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1、分子生物学第7章RNA的生物合成分子生物学分子生物学第第7章章 RNA的生物合成的生物合成 DNA是生物最重要的遗传物质，其贮存信息的方式是它的一级结构，蛋白质是生物体功能的主要执行者，其功能由特定的三维结构决定，但蛋白质的三维结构归根到底也是由其一级结构决定。要将DNA的一级结构转化为蛋白质的一级结构，首先需要按照碱基互补配对的原理，以DNA为模板，RNA，然后再以RNA为模板，合成蛋白质。这种以RNA为模板合成RNA的过程称为转录，以RNA为模板合成蛋白质的过程称为翻译或转译。转录和翻译统称为基因表达。7.1 DNA转录 7.1.1 转录的一般特征 (1) 转录发生在DNA分子上某些特定的
2、区域 转录只发生在DNA分子上具有转录活性的区域，DNA两条链并不是总会被转录。对某一特定基因来说，作为模板的DNA链称为模板链、无义链、Waston链，与模板链互补的另一条链称为编码链、有义链、Crick链。图7-1 DNA转录的的简单图解解 (2) 以NTP作为底物，需要Mg2+的激活。 (3) 需要模板，需要DNA解链，但不需要引物。 (4) 第一个被转录的核苷酸通常是嘌呤核苷酸。 (5) 转录的方向总是53。 (6) 转录具有高度的忠实性，但低于DNA复制。 (7) 转录受到严格调控，主要发生在转录起始阶段。复制和转录的共同点:DNA 模板碱基配对规律生成磷酸二酯键链延长方向53A-U
3、，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA(半保留复制)产物A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA产物RNA聚合酶DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录(不对称转录)两股链均复制模板转录复制需要引物不需要引物复制和转录的不同点:底物NTP产物RNAn1ATPn2GTPn3UTPn4CTPRNA聚合酶Mg2/Mn2DNA模板n1AMPn2GMPn3UMPn4CMP (n1+n2+n3+n4)PPi在RNA聚合酶的催化作用下，以DNA为模板，四种核糖核苷三磷酸(NTPs)为原料合成RNA的过程。 转录(Transcription)
4、转录过程中碱基配对差异：模板链(template strand)：在转录过程中直接参与指导RNA合成过程的DNA链，其序列与新合成的RNA链互补。编码链(coding strand)：在RNA合成过程中不直接参与指导RNA合成的DNA链，其序列与新合成的RNA链对应。DNARNA模板链编码链转录本RNA聚合酶5335模板链编码链(coding strand)编码链模板链(template strand) 高度的忠实性(high fidelity): 转录的忠实性是指一个特定基因的转录具有固定的起点和固定的终点，而且被转录产生的剪基序列，严格遵守碱基互补原则。 然而，转录出错率高于复制出错率。
5、因为RNA聚合酶没有校读功能。高度的进行性(highly progressive): 正常的转录一旦发生，就不会中途停止，转录终止前RNA聚合酶不从模板链解离下来。 一旦RNA聚合酶从模板链解离，则解离下来的酶不可能与解离点重新结合。调控区： 调控转录的区域不在转录产物的序列中，而是在转录开始位点的上游。 复制调控的区域在复制产物序列中。不对称转录 (asymmetric transcription)* 在DNA分子双链上某一区段，一股链可转录，另一股链不转录；* 模板链并非永远在同一单链上。模板模板链结构基因构基因转录方向方向转录方向方向模板模板链编码链编码链模板模板链不不对称称转录 转录单
6、位：一个转录区段可视为一个转录单位(操纵子，包括 若干个结构基因及其上游的调控序列。 +1转录起点编码区(开放阅读框)转录终点启动子终止子转录单位7.1.2 DNA转录的酶学 转录主要由RNA聚合酶催化。RAN聚合酶的三维结构高度保守。细菌、古细菌和真核生物细胞核和叶绿体的RNA聚合酶由多个亚基组成；噬菌体和线粒体基因组编码的RNA聚合酶只有1个亚基。 所有的多亚基RNA聚合酶都有5个核心亚基，细菌还有一个专门识别启动子的 因子。7.1.2.1 RNA聚合酶与DNA聚合酶的性质比较 RNA聚合酶催化的反应为：底物NTP产物RNAn1ATPn2GTPn3UTPn4CTPRNA聚合酶Mg2/Mn2
