡引起细胞死亡l紫紫外外线线的的致致突突变变作作用用具具有有可可逆逆性性，表表明明突突变变作作用用不不仅仅涉涉及及碱碱基基配配对对特特异异性性的的改改变变，而而且且还还涉涉及及与与复复制制和和修修复复有有关关的的细细胞胞机制相互作用。机制相互作用。(二二)DNA链受损链受损l2.DNA加合物形成加合物形成l活活性性化化学学物物质质与与细细胞胞大大分分子子之之间间通通过过共共价价键键形形成成的的稳稳定定复合物。可引起碱基置换或移码突变。复合物。可引起碱基置换或移码突变。lDNA加加合合物物形形成成可可活活化化癌癌基基因因，影影响响调调节节基基因因和和抑抑癌癌基基因因的的
35、表表达达。生生物物毒毒素素、多多环环芳芳烃烃和和芳芳香香氨氨类类致致癌癌物物可可使使DNA形形成成大大的的加加合合物物，DNA的的立立体体构构象象发发生生明明显显变变化化，阻断受损部位的半保留复制和转录。阻断受损部位的半保留复制和转录。（二）（二）DNA链受损链受损l3.DNA-DNA交联交联(DNA-DNAcrosslinks，DDC)lDNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接，如亚硝酸、丝裂霉素共价连接，如亚硝酸、丝裂霉素C、芥子气以及各种铂、芥子气以及各种铂的衍生物。的衍生物。（二）（二）DNA链受损链受损l4.DNA-蛋白质交联
36、物蛋白质交联物(DNA-proteincrosslinks，DPC)l许许多多化化合合物物如如烷烷化化剂剂、苯苯并并(a)芘芘、甲甲醛醛及及一一些些重重金金属属镍镍、铬铬等等，均均可可引引起起DNA-蛋蛋白白质质发发生生交交联联。虽虽然然不不同同化化学学物物引引起起DNA-蛋蛋白白质质交交联联物物的的交交联联有有所所不不同同，但但DPC一一旦旦形成，必将对形成，必将对DNA构象与功能产生严重影响。构象与功能产生严重影响。l与与DNA交交联联的的核核蛋蛋白白作作为为维维持持DNA构构象象的的重重要要成成分分，并并参参与与DNA复复制制与与转转录录的的调调控控，因因此此DPC出出现现将将造造成成基
37、基因因突变。突变。二、引起突变的细胞分裂过程的改变二、引起突变的细胞分裂过程的改变l一些化学物能作用于纺锤体、中心粒或其他核内细胞器，从一些化学物能作用于纺锤体、中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程，使得染色体分离异常，产生非整倍体而干扰有丝分裂过程，使得染色体分离异常，产生非整倍体和多倍体。和多倍体。l非整倍体与多倍体的产生机制相似，可能有程度上的不同，非整倍体与多倍体的产生机制相似，可能有程度上的不同，如干扰纺锤体形成，完全阻止形成多倍体，部分阻止形成非如干扰纺锤体形成，完全阻止形成多倍体，部分阻止形成非整倍体。整倍体。l秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，它能阻断秋水仙碱
38、是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，它能阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使分裂间期微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使分裂间期和前期的细胞停滞在中期相，称为和前期的细胞停滞在中期相，称为秋水仙碱效应秋水仙碱效应。三、三、DNA合成和修复有关的酶系统作用合成和修复有关的酶系统作用lDNA复复制制需需多多种种酶酶类类的的参参与与，并并且且在在基基因因调调控控下下进进行行，这这个个过过程程中中的的任任何何一一个个环环节节损损伤伤，将将影影响响DNA复复制制的的高高保保真真性性，有可能引起突变。有可能引起突变。l修复修复lDNA修修复复过过程程是是清清除除受受损损伤伤的的DNA片
39、片段段，并并合合成成新新的的片片段来替换的过程。段来替换的过程。lDNA是是生生命命物物质质中中唯唯一一具具有有自自身身修修复复能能力力的的分分子子，其其修修复复过程是依赖各种各样的酶来进行。过程是依赖各种各样的酶来进行。四、突变的后果四、突变的后果l突变的后果，取决于化学物所作用的靶细胞，突变的后果，取决于化学物所作用的靶细胞，l生殖细胞，其影响有可能遗传到下一代。生殖细胞，其影响有可能遗传到下一代。l体体细细胞胞，其其影影响响仅仅能能体体现现在在直直接接接接触触该该物物质质的的个个体体，而不可能遗传到下一代。而不可能遗传到下一代。生殖细胞突变的后果生殖细胞突变的后果l致死性突变（影响后代数
