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1、实验一、微藻原生质体的分离实验一、微藻原生质体的分离 实验目的实验目的 1. 了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术；了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术；2. 熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。 实验原理实验原理 根据藻类细胞脱壁程度的不同，根据藻类细胞脱壁程度的不同，AdamichAdamich将脱壁将脱壁后的藻细胞定义为原生质体（后的藻细胞定义为原生质体（protoplastprotoplast）和原生质）和原生质球（球（spheroplastspheroplast）。原生质体是指任何基因型的藻细）。原生质体是指任何基因型的藻细胞其质膜外的细胞
2、壁和包被层被全部除去而保持其胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。层的含全部细胞内组分的部分。 海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有质体的分离方法很
3、多，例如蓝绿藻的细胞壁含有粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞
4、壁组成和结构，球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体
5、。尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是酶解的方法。酶解的方法。酶解的方法。酶解的方法。 仪器与试剂仪器与试剂 1、仪器仪器恒温水浴；恒温水浴；低速离心机；低速离心机；冷冻离心机；冷冻离心机；离离心管心管40-50ml;40-50ml;三角烧瓶；三角烧瓶；显微镜，荧光显微显微镜，荧光显微镜。镜。2、试剂与酶、试剂与酶 酶：纤维素酶（酶：纤维素酶（OnozukaOnozuka R-10 R-10）, ,离析酶；离析酶；浸透浸透压调节剂：甘露醇、山梨醇和压调节剂：甘露醇
6、、山梨醇和NaclNacl；密度勾配剂密度勾配剂FicollFicoll和蔗糖。和蔗糖。 实验步骤实验步骤1 1、藻株的培养；、藻株的培养；、藻株的培养；、藻株的培养；2 2、原生质体的分离；、原生质体的分离；、原生质体的分离；、原生质体的分离；（1 1）取对数期的培养藻细胞（浓度为）取对数期的培养藻细胞（浓度为）取对数期的培养藻细胞（浓度为）取对数期的培养藻细胞（浓度为51075107细胞细胞细胞细胞/ml/ml）10ml10ml离心沉淀（离心沉淀（离心沉淀（离心沉淀（1000g,5min,1000g,5min,室温）。室温）。室温）。室温）。（2 2）用加入）用加入）用加入）用加入0.85
7、mol/LNaCl0.85mol/LNaCl的的的的MBMMBM液洗沉淀的藻细液洗沉淀的藻细液洗沉淀的藻细液洗沉淀的藻细胞一次（胞一次（胞一次（胞一次（1000g,5min1000g,5min）。在相同的）。在相同的）。在相同的）。在相同的MBMMBM液中加液中加液中加液中加入入入入1%1%纤维素酶和纤维素酶和纤维素酶和纤维素酶和0.5%0.5%的离析酶。将洗好沉淀的的离析酶。将洗好沉淀的的离析酶。将洗好沉淀的的离析酶。将洗好沉淀的细胞在细胞在细胞在细胞在10ml10ml上述加酶的培养液中悬浮。上述加酶的培养液中悬浮。上述加酶的培养液中悬浮。上述加酶的培养液中悬浮。（3 3）在振荡器上缓慢振荡
8、（）在振荡器上缓慢振荡（）在振荡器上缓慢振荡（）在振荡器上缓慢振荡（20-3020-30次次次次/min/min）细胞悬）细胞悬）细胞悬）细胞悬浮液，浮液，浮液，浮液，3030保温，保温，保温，保温，1000-2000lx1000-2000lx光照。光照。光照。光照。（4 4）在定时取出）在定时取出）在定时取出）在定时取出1ml1ml处理样品，离心分离处理样品，离心分离处理样品，离心分离处理样品，离心分离（1000g,5min1000g,5min），用），用），用），用MBMMBM液（含液（含液（含液（含0.6mol/l0.6mol/l山梨醇）山梨醇）山梨醇）山梨醇）洗涤一次，离心沉淀后，用洗
9、涤一次，离心沉淀后，用洗涤一次，离心沉淀后，用洗涤一次，离心沉淀后，用MBMMBM液（含液（含液（含液（含0.6mol/l0.6mol/l山梨醇）重新悬浮。山梨醇）重新悬浮。山梨醇）重新悬浮。山梨醇）重新悬浮。（5 5）取）取）取）取0.1ml0.1ml上述悬浮液再悬浮到上述悬浮液再悬浮到上述悬浮液再悬浮到上述悬浮液再悬浮到0.9ml0.9ml蒸馏水中，蒸馏水中，蒸馏水中，蒸馏水中，显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。胞膨胀变大、
10、破裂，可见内容物漏出。胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。（6 6）80%80%以上细胞原生质体化后（以上细胞原生质体化后（以上细胞原生质体化后（以上细胞原生质体化后（1-2h1-2h）, ,将细胞将细胞将细胞将细胞悬浮液置于离心管中配制好的悬浮液置于离心管中配制好的悬浮液置于离心管中配制好的悬浮液置于离心管中配制好的FicollFicoll不连续密度离不连续密度离不连续密度离不连续密度离心介质（心介质（心介质（心介质（10%-25%10%-25%）的顶部，）的顶部，）的顶部，）的顶部，10000r/min10000r/min离心离心离心离心30min30min
11、。（7 7）在）在）在）在15%-20%15%-20%界面处回收原生质体，用界面处回收原生质体，用界面处回收原生质体，用界面处回收原生质体，用MBMMBM（含（含（含（含0.6mol/l0.6mol/l山梨醇）液洗涤原生质体。山梨醇）液洗涤原生质体。山梨醇）液洗涤原生质体。山梨醇）液洗涤原生质体。 作作 业业1、影响微藻原生质体分离效果的因素有哪些、影响微藻原生质体分离效果的因素有哪些？2、原生质体和原生质体球之间有何差异？、原生质体和原生质体球之间有何差异？实验二、原生质体培养实验二、原生质体培养 实验目的实验目的 1、学习掌握原生质体培养培养基的种类以及、学习掌握原生质体培养培养基的种类以
12、及配制方法；配制方法；2、熟练掌握原生质体培养的基本过程与技术、熟练掌握原生质体培养的基本过程与技术要领。要领。 实验原理实验原理 分离得到的原生质体如培养在合适的培分离得到的原生质体如培养在合适的培养基和培养条件下，细胞壁可以再生，细养基和培养条件下，细胞壁可以再生，细胞可以增殖。原生质体再生的能力与原生胞可以增殖。原生质体再生的能力与原生质体化程度和酶处理时间呈反比关系。质体化程度和酶处理时间呈反比关系。 仪器与试剂仪器与试剂 1 1、仪器、仪器、仪器、仪器 灭菌培养皿；灭菌培养皿；灭菌培养皿；灭菌培养皿；血球计数板，显微镜等；血球计数板，显微镜等；血球计数板，显微镜等；血球计数板，显微镜
