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1、第四章第四章 药物定量分析药物定量分析 与分析方法验证与分析方法验证第一节 定量分析样品的前处理方法第二节 定量分析方法的特点第三节 药品质量标准分析方法验证第四节 生物样品分析方法的基本要求第一节第一节 定量分析样品定量分析样品的前处理方法的前处理方法一一 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法二二 经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法(一)(一)直接测定法直接测定法(二)(二)经水解后测定法经水解后测定法 直接回流后测定法(碱水解)含卤素 硫酸水解后测定法含金属 (三)(三)经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法富马酸亚铁的含量测定原理富
2、马酸亚铁的含量测定原理Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe3+ Fe2+ + e- -Fe3+红色红色浅蓝色浅蓝色OOCCHOHCCO+Fe2+直接回流后测定法直接回流后测定法方法方法:将含卤素有机药物溶于适当溶剂(如乙醇)中,:将含卤素有机药物溶于适当溶剂(如乙醇)中,加入氢氧化钠溶液(或一定量过量的硝酸银滴定液)后,加入氢氧化钠溶液(或一定量过量的硝酸银滴定液)后,加热回流使其水解,将有机结合的卤素转变为无机的卤加热回流使其水解,将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子,然后采用银量法(素离子,然后采用银量法(Volhard法)测定。法)测定。适用范围适用范围:含卤素有机药物结构中卤素原
3、子结合不牢固:含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物(如卤原子和脂肪碳原子相连者)的药物(如卤原子和脂肪碳原子相连者)例如例如:三氯叔丁醇的测定三氯叔丁醇的测定原原 理理 三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解,氯元三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解,氯元素全部转变成氯化钠,然后用剩余滴定法,即于水素全部转变成氯化钠,然后用剩余滴定法,即于水解液中加硝酸酸化,再加入定量过量的硝酸银滴定解液中加硝酸酸化,再加入定量过量的硝酸银滴定液,使液,使Cl-生成生成AgCl沉淀,过量的硝酸银,以沉淀,过量的硝酸银,以Fe3+为为指示剂,用硫氰酸铵液回滴定。指示剂,用硫氰酸铵液回滴定。 CCl3-
4、 -C(CH3)2- -OH + 4NaOH 回流回流(CH3)2- -CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2ONaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCNAgSCN + NH4NO3(淡棕红色)(淡棕红色)(Ksp=1.561010 )(Ksp=1.010- -12 )Fe3+ + SCN Fe (SCN) 2+ 经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法方法方法:将含卤素有机药物在碱性或酸性下,加还原剂(如锌粉)加热回流,药物产生还原裂解反应,使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子,然后采用银量法(Fajans法)测定。适用范围适用范围:本法适用于测
5、定结构中碘与苯环直接相连,且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。 例如例如:泛影酸和碘番酸的测定泛影酸碘番酸 碱性还原后测定法碱性还原后测定法 酸性还原后测定法酸性还原后测定法COOHINHCOCH3IIH3COCHN+ 11NaOH + Zn回流回流COONaN H2 H2N+ 3NaI + 2CH3COONa+ 2Na2ZnO2 + H2O经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法(一)湿法破坏 (二)干法破坏(三)氧瓶燃烧法湿法破坏湿法破坏1硝酸-高氯酸法2硝酸-硫酸法3硫酸-硫酸盐法4其他湿法 干法破坏干法破坏方法:灼烧灰化 注意事项:420 适用范围 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 将有机药
6、物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧,并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中,然后根据欲测物质的性质,采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。特点特点:简便、快速、破坏完全。:简便、快速、破坏完全。适用范围适用范围:适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分:适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分 析。尤其适用于微量样品的分析。析。尤其适用于微量样品的分析。例如:例如:操操 作作 燃烧瓶的准备燃烧瓶的准备:用洗液洗净后,按各药品项下的规定加入吸收液,将:用洗液洗净后,按各药品项下的规定加入吸收液,将瓶口用水湿润,小心急速地通入瓶口用水湿润,小心急速地通入氧气氧气1min,立即用表面皿覆盖