40、量）致死性突变（影响后代数量）l显性致死：突变配子与正常配子结合后，使精子不能受精，显性致死：突变配子与正常配子结合后，使精子不能受精，合子在着床前丢失或着床后早期胚胎死亡；合子在着床前丢失或着床后早期胚胎死亡；l隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡，可造成生育功能障碍。则不出现死亡，可造成生育功能障碍。l非致死性突变（影响后代质量）非致死性突变（影响后代质量）l显性遗传：造成下一代遗传疾病发生率增加或新病种出现；显性遗传：造成下一代遗传疾病发生率增加或新病种出现；l隐性遗传：使得遗传易感性改变，增加下一代基因库的
41、遗传隐性遗传：使得遗传易感性改变，增加下一代基因库的遗传负荷。负荷。l基因库（基因库（genepool）：）：某一物种在特定时期中能将某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。的基因总和。l遗传负荷遗传负荷(geneticload)：指一种物种的群体中每一指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。体细胞突变的后果体细胞突变的后果l肿瘤：肿瘤：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，许多肿瘤细胞中体细胞突变是细胞癌变的重要基础，许多肿瘤细胞中都可观察到癌基
42、因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、重复、易位、倒位等染色体畸变。重复、易位、倒位等染色体畸变。l致畸胎：致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。l其他不良后果：其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老等。动脉粥样硬化、衰老等。第四节第四节机体对致突变作用的影响机体对致突变作用的影响l遗遗传传信信息息在在所所有有物物种种中中，均均是是世代相传，因为：世代相传，因为：lDNA执执行行高高保保真真度度的的半半保
43、保留留复复制制，对对复复制制中中的的错错误误能能及时纠正；及时纠正；l机机体体可可以以修修复复DNA损损伤伤，保保护护亲亲代代DNA链链免免受受化化学学物作用而发生改变。物作用而发生改变。机体修复机体修复DNA损伤的机制可分为两类损伤的机制可分为两类l损损伤伤耐耐受受机机制制：指指遗遗传传可可绕绕过过那那些些阻阻止止DNA复复制制的的DNA损损伤伤。如如细细菌菌的的重重组组修修复复机机制制是是绕绕过过不不能能配配对对的的嘧嘧啶啶二二聚聚体体或或较较大大的的化化学学加加合合物物，在在受受损损对对应应的的新新DNA链链留留下下一一间间隙隙，然然后后通通过过重重组过程，用来自母本链的组过程，用来自母
44、本链的DNA片段填补间隙。片段填补间隙。lDNA修复机制：修复机制：l直接修复：直接修复：指引起指引起DNA损伤的反应为可逆性的，如光修复。损伤的反应为可逆性的，如光修复。l切切除除修修复复：将将损损伤伤或或不不正正确确的的甲甲基基去去除除和和替替换换，如如核核苷苷酸酸或或碱基去除，它是负责较大范围损伤的修复。碱基去除，它是负责较大范围损伤的修复。DNA修复修复直接修复直接修复切除修复切除修复适应性修复适应性修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复一、直接修复一、直接修复l光复活光复活l“适应性适应性”
45、反应反应光复活光复活l紫外线损伤产生胸腺嘧啶二聚体，光复活依赖光裂合酶的紫外线损伤产生胸腺嘧啶二聚体，光复活依赖光裂合酶的作用，酶切下作用，酶切下DNA上的嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原上的嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原结构上，光裂合酶广泛存在于原核生物和真核生物体内。结构上，光裂合酶广泛存在于原核生物和真核生物体内。光修复光修复(lightrepairing)光裂合酶光裂合酶(photolyase) UV“适应性适应性”反应反应l鸟嘌呤鸟嘌呤O-6位易被烷化，造成碱基错配，这时可依赖烷基位易被烷化，造成碱基错配，这时可依赖烷基转移酶作用，将鸟嘌呤转移酶作用，将鸟嘌呤O-6位的甲基转给蛋白质位
