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1、实验实验6 6 微生物的计数、大小微生物的计数、大小的测定和酵母菌的死活鉴别的测定和酵母菌的死活鉴别 实实 验验 目目 的的n学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方法法 。 n了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术和技术 。n了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测定微生物细胞大小的方法。定微生物细胞大小的方法。 实实 验验 原原 理理 n1. 1. 两种常用计数方法，即直接计数法（血球计数板计数两种常用计数方法，即直接计数法（血球计数板计数法）和间接计数法（平板菌落计数法）。本实验是利用
2、血法）和间接计数法（平板菌落计数法）。本实验是利用血球计数板进行直接计数。球计数板进行直接计数。n2.2.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，换算成单位体利用血球计数板，在显微镜下进行计数，换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。的总和，故又称为总菌计数法。n3.3.美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌染美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。血血球球计计数数板板的的构构造造9个大格个大格16小
3、格小格25中格中格25小格小格16中格中格无论哪一种都是无论哪一种都是400个小格个小格计数室计数室血球计数板的分区与分格例一例一 1大格大格=16中格中格 =16X25小格小格 =400小格小格数数25x4=100小格小格例二例二 1大格大格=25中格中格 =25X16小格小格 =400小格小格数数16x5=80小格小格血球计数板的构造血球计数板的构造每个大方格面积为每个大方格面积为1mm2 ，高度为，高度为0.1mm，所以每个计数室的体积为所以每个计数室的体积为 0.1x1=0.1mm3每个小格的体积每个小格的体积0.1/400=1/4000mm3 =1/4000,000ml计数方法：计数
4、方法： 通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上方格的平均值，再乘上25或或16，就得出一个大方格中的总菌，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。菌液中的总菌数。 设被选作计数的中方格中的总菌数为设被选作计数的中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B： 如果是如果是25个中方格的计数板，则个中方格的计数板，则1mL1mL菌液中的总菌数菌液中的总菌数=A/52510=A/525104 4B=50000ABB=50000AB（个）（个） 如果是如果是16个中方格的计
5、数板，则个中方格的计数板，则1mL1mL菌液中的总菌数菌液中的总菌数=A/41610=A/416104 4B=40000ABB=40000AB（个）（个）n微生物细胞大小的测量是在显微镜下用微生物细胞大小的测量是在显微镜下用目镜测微尺目镜测微尺来进行来进行的，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在的，但由于测量的是放大后的图像，故目镜测微尺在不同不同放大倍率放大倍率下每格下每格实际实际代表的长度也随之变化，因此，需用代表的长度也随之变化，因此，需用物镜测微尺物镜测微尺来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代来校正在不同放大倍率下目镜测微尺每格所代表的表的实际长度实际长度。 n物镜测微尺是中
6、央刻有精确刻度的载玻片，一般是将物镜测微尺是中央刻有精确刻度的载玻片，一般是将1 mm1 mm等分为等分为100100格，每格长格，每格长0.01mm0.01mm，即，即10 um10 um，它，它不直接不直接用于测用于测量细胞大小，而是用于量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺校正目镜测微尺的每格的相对长度。的每格的相对长度。n目镜测微尺每格长度目镜测微尺每格长度( (umum) ) 实实 验验 材材 料料n1%1%酵母菌悬液（市售的干酵母粉）酵母菌悬液（市售的干酵母粉）n血球计数板、盖玻片、吸水纸血球计数板、盖玻片、吸水纸n显微镜、接种环、显微镜、接种环、分类计数器分类计数器 n0.1%0.1
7、%的美蓝染色液的美蓝染色液 n目镜测微尺，物镜测微尺目镜测微尺，物镜测微尺 、显微镜、载玻片、盖、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、玻片、吸水纸、0.1%0.1%的美蓝染色液的美蓝染色液 实实 验验 步骤步骤1 1 制备菌悬液、染色制备菌悬液、染色 用吸管吸取菌悬液（用吸管吸取菌悬液（1 1滴）加入试管，用生理滴）加入试管，用生理盐水（盐水（8 8滴）进行稀释，滴加（滴）进行稀释，滴加（1 1滴）美兰染色液。（自己进一步稀释滴）美兰染色液。（自己进一步稀释100100倍）倍）2 2 加菌悬液样品加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管
8、将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液（注意一定不要有溢（注意一定不要有溢出和产生气泡）出和产生气泡）。3 3 显微镜计数显微镜计数 加样后静止加样后静止1 min1 min，先用低倍镜然，先用低倍镜然后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般只数上方和左边线上的，当酵母菌芽体达到母细胞只数上方和左边线上的，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。计数一个样大小的二分之一时
9、，可记作两个细胞。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。实实 验验 步骤步骤n微生物名称 总菌数 个/ml4 4 清洗血球计数板清洗血球计数板 计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。5.5.计算计算 ：利用相应公式进行计算（见前面公式或者课本公式），并将实验结果填入作业中的表格内。微生物大小测量实微生物大小测量实 验验 步骤步骤（）装目镜测微尺装目镜测微尺 （二）（二）校正目镜测微尺校正目镜测微尺 1.