13、等；试管试管试管试管（12ml12ml的一次性使用塑料试管）。的一次性使用塑料试管）。的一次性使用塑料试管）。的一次性使用塑料试管）。2 2、培养基、培养基、培养基、培养基 液体再生培养基：液体再生培养基：液体再生培养基：液体再生培养基：MBMMBM加浸透压调节剂（加浸透压调节剂（加浸透压调节剂（加浸透压调节剂（20%20%蔗蔗蔗蔗糖或糖或糖或糖或0.6mol/L0.6mol/L山梨醇），高压灭菌。山梨醇），高压灭菌。山梨醇），高压灭菌。山梨醇），高压灭菌。 琼脂再生培养基：琼脂再生培养基：琼脂再生培养基：琼脂再生培养基：MBMMBM加浸透压调节剂（加浸透压调节剂（加浸透压调节剂（加浸透压调节
14、剂（20%20%蔗蔗蔗蔗糖或糖或糖或糖或0.6mol/L0.6mol/L山梨醇）加山梨醇）加山梨醇）加山梨醇）加1.5%1.5%琼脂。琼脂。琼脂。琼脂。实验步骤实验步骤 1 1、分离制备的、分离制备的、分离制备的、分离制备的C.ellipsoideaC.ellipsoidea C-87 C-87原生质体（原生质体（原生质体（原生质体（FicollFicoll中），用两中），用两中），用两中），用两倍体积的液体再生培养基稀释；倍体积的液体再生培养基稀释；倍体积的液体再生培养基稀释；倍体积的液体再生培养基稀释；2 2、离心沉淀原生质体（、离心沉淀原生质体（、离心沉淀原生质体（、离心沉淀原生质体（1
15、000g,5min1000g,5min），弃去上清液，用液体），弃去上清液，用液体），弃去上清液，用液体），弃去上清液，用液体再生培养基再洗涤一次；再生培养基再洗涤一次；再生培养基再洗涤一次；再生培养基再洗涤一次；3 3、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，使细胞密度达到使细胞密度达到使细胞密度达到使细胞密度达到51075107个个个个/ml/ml；4 4、于、于、于、于2525和光照和光照和光照和光照3000lx30
16、00lx条件下静置培养条件下静置培养条件下静置培养条件下静置培养3d3d，然后取出合适密，然后取出合适密，然后取出合适密，然后取出合适密度（度（度（度（104104个细胞个细胞个细胞个细胞/ /平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼脂培养基（脂培养基（脂培养基（脂培养基（0.6%0.6%琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在平板上增殖；平板上增殖；平板上增殖；平板上增殖；5 5、再生平
17、板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将、再生平板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将、再生平板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将、再生平板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将培养基的糖浓度降低培养基的糖浓度降低培养基的糖浓度降低培养基的糖浓度降低50%50%，可加快增殖速度；，可加快增殖速度；，可加快增殖速度；，可加快增殖速度；6 6、2525光照下（光照下（光照下（光照下（6000lx6000lx）静置培养，）静置培养，）静置培养，）静置培养，1-21-2周后，出现藻落。周后，出现藻落。周后，出现藻落。周后，出现藻落。 注意事项注意事项 通常通常通常通常1-21-2
18、周后，再生率达周后，再生率达周后，再生率达周后，再生率达10%10%（好的可达（好的可达（好的可达（好的可达30%30%），），），），这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产生于自生孢子。用软琼脂培养基（生于自生孢子。用软琼脂培养基（生于自生孢子。用软琼脂培养基（生于自生孢子。用软琼脂
19、培养基（0.6%0.6%琼脂）包埋琼脂）包埋琼脂）包埋琼脂）包埋原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。液体再生培养基静置培养的原生质体，液体再生培养基静置培养的原生质体，液体再生培养基静置培养的原生质体，液体再生培养基静置培养的原生质体，2-3d2-3d细胞壁细胞壁细胞壁细胞壁即可再生。即可再生。即可再生。即可再生。 作作 业业1 1、观察原生质体培养过程中，细胞形态特征的动态、观察原生质体培养过程中，细胞形态特征的动态、观察原生质体培养过程中，细胞形态特征
20、的动态、观察原生质体培养过程中，细胞形态特征的动态变化。变化。变化。变化。2 2、原生质体培养与藻类培养有何差异？、原生质体培养与藻类培养有何差异？、原生质体培养与藻类培养有何差异？、原生质体培养与藻类培养有何差异？实验三、海藻种内不同原生质实验三、海藻种内不同原生质体细胞融合与鉴定体细胞融合与鉴定 实验目的实验目的 1 1、了解原生质体细胞融合的基本原理；、了解原生质体细胞融合的基本原理；、了解原生质体细胞融合的基本原理；、了解原生质体细胞融合的基本原理；2 2、学习掌握诱导原生质体细胞融合的基本方法；、学习掌握诱导原生质体细胞融合的基本方法；、学习掌握诱导原生质体细胞融合的基本方法；、学习
21、掌握诱导原生质体细胞融合的基本方法；3 3、熟练掌握原生质体细胞融合的操作过程。、熟练掌握原生质体细胞融合的操作过程。、熟练掌握原生质体细胞融合的操作过程。、熟练掌握原生质体细胞融合的操作过程。 实验原理实验原理 细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色
22、素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的细胞融合技术。细胞融合技术。细胞融合技术。细胞融合技术。 仪器与试剂仪器与试剂 1 1、仪器、仪器、仪器、仪器 采用的仪器与原生质体培养相同。采用的仪器与
23、原生质体培养相同。采用的仪器与原生质体培养相同。采用的仪器与原生质体培养相同。2 2、藻株、藻株、藻株、藻株 C.ellipsoideaC.ellipsoidea C-87 C-87细胞（细胞（细胞（细胞（51075107个个个个/ml/ml细胞）经紫细胞）经紫细胞）经紫细胞）经紫外线或外线或外线或外线或X X射线处理（射线处理（射线处理（射线处理（99%99%死亡）后，接种于含葡萄死亡）后，接种于含葡萄死亡）后，接种于含葡萄死亡）后，接种于含葡萄糖的糖的糖的糖的MBMMBM平板培养基上，置暗处培养平板培养基上，置暗处培养平板培养基上，置暗处培养平板培养基上，置暗处培养4-7d4-7d后，分后