7、瓶口。立即用表面皿覆盖瓶口。 样品的准备样品的准备:取样品适量,精密称定后按规定方法包裹,固定于铂丝:取样品适量,精密称定后按规定方法包裹,固定于铂丝下端的网内或螺旋处。下端的网内或螺旋处。 样品的燃烧样品的燃烧:点燃包有供试品的滤纸尾部,迅速放入燃烧瓶中,按紧:点燃包有供试品的滤纸尾部,迅速放入燃烧瓶中,按紧瓶塞,加水少量封闭瓶口,俟燃烧完毕(应无黑色碎片),充分振摇,瓶塞,加水少量封闭瓶口,俟燃烧完毕(应无黑色碎片),充分振摇,使生成的烟雾完全吸入吸收液中,放置使生成的烟雾完全吸入吸收液中,放置15min,用水少量冲洗瓶塞及铂丝,用水少量冲洗瓶塞及铂丝,合并洗液及吸收液,同法另做空白试验。
8、然后按各药品项下规定的方法合并洗液及吸收液,同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。进行鉴别、检查或含量测定。第二节第二节 定量分析方法的特点定量分析方法的特点 一一 容量分析法容量分析法 二二 光谱分析法光谱分析法 三三 色谱分析法色谱分析法容量分析法容量分析法1 适用范围适用范围2 注意注意3 计算计算(1)滴定度)滴定度(2)百分含量)百分含量 光谱分析法光谱分析法(一)紫外分光光度法(一)紫外分光光度法1 特点特点 2 仪器的校正和检定仪器的校正和检定3 对溶剂的要求对溶剂的要求4 测定方法测定方法(二)荧光分析法(二)荧光分析法1 特点特点2 含量测定含
9、量测定色谱分析法色谱分析法HPLC1 对仪器的一般要求对仪器的一般要求2 系统适用性试验系统适用性试验3 测定方法测定方法GC法法1 对仪器的一般要求对仪器的一般要求 2 系统适用性试验系统适用性试验3 测定方法测定方法第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 一一 验证的目的验证的目的 二二 需验证的情况需验证的情况 三三 需验证的分析项目需验证的分析项目 四四 验证的内容验证的内容 药品质量标准分析方法验证的药品质量标准分析方法验证的目的目的证明所证明所用用/建建分析方法满足检测的要求分析方法满足检测的要求 需验证的情况需验证的情况 药品质量标准起草时药品质量标准起草
10、时 药物合成方法变更、制剂的组分变更、原药物合成方法变更、制剂的组分变更、原 分析方法进行修订时分析方法进行修订时验证过程和结果均需记入验证过程和结果均需记入药品标准起草说明或修订说明中药品标准起草说明或修订说明中 采用标准时采用标准时需验证的分析项目需验证的分析项目1 鉴别鉴别试验试验2 杂质杂质定量或限度检查;制剂中其它成分定量或限度检查;制剂中其它成分(降解产物、防腐剂等)的测定(降解产物、防腐剂等)的测定3 原料或制剂中有效成分原料或制剂中有效成分含量含量测定;溶出度、测定;溶出度、释放度等功能检查中溶出量等的测定释放度等功能检查中溶出量等的测定 验证的内容验证的内容(一)(一) 准确
11、度准确度(二)(二) 精密度精密度(三)(三) 专属性专属性(四)(四) 检测限检测限(五)(五) 定量限定量限(六)(六) 线性线性(七)(七) 范围范围(八)(八) 耐用性耐用性准确度准确度 accuracy 1 概念概念 2 含量测定方法的准确度含量测定方法的准确度 3 杂质定量测定的准确度杂质定量测定的准确度 准确度准确度 准确度是指用该方法准确度是指用该方法测定的结果测定的结果与与真实值或参考真实值或参考值值接近的程度,一般用接近的程度,一般用回收率回收率(%)表示。)表示。 测定回收率(测定回收率(recovery)可采用)可采用“回收试验法回收试验法”或或“加样回收试验法加样回收
12、试验法”。 规定范围内,至少制备高、中、低三个浓度的样规定范围内,至少制备高、中、低三个浓度的样品各三个,用品各三个,用9次测定结果评价准确度。次测定结果评价准确度。RSD应在应在2%以内。以内。 回收试验 空白+已知量A的对照品(或标准品) 测定值为M(测三次) 加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品(或标准品) 测定值为M(测三次)精密度精密度 precision 重复性重复性 中间精密度中间精密度 重现性重现性精密度精密度 在规定条件下,同一个均匀样品,经多次取样在规定条件下,同一个均匀样品,经多次取样测定所得结果之间的接近程度。测定所得结果之间的接近程度。 精密
13、度用精密度用偏差偏差(d)与相对偏差()与相对偏差(RD)、标准)、标准偏差(偏差(SD)、相对标准偏差()、相对标准偏差(RSD、变异系数、变异系数CV)表示表示。 重复性重复性 在在相同条件相同条件下,由下,由同一分析人员同一分析人员测定所得测定所得结果的精密度。结果的精密度。 在规定范围内,至少用在规定范围内,至少用9次测定结果评价。次测定结果评价。如制备三个不同浓度的样品,各测三次;或把如制备三个不同浓度的样品,各测三次;或把被测物浓度当作被测物浓度当作100%,至少测定,至少测定6次。次。中间精密度中间精密度同一实验室,同一实验室,不同不同时间(日期)时间(日期)不同不同分分析人员用