7、DNA模板n1AMPn2GMPn3UMPn4CMP (n1+n2+n3+n4)PPi7.1.2.2. 原核细胞RNA聚合酶的结构与功能7.1.2.2.1 细菌的RNA聚合酶 核心酶(core enzyme)：全酶(holoenzyme)：图7-2 E. coli RNA pol的体外的体外组装装亚基基因亚基数目功 能rpo A2装配亚基：与启动子上游元件和活化因子结合. rpo Brpo C11催化中心：结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成，与模板DNA结合。 rpo D1识别亚基：可识别启动子，促进转录的起始。1功能不详。大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的性质与功能 细菌的RNA聚合酶都受到利福霉素
8、和利链霉素的特异性抑制，这两种抑制剂作用的对象都是 亚基。利福霉素抑制转录的起始，阻止第三、四个核苷酸的掺入，利链霉素与聚合酶结合，抑制延伸。 这两种抑制剂不抑制真核生物细胞核的RNA聚合酶，但对线粒体和叶绿体内的RNA聚合酶有明显的抑制作用。7.1.2.2.2 古细菌的RNA聚合酶 在结构和组成上，古细菌的RNA聚合酶与真核生物的更像，而非细菌的RNA聚合酶。7.1.2.3 真核细胞的RNA聚合酶 真核细胞的RNA聚合酶在功能上有分工，不同性质的RNA分子由不同的RNA聚合酶催化合成。 细胞核有三种RNA聚合酶。线粒体和叶绿体也有RNA聚合酶，负责两种细胞器内所有RNA分子的合成。 真核细胞
9、RNA聚合酶自己不能直接识别启动子，必须借助于转录因子才能结合到启动子上。真核细胞RNA聚合酶的种类RNA聚合酶种类细胞部位功 能对抑制物 -鹅膏蕈碱敏感性聚合酶I核仁转录rRNA不敏感聚合酶II核质转录mRNA敏感聚合酶III核质转录小分子RNA，如tRNA、5S rRNA等中等敏感 细菌的RNA聚合酶受到利福霉素和利链霉素的抑制，但这两种抑制剂不抑制真核生物细胞核的RNA聚合酶。 真核生物细胞核RNA聚合酶对 鹅膏蕈碱表现出不同程度的敏感性。 利用 鹅膏蕈碱对三种RNA聚合酶的选择性抑制可判断细胞内的某一种RNA由哪一种聚合酶转录。 放线菌素D能插入到DNA的GC碱基对之间，导致DNA双螺
10、旋小沟变宽和扭曲，阻止转录延伸。rDNA的GC含量最高，因此，RNA聚合酶I对放线菌素D的作用最敏感。图7-3 鹅膏蕈碱的化学膏蕈碱的化学结构构 图7-4 放放线菌素菌素D的化学的化学结构构 7.1.3 原核生物的DNA转录 转录可分为三阶段：起始、延伸和终止。7.1.3.1 转录的起始 7.1.3.1.1 转录起始点 启动子是位于结构基因5端上游的一段DNA序列，可被RNA聚合酶识别并结合，以启动基因转录。 一般在转录起始点的上游存在转录启动子序列，它们具有高度的保守性。TATAATTTGACA启动子区结构基因-10 Box-35 Box531-10-35原核生物启动子10 Box：也称为P
11、ribnow盒，一致序列为TATAAT，有利于转录时双链的解开。35 Box：一致序列为TTGACA，提供聚合酶结合时的识别位点。 -35区域的核苷酸结构决定了启动子的强度。图7-9 原核生物几种基因的启原核生物几种基因的启动子序列子序列 图7-10 细菌菌RNA pol全全酶与启与启动子的子的结合合 某些活性超强的基因(rRNA基因)除了-35区和-10区的启动子序列，在-40和-60之间的区域还有一种称为增强元件的启动子序列，可将转录活性提高30倍。 启动子的一致序列是综合统计了多种基因的启动子序列后得出的结果。在大肠杆菌尚未发现与一致序列完全相同的启动子序列。 一个基因的启动子序列与一致
12、序列越接近，该启动子的启动效率就越高，为强启动子；相反，一个基因的启动子序列与一致序列差异越大，启动效率就越低，为弱启动子。7.1.3.1.2 转录起始复合物的形成 转录起始复合物的形成为DNA转录的限速步骤，起始效率主要由启动子强度决定：强启动子平均每秒钟启动一次，弱启动子花费的时间长得多。一旦启动，RNA链延伸的速度与启动子强度无关。 RNA聚合酶与模板DNA的结合开放式启动子复合物 (open promoter complex) DNA双链在-10 Box附近解开约14bp的区域，酶与模板形成紧密复合物。封闭式启动子复合物(closed promoter complex)全酶的因子识别-