24、，分后，分后，分离色素变异株（黄色离色素变异株（黄色离色素变异株（黄色离色素变异株（黄色YelYel和白色和白色和白色和白色WhiWhi）。检测稳定）。检测稳定）。检测稳定）。检测稳定性以及培养条件对色素变化的影响，分为不同的性以及培养条件对色素变化的影响，分为不同的性以及培养条件对色素变化的影响，分为不同的性以及培养条件对色素变化的影响，分为不同的类型。类型。类型。类型。 3 3、培养基和试剂、培养基和试剂、培养基和试剂、培养基和试剂（1 1）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。（2 2）细胞融合溶液：）细胞融
25、合溶液：）细胞融合溶液：）细胞融合溶液：40%40%聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）6000,0.55mmol/L6000,0.55mmol/L山梨醇，山梨醇，山梨醇，山梨醇，50mmol/LCaCl2 50mmol/LCaCl2 2H2O2H2O（3 3）清洗液：）清洗液：）清洗液：）清洗液：0.6mol/L0.6mol/L山梨醇，山梨醇，山梨醇，山梨醇，50mmol/L CaCl2 50mmol/L CaCl2 .2H2O.2H2O，50mmol/L50mmol/L甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（PH9.0PH9.0）实验步骤实验步骤 1 1、不同类
26、型的色素变异株按实验二的方法制备原生质体。、不同类型的色素变异株按实验二的方法制备原生质体。、不同类型的色素变异株按实验二的方法制备原生质体。、不同类型的色素变异株按实验二的方法制备原生质体。2 2、两种原生质体按、两种原生质体按、两种原生质体按、两种原生质体按1:11:1比例混合（比例混合（比例混合（比例混合（51075107个细胞个细胞个细胞个细胞/ml/ml），离心），离心），离心），离心（1000g1000g，5min5min）。）。）。）。3 3、倾去上清液，向沉淀的原生质体中加入、倾去上清液，向沉淀的原生质体中加入、倾去上清液，向沉淀的原生质体中加入、倾去上清液，向沉淀的原生质体中
27、加入1ml1ml细胞融合溶液，细胞融合溶液，细胞融合溶液，细胞融合溶液，轻轻搅拌均匀。轻轻搅拌均匀。轻轻搅拌均匀。轻轻搅拌均匀。4 4、3030静置静置静置静置30min30min，缓慢搅拌加入，缓慢搅拌加入，缓慢搅拌加入，缓慢搅拌加入1ml1ml洗涤液，洗涤液，洗涤液，洗涤液，10min10min后，后，后，后，搅拌再加入搅拌再加入搅拌再加入搅拌再加入2ml2ml洗涤液。洗涤液。洗涤液。洗涤液。5 5、10min10min后，加后，加后，加后，加2ml2ml原生质体培养液，离心洗涤（原生质体培养液，离心洗涤（原生质体培养液，离心洗涤（原生质体培养液，离心洗涤（1000*g1000*g，5mi
28、n5min）。用原生质体培养液重复洗涤）。用原生质体培养液重复洗涤）。用原生质体培养液重复洗涤）。用原生质体培养液重复洗涤5 5遍。遍。遍。遍。6 6、弃去上清液，加、弃去上清液，加、弃去上清液，加、弃去上清液，加16ml16ml软琼脂培养液将原生质体悬浮后，软琼脂培养液将原生质体悬浮后，软琼脂培养液将原生质体悬浮后，软琼脂培养液将原生质体悬浮后，每每每每2ml2ml倒一个平板。倒一个平板。倒一个平板。倒一个平板。 7 7、软琼脂平板在、软琼脂平板在、软琼脂平板在、软琼脂平板在2525，1000lx1000lx光照下培养。光照下培养。光照下培养。光照下培养。作作 业业1 1、原生质体融合细胞检
29、测鉴定的方法有哪些？、原生质体融合细胞检测鉴定的方法有哪些？、原生质体融合细胞检测鉴定的方法有哪些？、原生质体融合细胞检测鉴定的方法有哪些？2 2、原生质体融合技术有何应用价值？、原生质体融合技术有何应用价值？、原生质体融合技术有何应用价值？、原生质体融合技术有何应用价值？实验四、海藻种间原生质体细实验四、海藻种间原生质体细胞融合与鉴定胞融合与鉴定 实验目的实验目的 1 1、了解种间原生质体细胞融合的基本原理；、了解种间原生质体细胞融合的基本原理；、了解种间原生质体细胞融合的基本原理；、了解种间原生质体细胞融合的基本原理；2 2、学习掌握诱导种间原生质体细胞融合的基本方法；、学习掌握诱导种间原
30、生质体细胞融合的基本方法；、学习掌握诱导种间原生质体细胞融合的基本方法；、学习掌握诱导种间原生质体细胞融合的基本方法；3 3、深入了解种间原生质体细胞融合与种类原生质体细胞、深入了解种间原生质体细胞融合与种类原生质体细胞、深入了解种间原生质体细胞融合与种类原生质体细胞、深入了解种间原生质体细胞融合与种类原生质体细胞融合之间的差异。融合之间的差异。融合之间的差异。融合之间的差异。 实验原理实验原理 细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标
31、记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的等。这里以
32、色素变异为选择标记介绍海洋微藻的细胞融合技术。细胞融合技术。细胞融合技术。细胞融合技术。 仪器与试剂仪器与试剂 1 1、仪器、仪器、仪器、仪器 采用的仪器与原生质体培养相同。采用的仪器与原生质体培养相同。采用的仪器与原生质体培养相同。采用的仪器与原生质体培养相同。2 2、藻株、藻株、藻株、藻株 盐藻盐藻盐藻盐藻DunaliellaDunaliella salinasalina LB200LB200和紫球藻和紫球藻和紫球藻和紫球藻PorphyidiumPorphyidium cruentumcruentum 161 161为美国德克萨斯大学藻为美国德克萨斯大学藻为美国德克萨斯大学藻为美国德克萨斯
33、大学藻种，盐藻种，盐藻种，盐藻种，盐藻DunaliellaDunaliella bardawibardawi 30861 30861为为为为ATCCATCC藻种。藻种。藻种。藻种。 3 3、培养基和试剂、培养基和试剂、培养基和试剂、培养基和试剂（1 1）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。）培养基用原生质体再生培养基。（2 2）细胞融合溶液：）细胞融合溶液：）细胞融合溶液：）细胞融合溶液：40%40%聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）60006000，0.55mmol/L0.55mmol/L山梨醇，山梨醇，山梨醇，山梨醇，