46、的甲基转给蛋白质O6-甲基鸟甲基鸟嘌呤嘌呤-DNA甲基化转移酶（甲基化转移酶（MGMT），修复烷基化损伤，），修复烷基化损伤，鸟嘌呤恢复正常的碱基配对特性。鸟嘌呤恢复正常的碱基配对特性。MGMT广泛存在于酵广泛存在于酵母、大鼠及人类。母、大鼠及人类。二、切除修复二、切除修复l核苷酸切除修复核苷酸切除修复l碱基切除修复碱基切除修复l错配修复错配修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATPE.coli的切除的切除修复机制修复机制解螺旋解螺旋酶生物体内最重要和有效的修生物体内最重要和有效的修复机制，主要由复机制，主要由DNA-pol和
47、连和连接酶完成。接酶完成。碱基切除修复碱基切除修复lDNA糖基化酶糖基化酶识别异常的碱基，切断碱基与脱氧核糖之间的识别异常的碱基，切断碱基与脱氧核糖之间的键，使受损伤的碱基脱落，形成一个无嘌呤或无嘧啶的位点键，使受损伤的碱基脱落，形成一个无嘌呤或无嘧啶的位点（AP位点）；位点）；lAP内切酶内切酶将将DNA链切断；链切断；l插入酶插入酶将正确碱基插入将正确碱基插入AP位点；位点；lDNA聚合酶聚合酶合成合成DNA片段，填补空缺；片段，填补空缺；lDNA连接酶连接酶将新合成的互补片接上。将新合成的互补片接上。l与核苷酸切除修复相比，碱基切除修复的专一性更强。与核苷酸切除修复相比，碱基切除修复的专
48、一性更强。错配修复错配修复l错配修复分识别、切除、修补等过程，是一类性质截然不错配修复分识别、切除、修补等过程，是一类性质截然不同的切除修复。可以识别并除去错配的碱基对，该过程需同的切除修复。可以识别并除去错配的碱基对，该过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上本来就正常的核苷酸。不会切除母链上本来就正常的核苷酸。三、双链断裂修复三、双链断裂修复l双双链链断断裂裂修修复复依依赖赖DNA蛋蛋白白激激酶酶，通通过过填填补补损损伤伤部部位位，使使复制得以继续进行，但复制得以继续进行，但DNA损伤部位仍然存在。损伤部位仍然
49、存在。l双双链链断断裂裂修修复复与与前前述述的的修修复复交交联联不不同同，如如切切除除修修复复可可使使DNA链链结结构构部部分分或或全全部部恢恢复复原原来来的的状状态态，而而双双链链断断裂裂修修复复达达不不到到这这种种目目的的。严严格格来来说说，双双链链断断裂裂修修复复不不是是修修复复，而而是是一一种种耐耐受受过过程程，一一种种以以容容忍忍损损伤伤继继续续存存在在和和在在高高突突变变率率情况下，换取细胞继续生存的耐受过程。情况下，换取细胞继续生存的耐受过程。四、交联修复四、交联修复l无误交联修复：无误交联修复：降解双螺旋，使链内交联转变为链内二核苷降解双螺旋，使链内交联转变为链内二核苷酸加合物
50、，接连于双链断裂处，随后酸加合物，接连于双链断裂处，随后Hollidy连接体分解，核连接体分解，核苷酸切除修复最终去除二核苷酸交联。苷酸切除修复最终去除二核苷酸交联。l易误交联修复：易误交联修复：其作用是次要的，指突变作为修复的结果或其作用是次要的，指突变作为修复的结果或者作为损伤旁路发生的者作为损伤旁路发生的DNA修复，包括整个核苷酸切除修复修复，包括整个核苷酸切除修复和易误和易误DNA聚合酶。聚合酶。DNA损伤修复的一般特点损伤修复的一般特点lDNA损伤不仅可以因外源因素所致，也可以因内源因素所致；损伤不仅可以因外源因素所致，也可以因内源因素所致；l不同类型的不同类型的DNA损伤通过不同的
51、损伤通过不同的DNA修复途径修复；修复途径修复；l不同类型不同类型DNA损伤修复速度是不同的；损伤修复速度是不同的；lDNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的；损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的；lDNA损伤修复功能存在物种和个体差异。损伤修复功能存在物种和个体差异。DNA损伤损伤-修复修复-突变模式突变模式l致致突突变变作作用用是是一一个个涉涉及及多多元元因因素素相相互互作作用用的的复复杂杂细细胞胞过过程程，它它包包括括突突变变、修修复复和和代代谢谢。对对于于化化学学致致突突变变作作用用的的模模式式应应为为DNA损伤损伤-修复修复-突变模式。突变模式。l任何任何DNA损伤，只要修
52、复无误，突变就不会发生；损伤，只要修复无误，突变就不会发生；l如如果果修修复复错错误误或或者者未未经经修修复复，损损伤伤就就固固定定下下来来，于于是是发发生突变。生突变。二、遗传因素对致突变作用的影响二、遗传因素对致突变作用的影响l个体因素影响致突变作用有两个方面：个体因素影响致突变作用有两个方面：l先先天天因因素素：即即遗遗传传因因素素，也也就就是是遗遗传传多多态态性性，是是一一个个衡衡量量遗遗传传变变异异的的数数据据，即即群群体体中中多多态态基基因因的的比比例例。当当一一个个基基因因座座位位的的最最常常见见的的等等位位基基因因频频率率不不超超过过0.99时时，这这个个基基因因座座位位即即是