14、析人员用不同不同设备测定结果的精密度。设备测定结果的精密度。 考察随机变动因素对精密度的影响。考察随机变动因素对精密度的影响。重现性重现性不同实验室不同实验室,不同分析人员不同分析人员测定结果的精密度。测定结果的精密度。当分析方法将被当分析方法将被法定标准法定标准采用时,应进行重现性试采用时,应进行重现性试验。如:建立药典分析方法时通过协同检验得出重验。如:建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果。协同检验的过程、重现性结果均应记载现性结果。协同检验的过程、重现性结果均应记载在标准起草说明中。在标准起草说明中。 专属性专属性 specificity 指有其他成分(杂质、降解物、辅料等)指有
15、其他成分(杂质、降解物、辅料等)可能存在的情况下,采用的方法能准确测定出可能存在的情况下,采用的方法能准确测定出被测物的特性。被测物的特性。 是该法用于复杂样品分析时相互干扰程度是该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。的量度。检测限检测限 limit of detection,LOD 1 非仪器分析目视法非仪器分析目视法 2 仪器分析时的测定法仪器分析时的测定法 (1) 用紫外过分光光度法和荧光分析法时用紫外过分光光度法和荧光分析法时 (2) 用用GC法和法和HPLC 法时法时检测限检测限 指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。 是一种限度检验效能
16、指标,反映方法与仪器的是一种限度检验效能指标,反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小,也表示样品经处理后空白灵敏度和噪音的大小,也表示样品经处理后空白(本底)值的高低。(本底)值的高低。 常用常用%、ppm、ppb表示。表示。非仪器分析目视法非仪器分析目视法 用用已已知知浓浓度度的的被被测测物物,试试验验出出能能被可靠地检测出的最低浓度或量。被可靠地检测出的最低浓度或量。 信噪比法信噪比法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。低浓度或量。 一般以信噪比一般以信噪比
17、 S/N=3 或或 S/N=2 时的相应浓度时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。或注入仪器的量确定检测限。 用于能显示基线噪音的分析方法。用于能显示基线噪音的分析方法。定量限定量限 1imit of quantitation,LOQ 样品中被测物能被定量测定的最低量,此结果应具有一定准确度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。 常用信噪比法确定定量限,一般以信噪比 S/N=10时相应的浓度或注入仪器的量来确定。 也可用仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值,再经试验确定。 线线 性性 在设计的范围内,测试结果与试样在设计的范围内,测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。中
18、被测物浓度直接呈正比关系的程度。 范范 围围 指达到一定精密度、准确度和线指达到一定精密度、准确度和线性的条件下,测试方法适用的高低限性的条件下,测试方法适用的高低限浓度或量的区间。浓度或量的区间。耐用性耐用性 指测定条件稍有变动时,测定结果不受指测定条件稍有变动时,测定结果不受影响的承受程度,为常规检验提供依据。影响的承受程度,为常规检验提供依据。 是衡量实验室和工作人员之间在正常情是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。况下实验结果重现性的尺度。第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求一一 常用样品的种类、采集和贮藏常用样品的种类、采集和贮藏二
19、二 生物样品分析前处理技术生物样品分析前处理技术三三定量分析方法验证定量分析方法验证 常用样品的种类、采集和贮藏常用样品的种类、采集和贮藏(一)血样(血浆、血清、全血)(二)唾液(三)尿液生物样品分析前处理技术生物样品分析前处理技术(一)(一)去除蛋白质去除蛋白质(二)缀合物的水解(二)缀合物的水解(三)(三)分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集(四)(四)化学衍生化化学衍生化 选择生物样品分析前处理技术需考虑的选择生物样品分析前处理技术需考虑的因素因素生物样品的类型生物样品的类型:是样品分离纯化的依据。药物的结构、性质、药理作用、存在形式和药物的结构、性质、药理作用、存在形式和浓度范围浓度范围等:是选择前处理方法的依据。测定方法测定方法:是决定样品是否需要纯化及纯化程度的依据,也是选择前处理方法的依据。 去除蛋白质去除蛋白质1加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂2加入中性盐加入中性盐3加入强酸加入强酸4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂5酶解法酶解法 分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集1液液-液提取法液提取法2液液-固提取法固提取法3被测组分的浓集被测组分的浓集 化学衍生化化学衍生化1GC中的化学衍生化中的化学衍生化2HPLC中的化学衍生化中的化学衍生化