34、50mmol/LCaCl2 2H2O50mmol/LCaCl2 2H2O（3 3）清洗液：）清洗液：）清洗液：）清洗液：0.6mol/L0.6mol/L山梨醇，山梨醇，山梨醇，山梨醇，50mmol/L CaCl250mmol/L CaCl22H2O2H2O，50mmol/L50mmol/L甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（甘氨酸缓冲液（PH9.0PH9.0）实验步骤实验步骤 1 1、藻体培养；、藻体培养；、藻体培养；、藻体培养；2 2、原生质体分离；、原生质体分离；、原生质体分离；、原生质体分离；（1 1）收集紫球藻处于指数生长期的细胞，用灭菌培养液离心）收集紫球藻处于指数生长期的细胞
35、，用灭菌培养液离心）收集紫球藻处于指数生长期的细胞，用灭菌培养液离心）收集紫球藻处于指数生长期的细胞，用灭菌培养液离心洗涤洗涤洗涤洗涤2 2次。次。次。次。（2 2）将藻细胞悬浮于）将藻细胞悬浮于）将藻细胞悬浮于）将藻细胞悬浮于10ml10ml酶解液中。酶解液的组成是酶解液中。酶解液的组成是酶解液中。酶解液的组成是酶解液中。酶解液的组成是0.6mol/L 0.6mol/L NaClNaCl、0.4%0.4%（W/VW/V）果胶酶和）果胶酶和）果胶酶和）果胶酶和4%4%（W/VW/V）纤维）纤维）纤维）纤维素酶。素酶。素酶。素酶。 3 3、原生质体融合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体、原生质体融
36、合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体、原生质体融合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体、原生质体融合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体1:11:1混合，然后加入等体积的混合，然后加入等体积的混合，然后加入等体积的混合，然后加入等体积的PEGPEG溶液（组成：溶液（组成：溶液（组成：溶液（组成：0.125mmol/L PEG 40000.125mmol/L PEG 4000，0.2mol/L0.2mol/L葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，10 10 mmol/LCaCl2.2H2O,0.7 mmol/LCaCl2.2H2O,0.7 mmolmmol/L KH2PO4/L KH2PO4，pH 5.8pH
37、5.8）。）。）。）。30min30min后，加入后，加入后，加入后，加入PEGPEG洗涤液（组成：洗涤液（组成：洗涤液（组成：洗涤液（组成：100 100 mmolmmol/L/L甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，甘氨酸，mol/Lmol/L葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，葡萄糖，100 100 mmolmmol/L CaCl2.2H2O/L CaCl2.2H2O，pH 10.5pH 10.5）。）。）。）。在在在在15min15min内一滴一滴加入内一滴一滴加入内一滴一滴加入内一滴一滴加入2.52.5倍体积的倍体积的倍体积的倍体积的PEGPEG洗涤液。洗涤洗涤液。洗涤洗涤液。洗涤洗涤液。洗涤过程中，原生质体
38、融合发生。过程中，原生质体融合发生。过程中，原生质体融合发生。过程中，原生质体融合发生。 4 4、杂交频率的检测；、杂交频率的检测；、杂交频率的检测；、杂交频率的检测； 5 5、融合细胞的筛选。、融合细胞的筛选。、融合细胞的筛选。、融合细胞的筛选。作作 业业1 1、什么叫原生质体融合？原生质体融合在藻类育种、什么叫原生质体融合？原生质体融合在藻类育种、什么叫原生质体融合？原生质体融合在藻类育种、什么叫原生质体融合？原生质体融合在藻类育种上有何意义？上有何意义？上有何意义？上有何意义？2 2、种间原生质体细胞融合后，杂交细胞的遗传组成、种间原生质体细胞融合后，杂交细胞的遗传组成、种间原生质体细胞
39、融合后，杂交细胞的遗传组成、种间原生质体细胞融合后，杂交细胞的遗传组成与性状表现有何改变？与性状表现有何改变？与性状表现有何改变？与性状表现有何改变？实验五实验五 、总、总RNA抽提与鉴定抽提与鉴定【实验目的实验目的实验目的实验目的】n n1 1、学习总、学习总、学习总、学习总RNARNA分离的原理分离的原理分离的原理分离的原理n n2 2、掌握、掌握、掌握、掌握TrizolTrizol法总法总法总法总RNARNA提取的方法提取的方法提取的方法提取的方法n n3 3、了解各种的不同总、了解各种的不同总、了解各种的不同总、了解各种的不同总RNARNA提取方法提取方法提取方法提取方法【实验原理实验
40、原理实验原理实验原理】n nTRIZOLTRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总试剂是直接从细胞或组织中提取总试剂是直接从细胞或组织中提取总试剂是直接从细胞或组织中提取总RNARNA的试的试的试的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持剂。它在破碎和溶解细胞时能保持剂。它在破碎和溶解细胞时能保持剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNARNA的完整性。加的完整性。加的完整性。加的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNARNA存在存在存在存在于水样层中。收集上面的的水样层后，于水样
41、层中。收集上面的的水样层后，于水样层中。收集上面的的水样层后，于水样层中。收集上面的的水样层后，RNARNA可以通过可以通过可以通过可以通过异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的DNADNA和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出中间层的中间层的中间层的中间层的DNADNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。，在有机层中加入
42、异丙醇能沉淀出蛋白。，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化共纯化共纯化共纯化DNADNA对于样品间标准化对于样品间标准化对于样品间标准化对于样品间标准化RNARNA的产量十分有用。的产量十分有用。的产量十分有用。的产量十分有用。 n n无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)(50-100 mg)和细胞和细胞和细胞和细胞(5106)(5106)以及大量的组织以及大量的