53、是多多态态性性。它它在在个个体体因因素素影影响响致致突突变变作作用用中中起决定作用。如代谢酶和修复酶的遗传多态性。起决定作用。如代谢酶和修复酶的遗传多态性。l后后天天因因素素：主主要要指指不不良良的的生生活活方方式式，如如吸吸烟烟、饮饮酒酒、营营养缺乏或不平衡等。这些因素是产生突变的条件。养缺乏或不平衡等。这些因素是产生突变的条件。第五节第五节观察化学物致突变观察化学物致突变作用的基本方法作用的基本方法致突变试验的目的致突变试验的目的l检测外源性化学物的致突变性，预测其对动物和检测外源性化学物的致突变性，预测其对动物和人类的致癌性；人类的致癌性；l检测外源性化学物对动物生殖细胞的遗传毒性，检测
54、外源性化学物对动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性。预测其对人类的遗传危险性。观察项目的选择观察项目的选择l基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。l但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统
55、称为为遗传学终点遗传学终点(geneticmdpoint)。致突变试验能反映的遗传学终点致突变试验能反映的遗传学终点l1、基因突变、基因突变l2、染色体畸变、染色体畸变l3、染色体组畸变、染色体组畸变l4、DNA原始损伤原始损伤l国际环境致突变物致癌物防护委员会国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于于1983年提年提出致突变试验的遗传学终点可分为出致突变试验的遗传学终点可分为5类：类：lDNA完整性的改变完整性的改变(形成加合物、断裂、交联形成加合物、断裂、交联)；lDNA重排或交换；重排或交换；lDNA碱基序列改变；碱基序列改变；l染色体完整性改变；染色体完整性改变；l染色体分离
56、改变。染色体分离改变。l其中其中指基因突变，指基因突变，指染色体结构畸变，指染色体结构畸变，指染色体指染色体数目改变。数目改变。致突变试验组合的原则致突变试验组合的原则l一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。l体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑
57、。优缺点，应取长补短，综合考虑。l配套实验应包括多种进化程度不同的物种。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验l1.细菌回复突变试验细菌回复突变试验(Ames试验试验)l细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，从而判断其致能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，从而判断其致突变性。其遗传学终点是基因突变。突变性。其遗传学终点是基因突变。l常用的菌株有鼠伤寒沙
58、门氏菌常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellatyphimmIm)和大肠杆菌和大肠杆菌(EColi)。鼠伤寒沙门菌突变试验原理鼠伤寒沙门菌突变试验原理l鼠鼠伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌的的野野生生型型菌菌株株能能自自行行合合成成组组氨氨酸酸（his+），而而人人工工诱诱变变的的突突变变株株在在组组氨氨酸酸操操纵纵子子中中有有一一个个突突变变，这这种种组组氨氨酸酸缺缺陷陷型型突突变变菌菌株株必必需需依依赖赖外外源源性性组组氨氨酸酸才才能能生生长长，而而在在无无组组氨氨酸酸的的选选择择性性培培养养基基上上不不能能存存活活（his-）。致致突突变变物物可可使使其其基基因因发发生生回回复复突突变变