10、1.将将物镜测微尺物镜测微尺刻度刻度面朝上面朝上放在显微镜载物台上放在显微镜载物台上 2. 2.先用先用低倍镜低倍镜观察，将观察，将目镜测微尺目镜测微尺刻度与刻度与物镜测微尺物镜测微尺的的刻刻度平行度平行。使两尺的。使两尺的第一条刻度线第一条刻度线相重合，再寻找两尺的相重合，再寻找两尺的另一条另一条重重合的刻度线，分别合的刻度线，分别记录记录两重合线之间两重合线之间物镜测微尺物镜测微尺和和目镜测微尺目镜测微尺所所占的格数，由公式占的格数，由公式计算计算出出目镜测微尺目镜测微尺每格所代表的长度。每格所代表的长度。 3. 3.用同样的方法换成用同样的方法换成高倍镜高倍镜进行校正，进行校正，记录记录
11、并并计算计算在每种在每种倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。倍率下目镜测微尺每一格所代表的长度。实实 验验 步骤步骤（三）（三）酵母细胞大小的测定酵母细胞大小的测定 1 1 制备菌悬液、染色：制备菌悬液、染色： 用吸管吸取菌悬液（用吸管吸取菌悬液（1 1滴）加入试管，滴）加入试管，用生理盐水（用生理盐水（8 8滴）进行稀释，滴加（滴）进行稀释，滴加（1 1滴）美兰染色液。滴）美兰染色液。 2 2 制片：制片： 用吸管吸取用吸管吸取1 1滴滴上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，上述菌悬液滴加到干净的载玻片上，盖上盖玻片盖上盖玻片（注意一定不要有溢出和产生气泡）（注意一定不要有溢出和产生气泡），将多余
12、菌液，将多余菌液用吸水纸吸干。用吸水纸吸干。 3 3 显微镜下观察、测量：显微镜下观察、测量：在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，在不同倍率下测量菌体的长度和宽度，记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。记录测定值，并计算出酵母的长、宽值。 实验注意事项实验注意事项n1.1.要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。n2.2.菌液稀释倍数要合适。用前摇匀，如果浓度过大就再菌液稀释倍数要合适。用前摇匀，如果浓度过大就再稀释，如果过小再重做。稀释，如果过小再重做。n3.3.计上不计下，计左不计右。出芽计一半计上不计下，计左不计右。出芽计一半n4.4.浓度稀释标准：浓度稀
13、释标准：以每小方格内含有以每小方格内含有5-105-10个酵母细胞为个酵母细胞为宜，一般稀释宜，一般稀释1010倍即可。倍即可。 n5.5.计数室内一定不要有溢出和产生气泡。计数室内一定不要有溢出和产生气泡。n6.6.其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。n7.7.确保血球计数板清洗干净。可以加点酒精清洗。确保血球计数板清洗干净。可以加点酒精清洗。n使用血球计数板计数时，应注意什么？使用血球计数板计数时，应注意什么？n将计数结果填入表格中。将计数结果填入表格中。n简单说明酵母菌死活染色的原理。简单说明酵母菌死活染色的原理。结果与思考题结果与思考题结果与思考题结果与思考题n填写实验表一和实验表二，完成酵母菌孢子的大小测定。填写实验表一和实验表二，完成酵母菌孢子的大小测定。表一 目镜测微尺校正结果目镜测微尺校正结果 接物镜接物镜倍数接目镜倍数目微尺格数物微尺格数目微尺每格实际长度低倍镜高倍镜表二 酵母细胞大小测定结果酵母细胞大小测定结果接物镜倍数目微尺每格实际长度宽长菌体大小范围目微尺格数宽度/um目微尺格数长度/umn为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正。对目镜测微尺进行校正。