43、组织以及大量的组织以及大量的组织(1 g)(1 g)和细胞和细胞和细胞和细胞(107)(107)均有较好的分离效果。均有较好的分离效果。均有较好的分离效果。均有较好的分离效果。TRIZOLTRIZOL试剂操作上的简单性试剂操作上的简单性试剂操作上的简单性试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOLTRIZOL抽提的总抽提的总抽提的总抽提的总RNARNA能够避免能够避免能够避免能够避免DNADNA
44、和蛋白的污染。故而和蛋白的污染。故而和蛋白的污染。故而和蛋白的污染。故而能够作能够作能够作能够作RNA RNA 印迹分析、斑点杂交、印迹分析、斑点杂交、印迹分析、斑点杂交、印迹分析、斑点杂交、poly(Apoly(A)+ )+ 选择、体外翻选择、体外翻选择、体外翻选择、体外翻译、译、译、译、RNARNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于酶保护分析和分子克隆。如果是用于酶保护分析和分子克隆。如果是用于酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCRPCR，当两，当两，当两，当两条引物位于单一外显子内时，建议用条引物位于单一外显子内时，建议用条引物位于单一外显子内时，建议用条引物位于单一外显子内时，建议用DN
45、aseDNase I I来处理抽提的来处理抽提的来处理抽提的来处理抽提的总总总总RNARNA。 n nTRIZOLTRIZOL试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种RNARNA。例如，从大鼠肝脏抽提的例如，从大鼠肝脏抽提的例如，从大鼠肝脏抽提的例如，从大鼠肝脏抽提的RNARNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于啶染色，可见许多介于啶染色，可见许多介于啶染色，可见许多介于7 kb7 kb和和和和15 k
46、b15 kb之间不连续的高分子量之间不连续的高分子量之间不连续的高分子量之间不连续的高分子量条带（条带（条带（条带（mRNAmRNA和和和和hnRNAhnRNA成分），两条优势核糖体成分），两条优势核糖体成分），两条优势核糖体成分），两条优势核糖体RNARNA条带条带条带条带位于位于位于位于5 kb (28S)5 kb (28S)和和和和2 kb (18S)2 kb (18S)，低分子量，低分子量，低分子量，低分子量RNARNA介于介于介于介于0.1 0.1 和和和和 0.3 0.3 kbkb之间之间之间之间 ( (tRNAtRNA, 5S), 5S)。当抽提的。当抽提的。当抽提的。当抽提的R
47、NARNA用用用用TETE稀释时其稀释时其稀释时其稀释时其A260/A280A260/A280比值比值比值比值 1.8 1.8 。【实验器具实验器具】n n水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、TipTip头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速头、高压灭菌锅、恒温
48、摇床、台式冷冻高速头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、微量移液器、分光光度计等。微量移液器、分光光度计等。微量移液器、分光光度计等。微量移液器、分光光度计等。【试试 剂剂】n nTRIzolTRIzol、DEPC(DEPC(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯) )、氯仿、异丙、氯仿、异丙、氯仿、异丙、氯仿、异丙醇、无水乙醇、醇、无水乙醇、醇、无水乙醇、醇、无水乙醇、7575乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、TETE缓冲液、缓冲液、
49、缓冲液、缓冲液、TBE TBE 电泳缓冲液（电泳缓冲液（电泳缓冲液（电泳缓冲液（55）、）、）、）、EBEB、上样缓冲液、琼脂糖、上样缓冲液、琼脂糖、上样缓冲液、琼脂糖、上样缓冲液、琼脂糖等等等等【操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤】n n1 1、组织匀浆化：用、组织匀浆化：用、组织匀浆化：用、组织匀浆化：用glass-Teflonglass-Teflon或强力匀浆器或强力匀浆器或强力匀浆器或强力匀浆器( (PolytronPolytron, , 或或或或 TekmarsTekmars TISSUMIZER TISSUMIZER 或或或或equivalent)equivalent)搅搅搅搅匀组织
50、样品，每匀组织样品，每匀组织样品，每匀组织样品，每50100 mg50100 mg组织加组织加组织加组织加1ml1ml的的的的TRIZOLTRIZOL。匀浆。匀浆。匀浆。匀浆化时组织样品容积不能超过化时组织样品容积不能超过化时组织样品容积不能超过化时组织样品容积不能超过TRIZOLTRIZOL容积的容积的容积的容积的10%10%。（备选。（备选。（备选。（备选方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能
51、需要一额外的如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在分离步骤。匀浆化后在分离步骤。匀浆化后在分离步骤。匀浆化后在2 28C8C的条件下以的条件下以的条件下以的条件下以12,000g12,000g的离心的离心的离心的离心力离心力离心力离心力离心1010分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量包含有细胞外膜，多
52、糖，以及高分子量包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNADNA，而上层的，而上层的，而上层的，而上层的超浮游物含有超浮游物含有超浮游物含有超浮游物含有RNARNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量。在来自于脂肪组织的样品中，大量。在来自于脂肪组织的样品中，大量。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行亮的匀浆溶液转移到一干净的