59、为为野野生生型型，使使它它在在缺缺乏乏组组氨氨酸酸的的培培养养基基上上也也能能生生长长。对对于于间间接接致致突突变变物物，可可经经代代谢谢活活化化系系统统处处理理成为直接致突变物。成为直接致突变物。鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌野生型野生型(his+)组氨酸缺陷型组氨酸缺陷型突变株突变株(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物lAmes试试验验标标准准试试验验菌菌株株有有四四种种：TA97和和TA98检检测测移移码码突突变变，TA100检检测测碱碱基基置置换换突突变变，TA102对对醛醛、过过氧氧化化物物和和DNA交联剂较敏感。交联剂较敏感。l这这四四个个
60、试试验验菌菌株株除除了了含含有有his-突突变变，还还有有一一些些附附加加突突变变，检测时提高试验敏感性。检测时提高试验敏感性。lAmes试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。结果判断结果判断l只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。l仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。l不加不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。l加加S9混合液才得到阳性结果，说明
61、受试物是间接致突变物。混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。2.微核试验微核试验(micronucleustest,MNT)l微核微核(micronucleus)：指染色体或染色单体无着丝点断片，指染色体或染色单体无着丝点断片，或因纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗或因纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在子细胞的胞质中，单独形成一个或几个规则的次核，故留在子细胞的胞质中，单独形成一个或几个规则的次核，故称微核。称微核。l在细胞质中微核来源有二：在细胞质中微核来源有二：l染染色色体体断断片片或或无无着着丝丝粒粒染染色色体体，在在细细胞胞分分裂裂后后期期不不
62、能能定定向向移动，而遗留在细胞质中；移动，而遗留在细胞质中；l有有丝丝分分裂裂物物的的作作用用使使个个别别染染色色体体或或带带着着丝丝粒粒的的染染色色体体环环和和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。l微微核核试试验验(micronucleustest，MNT)：是是用用于于染染色色体体损损伤伤和干扰细胞有丝分裂的化学物的快速检测方法。和干扰细胞有丝分裂的化学物的快速检测方法。l微微核核试试验验的的灵灵敏敏度度与与细细胞胞遗遗传传学学试试验验基基本本相相同同，能能检检测测化化学学或或物物理理因因素素诱诱导导产产生生的的染染色色体体完完整整性性改改变变和和染染色色体
63、体分分离离改变这两种遗传学终点。改变这两种遗传学终点。l常用啮齿类动物常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（骨髓嗜多染红细胞（PCE）做微核试验。做微核试验。为什么要选用为什么要选用PCE？l骨髓红细胞有丝分裂旺盛，造成一个较为灵敏的检测环境；骨髓红细胞有丝分裂旺盛，造成一个较为灵敏的检测环境；l嗜多染红细胞是红细胞成熟过程中的一个阶段，位于红细胞嗜多染红细胞是红细胞成熟过程中的一个阶段，位于红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时，此时红细胞的主核已排成熟之前，最后一次分离后数小时，此时红细胞的主核已排出，微核容易辨认；出，微核容易辨认；l嗜多染红细胞刚完成排核过程，从时间上可以控制了解微核嗜多染红细
64、胞刚完成排核过程，从时间上可以控制了解微核率变化的全过程；率变化的全过程；l嗜多染红细胞胞质含嗜多染红细胞胞质含RNA，染色与成熟红细胞易于区别。，染色与成熟红细胞易于区别。l体外微核试验体外微核试验l周围血微核试验周围血微核试验l双核细胞法双核细胞法l免疫荧光染色法和荧光原位杂交法免疫荧光染色法和荧光原位杂交法改进的微核试验改进的微核试验MNNCE试验步骤试验步骤l健康成年健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24小时予环磷酰胺小时予环磷酰胺40mg/kg腹腔注射腹腔注射染毒。染毒。l小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉
65、和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。l以以1000r/min速度离心速度离心10min，弃上清液，留下约，弃上清液，留下约0.5ml沉淀物混沉淀物混匀后，滴片两张，推片。匀后，滴片两张，推片。l将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。，取出晾干。l将固定晾干后的骨髓片，用将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色应用液染色1015min，轻微，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干
66、。冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。l显微镜观察并计数微核率。显微镜观察并计数微核率。lPCE呈灰蓝色，成熟呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，呈粉红色，NC呈蓝紫色。呈蓝紫色。lPCE中含有的微核大小为细胞直径的中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数数1000个个PCE中含微核的中含微核的PCE数。数。3.染色体畸变分析染色体畸变分析l染色体畸变分析染色体畸变分析(
67、chromosomeaberrationanalysis)：观察染观察染色体形态结构和数目改变，又称色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变只能在细胞分裂的中期相。染色体畸变只能在细胞分裂的中期相进行观察和分析。可观察到裂隙、断裂、断片、染色体环、进行观察和分析。可观察到裂隙、断裂、断片、染色体环、双或多着丝粒染色体和染色体粉碎。双或多着丝粒染色体和染色体粉碎。l为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，使用秋水仙碱处为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，使用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，理，以阻断微
68、管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。l细胞通过低渗处理，使染色体均匀散开，然后固定、染色，细胞通过低渗处理，使染色体均匀散开，然后固定、染色，油镜下观察计数。油镜下观察计数。试验步骤试验步骤l染毒：健康成年染毒：健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24小时予环磷酰胺小时予环磷酰胺40mg/kg体体重腹腔注射。重腹腔注射。l收获细胞：处死动物前收获细胞：处死动物前24h，秋水仙碱，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦
69、去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸剪去两端骨垢，用注射器吸NS约约5ml插入骨髓腔内，将骨髓冲插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500r/min离心离心10min，弃上清液。弃上清液。l低渗：打散沉淀物，加入预温低渗：打散沉淀物，加入预温37的的0.075mol/LKCl约约6ml，混匀，于混匀，于37低渗低渗1520min，再加固定液，再加固定液l2ml混匀，立即以混匀，立即以1000r/min离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。l固定：重悬细胞，加入固定液固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温混匀，放置室温10
70、20min，然后然后1000r/min离心离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约弃上清液，留约0.5ml。l制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片载波片1015Cm高处滴片，干燥，用高处滴片，干燥，用10Giemesa染色液染色染色液染色1020min，轻微冲洗，自然晾干。，轻微冲洗，自然晾干。l阅片计数。阅片计数。l染色体数目改变包括：染色体数目改变包括：l整倍体变异：原先整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如的染色体变为多倍体如3n或或4n等。等。l非整倍体变异：染