53、试管中加入氯仿并继续进行亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。）下述的分离步骤。）下述的分离步骤。）下述的分离步骤。）n n2 2、分离阶段：将匀浆样品在、分离阶段：将匀浆样品在、分离阶段：将匀浆样品在、分离阶段：将匀浆样品在151530C30C条件下条件下条件下条件下孵育孵育孵育孵育5 5分钟以使核蛋白体完全分解。每分钟以使核蛋白体完全分解。每分钟以使核蛋白体完全分解。每分钟以使核蛋白体完全分解。每1 ml 1 ml TRIZOLTRIZOL加加加加0.2 ml0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用氯仿。盖紧样品管
54、盖，用手用氯仿。盖紧样品管盖，用手用氯仿。盖紧样品管盖，用手用力剧烈摇晃试管力剧烈摇晃试管力剧烈摇晃试管力剧烈摇晃试管1515秒并将其在秒并将其在秒并将其在秒并将其在30C30C下孵育下孵育下孵育下孵育2 23 3分钟。在分钟。在分钟。在分钟。在2 28C8C下以不超过下以不超过下以不超过下以不超过12,000g12,000g的离心力的离心力的离心力的离心力高速冷冻离心高速冷冻离心高速冷冻离心高速冷冻离心1515分钟。离心后混合物分成三层：分钟。离心后混合物分成三层：分钟。离心后混合物分成三层：分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚下层红色的苯酚下层红色的苯酚下层红色的苯酚- -氯仿层，中
55、间层，上层无色的氯仿层，中间层，上层无色的氯仿层，中间层，上层无色的氯仿层，中间层，上层无色的水样层。水样层。水样层。水样层。RNARNA无一例外地存在于水样层当中。无一例外地存在于水样层当中。无一例外地存在于水样层当中。无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加水样层的容量大约为所加水样层的容量大约为所加水样层的容量大约为所加TRIZOLTRIZOL容量的容量的容量的容量的60%60%。n n3 3、RNARNA的沉淀：将水样层转移到一干净的试的沉淀：将水样层转移到一干净的试的沉淀：将水样层转移到一干净的试的沉淀：将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离管中，如果希望分离管中，如果
56、希望分离管中，如果希望分离DNADNA和蛋白，有机层同样和蛋白，有机层同样和蛋白，有机层同样和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀淀淀淀RNARNA。最初均化时的每。最初均化时的每。最初均化时的每。最初均化时的每1 ml TRIZOL1 ml TRIZOL对应对应对应对应0.5 0.5 mlml异丙醇的加入量。将混合的样品在异丙醇的加入量。将混合的样品在异丙醇的加入量。将混合的样品在异丙醇的加入量。将混合的样品在151530C30C条件下孵育条件下孵育条
57、件下孵育条件下孵育1010分钟，并在分钟，并在分钟，并在分钟，并在2 28C8C下以不超过下以不超过下以不超过下以不超过12,000g12,000g的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心1010分钟。分钟。分钟。分钟。RNARNA沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。片状沉淀附着于试管壁和管底。片状沉淀附着于试管壁和管底。片状沉淀附着于试管壁和管底。n n4 4、RNARNA的洗脱：移去上层悬液。用的洗脱
58、：移去上层悬液。用的洗脱：移去上层悬液。用的洗脱：移去上层悬液。用75%75%的乙的乙的乙的乙醇洗涤醇洗涤醇洗涤醇洗涤RNARNA沉淀一次，每沉淀一次，每沉淀一次，每沉淀一次，每1 ml1 ml的的的的 TRIZOLTRIZOL至少至少至少至少加加加加1 ml1 ml的的的的75%75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在乙醇。旋涡振荡混合样品并在乙醇。旋涡振荡混合样品并在乙醇。旋涡振荡混合样品并在2 28C8C下以不超过下以不超过下以不超过下以不超过7,500g7,500g的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心的离心力高速冷冻离心5 5分钟。分钟。分钟。分钟。n n5 5、RNA
59、RNA的再溶解：在操作的最后，简单干燥的再溶解：在操作的最后，简单干燥的再溶解：在操作的最后，简单干燥的再溶解：在操作的最后，简单干燥RNARNA沉淀（空气干燥或真空干燥沉淀（空气干燥或真空干燥沉淀（空气干燥或真空干燥沉淀（空气干燥或真空干燥5 51010分钟），分钟），分钟），分钟），不要在真空管里离心干燥不要在真空管里离心干燥不要在真空管里离心干燥不要在真空管里离心干燥RNARNA。尤为重要的是，。尤为重要的是，。尤为重要的是，。尤为重要的是，不能让不能让不能让不能让RNARNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它沉淀完全干燥那样会极大地降低它沉淀完全干燥那样会极大地降低它沉淀完全干燥那样会极大
60、地降低它的可溶性。用无的可溶性。用无的可溶性。用无的可溶性。用无RNARNA酶的水或酶的水或酶的水或酶的水或0.5% SDS0.5% SDS溶液来溶液来溶液来溶液来溶解溶解溶解溶解RNARNA，可在，可在，可在，可在555560C60C下孵育下孵育下孵育下孵育1010分钟，分钟，分钟，分钟，RNARNA还能用还能用还能用还能用100%100%去离子甲酰胺溶解，去离子甲酰胺溶解，去离子甲酰胺溶解，去离子甲酰胺溶解，70C70C保存。保存。保存。保存。n n6 6、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNARNAn
61、n配制配制配制配制1.2%1.2%变性琼脂糖凝胶变性琼脂糖凝胶变性琼脂糖凝胶变性琼脂糖凝胶(40 (40 mLmL) )n n称取称取称取称取0.48 g,0.48 g,加入加入加入加入DEPCDEPC水水水水25.2 mL,5X25.2 mL,5X电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液4 4 mLmL, , 加加加加热使溶解，稍冷却加入甲醛热使溶解，稍冷却加入甲醛热使溶解，稍冷却加入甲醛热使溶解，稍冷却加入甲醛3.4 3.4 mLmL, , 混匀，室温凝固混匀，室温凝固混匀，室温凝固混匀，室温凝固0.5-1 0.5-1 h.h.n nRNARNA电泳检测样品制备电泳检测样品制备电泳检测样品
62、制备电泳检测样品制备RNA 2 RNA 2 ll 甲醛甲醛甲醛甲醛 2.5 2.5 ll 甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺 7.5 7.5 ll10MOPS 2 10MOPS 2 ll RNA Loading Buffer2 RNA Loading Buffer2 ll 灭菌的灭菌的灭菌的灭菌的DEPC DEPC 水水水水4 4 lln n混合液轻轻混匀并离心，放于混合液轻轻混匀并离心，放于混合液轻轻混匀并离心，放于混合液轻轻混匀并离心，放于6565下温育下温育下温育下温育 5 min5 min后，置于后，置于后，置于后，置于冰上。冰上。冰上。冰上。n n电泳检测电泳检测电泳检测电泳检测n n将将将将
63、1.2%1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1MOPS1MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约电泳缓冲液，覆盖凝胶约电泳缓冲液，覆盖凝胶约电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm1 mm。将。将。将。将RNARNA样品加到凝胶点样品加到凝胶点样品加到凝胶点样品加到凝胶点样孔中，在样孔中，在样孔中，在样孔中，在5 V/cm5 V/cm条件下电泳条件下电泳条件下电泳条件下电泳30 min30 min，然后在，然后在，然后在，然后在EBEB中染色中染色中染色中染色15-20 min15-20 min，在紫外灯下
64、观察提取的，在紫外灯下观察提取的，在紫外灯下观察提取的，在紫外灯下观察提取的RNARNA的质量。的质量。的质量。的质量。n n7 7、核酸蛋白定量仪测定总、核酸蛋白定量仪测定总、核酸蛋白定量仪测定总、核酸蛋白定量仪测定总RNARNA的纯度和含量：在超净工的纯度和含量：在超净工的纯度和含量：在超净工的纯度和含量：在超净工作台上吸取作台上吸取作台上吸取作台上吸取95ul95ul无菌水到无菌水到无菌水到无菌水到EPEP管中，加入管中，加入管中，加入管中，加入5l5l总总总总RNARNA溶液，溶液，溶液，溶液，充分混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在充分混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在充分
65、混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在充分混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在260nm260nm、280nm280nm、230nm230nm的的的的ODOD值。然后计算值。然后计算值。然后计算值。然后计算RNARNA的浓度，并分析的浓度，并分析的浓度，并分析的浓度，并分析其纯度。其纯度。其纯度。其纯度。n n计算浓度：对于计算浓度：对于计算浓度：对于计算浓度：对于ssRNAssRNA，1.0 OD260=40ug/ml1.0 OD260=40ug/ml。 n n测定纯度：纯的测定纯度：纯的测定纯度：纯的测定纯度：纯的RNARNA溶液其溶液其溶液其溶液其OD260/OD280OD260/
66、OD280的比值应介的比值应介的比值应介的比值应介于于于于1.81.8至至至至2.02.0，OD260/OD230OD260/OD230的比值应大于的比值应大于的比值应大于的比值应大于2.02.0。 n nRNARNA样品样品样品样品OD260/OD280OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯的比值太小，说明有蛋白或苯的比值太小，说明有蛋白或苯的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于酚污染。比值大于酚污染。比值大于酚污染。比值大于2.02.0，则可能被异硫氰酸胍污染。，则可能被异硫氰酸胍污染。，则可能被异硫氰酸胍污染。，则可能被异硫氰酸胍污染。 n nOD260/OD230OD26
67、0/OD230的比值小于的比值小于的比值小于的比值小于2.02.0时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。纯的纯的纯的纯的DNADNA溶液其溶液其溶液其溶液其OD260/OD280OD260/OD280应为应为应为应为1.81.8，OD260/OD230OD260/OD230应大于应大于应大于应大于2.02.0。 n nOD260/OD280OD260/OD280大于大于大于大于1.91.9时，表明有时，表明有时，表明有时，表明有RNARNA污染，小于污染，小于污染，小于污染，小于1.61.6时时时时表明有蛋白质或酚污染。表明有蛋白质或酚
68、污染。表明有蛋白质或酚污染。表明有蛋白质或酚污染。n nOD260/OD230OD260/OD230小于小于小于小于2.02.0时，表明溶液中有残存的盐和小时，表明溶液中有残存的盐和小时，表明溶液中有残存的盐和小时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。实验六实验六 第一链第一链cDNA合成合成【实验目的实验目的实验目的实验目的】n n1 1、掌握第一链、掌握第一链、掌握第一链、掌握第一链cDNAcDNA合成的原理。合成的原理。合成的原理。合成的原理。n n2 2、掌握第一
69、链、掌握第一链、掌握第一链、掌握第一链cDNAcDNA合成的方法合成的方法合成的方法合成的方法【实验原理实验原理实验原理实验原理】n n所有合成所有合成所有合成所有合成cDNAcDNA第一链的方法都要用依赖于第一链的方法都要用依赖于第一链的方法都要用依赖于第一链的方法都要用依赖于RNARNA的的的的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶( (反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶) )来催化反应。目前商品化反转来催化反应。目前商品化反转来催化反应。目前商品化反转来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞录酶有从禽类成髓细胞瘤病
70、毒纯化到的禽类成髓细胞录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒病毒病毒病毒(AMV)(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的逆转录酶和从表达克隆化的逆转录酶和从表达克隆化的逆转录酶和从表达克隆化的MoloneyMoloney鼠白血鼠白血鼠白血鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒病毒病毒病毒(MLV)(MLV)反转录酶。反转录酶。反转录酶。反转录酶。AMVAMV反转录酶包括两个具有若干反转录酶包括两个具有若干反转录酶包括两个具有若干反转