71、色体组中的个别染色体增加或减少。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。l染色体结构改变包括：裂隙染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂、断裂(B)、碎片、碎片(F)、环形、环形(r)、交、交换换(E)以及复合性断裂等。以及复合性断裂等。l小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为条，大鼠的染色体数为42条。条。l读片时每张标本片至少要分析读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。个中期分裂细胞。4.姐妹染色单体交换试验姐妹染色单体交换试验l姐姐妹妹染染色色单单体体：从从DNA合合成成期期
72、染染色色体体复复制制至至有有丝丝分分裂裂后后期期中中心心粒粒分分裂裂这这段段时时间间，由由同同一一个个中中心心粒粒连连在在一一起起的的二二条条子子染染色色体称为姐妹染色单体。体称为姐妹染色单体。l姐妹染色单体交换姐妹染色单体交换(sister-chromatidexchange，SCE)：二二条姐妹染色单体之间的物质交换就称为姐妹染色单体交换。条姐妹染色单体之间的物质交换就称为姐妹染色单体交换。即染色体同源座位上即染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换。如单体内复制产物的相互交换。如单体内DNA链受损，则可能通过这种交换方式进行重组修复。链受损，则可能通过这种交换方式进行重组修复。因此因此S
73、CE的出现常表明的出现常表明DNA曾经受损。曾经受损。l将将5-BrdU加入合成加入合成DNA的原料中，经过两个分裂周期后，的原料中，经过两个分裂周期后，两条染色单体的其中一条双股两条染色单体的其中一条双股DNA链内胸腺嘧啶核苷均被链内胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一条只有一股被取代。染色和光处理后，两取代，另一条只有一股被取代。染色和光处理后，两条染色单体的着色深浅不同。如果两条染色单体间发生等位条染色单体的着色深浅不同。如果两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段，在交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段，在光镜下进行识别，清晰分辨出交换的染色单体
74、，计数光镜下进行识别，清晰分辨出交换的染色单体，计数SCE数，数，判断受试物对判断受试物对DNA是否有损伤作用。是否有损伤作用。姐妹染色单体交换试验原理姐妹染色单体交换试验原理5.程序外程序外DNA合成试验合成试验l正正常常细细胞胞需需经经过过细细胞胞周周期期达达到到增增殖殖的的目目的的，细细胞胞周周期期包包括括G1期期、S期期、G2期期和和M期期，在在S期期的的DNA合合成成是是按按固固定定程程序序进行的，称为进行的，称为程序性程序性DNA合成合成(scheduledDNAsynthesis)。l当当DNA损损伤伤时时，会会发发生生在在S期期半半保保留留DNA程程序序合合成成之之外外的的DN
75、A合合成成，称称之之为为程程序序外外DNA合合成成(unscheduled DNAsynthesis,UDS)。它它是是机机体体为为保保证证遗遗传传稳稳定定性性而而对对DNA双双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程。链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程。程序外程序外DNA合成试验原理合成试验原理l程程序序外外DNA合合成成试试验验是是观观察察分分离离或或培培养养的的细细胞胞，加加入入标标记记DNA合合成成原原料料，如如3H-胸胸苷苷，在在S期期外外是是否否有有DNA合合成成发发生生，即即是是以以3H-胸胸苷苷掺掺入入细细胞胞量量的的增增加加，判判断断受受试试物物是是否否造成造成DNA损伤。