71、录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基种酶活性的多肽亚基种酶活性的多肽亚基种酶活性的多肽亚基, ,这些活性包括依赖于这些活性包括依赖于这些活性包括依赖于这些活性包括依赖于RNARNA的的的的DNADNA合成合成合成合成, ,依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的 DNADNA合成以及对合成以及对合成以及对合成以及对DNA:RNADNA:RNA杂交体杂交体杂交体杂交体的的的的RNARNA部分进行内切降解部分进行内切降解部分进行内切降解部分进行内切降解(RNA(RNA酶酶酶酶HH活性活性活性活性) )。MLVMLV反转录反转录反转录反转录酶只有单个多肽亚基酶只有单个多肽亚基酶只有单个多肽亚基
72、酶只有单个多肽亚基, ,兼备依赖于兼备依赖于兼备依赖于兼备依赖于RNARNA和依赖于和依赖于和依赖于和依赖于DNADNA的的的的DNADNA合成活性合成活性合成活性合成活性, ,但降解但降解但降解但降解RNA:DNARNA:DNA杂交体中的杂交体中的杂交体中的杂交体中的RNARNA的的的的 能力较弱能力较弱能力较弱能力较弱, ,且对热的稳定性较且对热的稳定性较且对热的稳定性较且对热的稳定性较AMVAMV反转录酶差。反转录酶差。反转录酶差。反转录酶差。MLVMLV反转录酶能合成较长的反转录酶能合成较长的反转录酶能合成较长的反转录酶能合成较长的cDNAcDNA( (如大于如大于如大于如大于2-3k
73、b)2-3kb)。AMVAMV反反反反转录酶和转录酶和转录酶和转录酶和MLVMLV反转录酶利用反转录酶利用反转录酶利用反转录酶利用RNARNA模板合成模板合成模板合成模板合成cDNAcDNA时的时的时的时的最适最适最适最适pHpH值值值值, ,最适盐浓度和最适温室各不相同最适盐浓度和最适温室各不相同最适盐浓度和最适温室各不相同最适盐浓度和最适温室各不相同, ,所以合成所以合成所以合成所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。第一链时相应调整条件是非常重要。第一链时相应调整条件是非常重要。第一链时相应调整条件是非常重要。 AMV AMV反转录酶和反转录酶和反转录酶和反转录酶和MLVMLV反转录酶都
74、必须有引物来起反转录酶都必须有引物来起反转录酶都必须有引物来起反转录酶都必须有引物来起始始始始DNADNA的合成。的合成。的合成。的合成。cDNAcDNA合成最常用的引物是与真核细合成最常用的引物是与真核细合成最常用的引物是与真核细合成最常用的引物是与真核细胞胞胞胞mRNAmRNA分子分子分子分子33端端端端poly(Apoly(A) )结合的结合的结合的结合的12-1812-18核苷酸长的核苷酸长的核苷酸长的核苷酸长的oligo(dToligo(dT) )。以。以。以。以RNARNA分子为模板，合成出一条分子为模板，合成出一条分子为模板，合成出一条分子为模板，合成出一条DNADNA链。链。链
75、。链。形成的形成的形成的形成的DNADNA是与是与是与是与RNARNA模板互补的，因而反转录产生的模板互补的，因而反转录产生的模板互补的，因而反转录产生的模板互补的，因而反转录产生的DNADNA分子称之为分子称之为分子称之为分子称之为cDNAcDNA。【实验器具实验器具】n n离心机、冰盒、口罩、手套、离心机、冰盒、口罩、手套、离心机、冰盒、口罩、手套、离心机、冰盒、口罩、手套、EPEP管架、超净工管架、超净工管架、超净工管架、超净工作台、移液器、作台、移液器、作台、移液器、作台、移液器、DEPCDEPC处理过的枪头、处理过的枪头、处理过的枪头、处理过的枪头、EPEP管等。管等。管等。管等。【
76、试试 剂剂】n n5M-MLV RT Buffer5M-MLV RT Buffer、 2.5mM 2.5mM dNTPdNTP mix mix 、 RNaseRNase抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂(30U/L)(30U/L)、M-MLV Reverse M-MLV Reverse TranscriptaseTranscriptase、Oligo(dT)18 primerOligo(dT)18 primer、DEPCDEPC处处处处理过的水等。理过的水等。理过的水等。理过的水等。【实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤】n n1 1在在在在DEPCDEPC处理过的处理过的处理过的处理过的EPEP管中加入约
77、管中加入约管中加入约管中加入约0.10.12g2g总总总总RNARNA和和和和1l 0.5g/l1l 0.5g/l的的的的 Oligo(dT)18 primerOligo(dT)18 primer，加，加，加，加DEPCDEPC水到水到水到水到12l12l，小心混匀，小心混匀，小心混匀，小心混匀，7070保温保温保温保温5 5分钟（使分钟（使分钟（使分钟（使总总总总RNARNA变性，去除大部分的二级结构），立即浸变性，去除大部分的二级结构），立即浸变性，去除大部分的二级结构），立即浸变性，去除大部分的二级结构），立即浸入冰水中（使入冰水中（使入冰水中（使入冰水中（使mRNAmRNA与与与与Ol
78、igo(dTOligo(dT) )退火）。退火）。退火）。退火）。n n2 2按次序分别加入下列试剂：按次序分别加入下列试剂：按次序分别加入下列试剂：按次序分别加入下列试剂： 4l 5M-MLV RT Buffer4l 5M-MLV RT Buffer2l 2l dNTPdNTP mix(10mM) mix(10mM)1l 1l RNaseRNase抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂(20U/L) (20U/L) 1l M-MLV Reverse Transcriptase(200U/L)1l M-MLV Reverse Transcriptase(200U/L)n n3 3小心混匀，室温离心小心混匀，室温离心小心混匀，室温离心小心混匀，室温离心5 5秒，将所有溶液收集到秒，将所有溶液收集到秒，将所有溶液收集到秒，将所有溶液收集到管底，管底，管底，管底，4242保温保温保温保温1 1小时。小时。小时。小时。n n4 47070处理处理处理处理5 5分钟，冰上冷却（使酶变性，）。分钟，冰上冷却（使酶变性，）。分钟，冰上冷却（使酶变性，）。分钟，冰上冷却（使酶变性，）。n n5 5用于用于用于用于PCRPCR扩增或扩增或扩增或扩增或-20-20保存备用。保存备用。保存备用。保存备用。