76、损伤。6.单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳(SCGE)试验试验l单单细细胞胞凝凝胶胶电电泳泳(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)试试验验：在单细胞水平定量检测有核细胞在单细胞水平定量检测有核细胞DNA损伤与修复的方法损伤与修复的方法。l原原理理：将将单单细细胞胞悬悬液液均均匀匀混混合合在在低低熔熔点点琼琼脂脂糖糖中中，裂裂解解液液使使细细胞胞膜膜和和核核膜膜破破裂裂，胞胞浆浆中中的的蛋蛋白白质质等等释释放放到到裂裂解解液液中中，只只有有DNA依依然然留留在在原原位位，强强碱碱作作用用使使DNA双双链链打打开开，并并将将其其置置于于电电场场中中泳泳动动。若若DNA发
77、发生生断断裂裂，则则断断裂裂的的小小片片段段DNA在在电电泳泳时时泳泳动动速速度度和和大大片片段段的的DNA产产生生差差异异，出出现现如如彗彗星星一一样样的的拖拖尾尾现现象象。通通过过检检测测拖拖尾尾率率，DNA迁迁移移距距离离等等数数据据，可可以以观观察到察到DNA损伤的程度。故又称为损伤的程度。故又称为彗星试验（彗星试验（comettest)。l优点：优点：此方法检测低水平此方法检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，适应性高，操作简便，省时省力。细胞数要求少，适应性高，操作简便，省时省力。l缺点：缺点：有待于标准化，尚未被国际组织接受。有待于标准化，
78、尚未被国际组织接受。7.观察方法的新进展观察方法的新进展l转基因小鼠致突变检测系统转基因小鼠致突变检测系统l微核自动化检测技术微核自动化检测技术l荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术三、致突变试验中的一些注意问题三、致突变试验中的一些注意问题l1.阴性和阳性对照的设立阴性和阳性对照的设立l2.体外试验的活化系统体外试验的活化系统3.致突变试验与致癌试验的关系致突变试验与致癌试验的关系l化学物按遗传毒性和致癌性分类：遗传毒性致癌物，非遗传毒化学物按遗传毒性和致癌性分类：遗传毒性致癌物，非遗传毒性致癌物，遗传毒性非致癌物和非遗传毒性非致癌物四类。性致癌物，遗传毒性非致癌物和非遗传毒性非致癌物四类。l致
79、突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。致癌物。l人类致癌物检测方法有三大类：短期试验，哺乳动物诱癌试验人类致癌物检测方法有三大类：短期试验，哺乳动物诱癌试验和人类流行病学观察。和人类流行病学观察。l致突变试验是短期致癌物检测试验中的一大类，它需与其他试致突变试验是短期致癌物检测试验中的一大类，它需与其他试验结合，互为补充，以获得可靠的结论。验结合，互为补充，以获得可靠的结论。4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用
80、试验结果在毒理学安全性评价中的作用l在评定结果之前，应首先检查实验的质量控制情况。在评定结果之前，应首先检查实验的质量控制情况。l致突变试验的质量控制措施如下：致突变试验的质量控制措施如下：l设立阴性对照和阳性对照；设立阴性对照和阳性对照；l盲法观察，指观察人员不了解观察标本的染毒剂量或组别，盲法观察，指观察人员不了解观察标本的染毒剂量或组别，以免除观察人员对实验数据产生主观影响；以免除观察人员对实验数据产生主观影响；l资料的统计学分析，它是检验各处理组与对照组之间的差异，资料的统计学分析，它是检验各处理组与对照组之间的差异，研究剂量研究剂量-反应关系和定量强度；反应关系和定量强度；l试验结果
81、的重现性，即重复试验所得到的相同结果。重复试试验结果的重现性，即重复试验所得到的相同结果。重复试验指在不同时间完成的试验，而并非试验中的平行样本。验指在不同时间完成的试验，而并非试验中的平行样本。l阳性结果判定条件阳性结果判定条件l具有剂量反应关系，即随着剂量的增加，致突变作用具有剂量反应关系，即随着剂量的增加，致突变作用也增加；也增加；l实验组观察值与阴性对照比较有显著性差异，即表明受实验组观察值与阴性对照比较有显著性差异，即表明受试物具有致突变性。试物具有致突变性。l阴性结果判定条件阴性结果判定条件l最最高高剂剂量量应应包包括括受受试试物物许许可可最最大大剂剂量量或或最最大大耐耐受受量量，常常选选LD50或或LD80为最大剂量；为最大剂量；l各各剂剂量量组组的的组组间间差差距距不不应应过过大大，以以防防漏漏检检仅仅在在非非常常狭狭窄窄范围内才有突变能力的某些化学物。范围内才有突变能力的某些化学物。