13、35 Box，并与之结合。 RNA合成的起始RNA聚合酶(RNA Pol)起始位点(initiation site)通常结合一嘌呤碱基延伸位点(elongation site) 起始位点的嘌呤碱基与模板+1位碱基配对延伸位点引入与模板2位碱基配对的第二个NTP，形成磷酸二酯键新合成RNA链延伸约610碱基后，因子从全酶脱落延伸阶段在模板指导下依次引入NTP图7-12 基因基因转录起始起始过程中第一个磷酸二程中第一个磷酸二酯键的形成的形成 开放复合物内的RNA聚合酶往往会重复催化短RNA分子的合成并释放它们，这样的合成称为“无效”合成。聚合酶的活性中心最多能容纳8 nt，差不多等于“无效”转录物
14、的长度。 每合成一个“无效”转录物，聚合酶必须决定是离开启动子，进入延伸阶段，还是仍然结合在启动子上，重新启动RNA的从头合成。 一旦新生的RNA结合到酶的第二个RNA结合位点，酶的催化中心被“重新设定”，能够催化合成7 nt12 nt的RNA。 启动子清空指聚合酶离开启动子以实现转录从起始进入延伸的过程。 RNA聚合酶在合成前9个核苷酸的时候并没有在DNA上移位。当转录物长度达到一种稳定的RNA-DNA杂交双链的时候，启动子清空才开始发生。 因子使聚合酶对启动子有高亲和性， 因子一旦解离，核心酶就与非特异性DNA以一般的亲和性结合，这非常适合转录延伸。为防止 因子与延伸复合物中的核心酶重新结
15、合，一种新的蛋白质NusA作为延伸因子代替 因子与核心酶结合。图7-13 细菌基因菌基因转录从起始从起始阶段向延伸段向延伸阶段的段的转变 7.1.3.1.3 RNA聚合酶的移位和转录的延伸 当RNA聚合酶合成了大约10 nt的RNA，延伸便开始。此时转录物的长度足以让RNA取代 因子。 释放出来的 因子可重新与核心酶结合，再次启动新一轮DNA的转录，称为RNA聚合酶的循环。 当 因子释放后，延伸因子NusA蛋白加入进来，转录进入延伸阶段。 在延伸过程中，RNA聚合酶不断移位，转录新的模板链序列。图7-14 RNA pol的循的循环 因子的脱落，促进了RNA合成速度提高到约50核苷酸/秒分子酶。
16、Direction of transcriptionRewindingNegativesupercoilssupercoilsPositiveRNA-DNA hybrid(8bp)Active siteNTP chanelUnwindingCoding strandTemplate strand5RNA3图7-15 转录的延伸和的延伸和转录泡的泡的结构构 图7-16 RNA pol的移位反的移位反应 图7-18 转录过程中程中发生的各种事件生的各种事件 原核系统转录终止的主要方式，也称为简单终止。依赖于位于RNA转录物3-端的一串U序列，以及位于紧靠U序列上游的一个富含GC碱基对的发夹结构。7
17、.1.3.1.5 转录终止(1) 不依赖 因子的终止图7-20 不依不依赖因子的因子的转录终止子止子结构构 (2) 依赖 因子的终止 因子( factor)：由50kD亚基组成的六聚体，是一种ATP依赖型解链酶，可解开RNA/DNA和RNA/RNA双链。图7-22 因子与因子与转录物的物的结合合 图7-23 依依赖因子的因子的转录终止止 7.1.4 真核生物的DNA转录7.1.4.1 真核生物DNA转录与细菌DNA转录的主要差别 (1) 染色质和核小体结构对转录有深刻影响 (2) 真核生物的RNA聚合酶与细菌有许多重要的差别 (3) 转录的正常进行，除了需要RNA聚合酶外，还需要许多转录因子的
18、参与。 (4) 启动子以外的序列参与调节基因的转录。 (5) 转录与翻译不存在偶联关系。 (6) 转录的产物多为单顺反子，而原核生物的基因转录产物为多顺反子。真核生物启动子由转录因子识别。 蛋白蛋白辅助因子助因子 转录因子因子 TF-I RNA pol I TF-II RNA pol II TF-III RNA pol III 转录因因子子(transcription factor,TF)：能能直直接接或或间接接与与结构构基基因因上上游游的的调控控序序列列(DNA序序列列)或或RNA聚聚合合酶结合合，影响影响转录的蛋白的蛋白质因子。因子。 某某些些转录因因子子是是三三种种RNA聚聚合合酶共共有
19、有的的，如如TBP，另一些另一些转录因子因子则是各是各RNA聚合聚合酶特有的。特有的。 真核生物包括三类启动子： 类型类型启动子启动子(class promoter)控制控制rRNA的转录的转录类型类型启动子启动子(class promoter)控制控制mRNA的转录的转录类型类型启动子启动子(class promoter)控制小分子控制小分子RNA的转录的转录7.1.4.2 真核细胞核DNA转录的起始、延伸和终止7.1.4.2.1 RNA聚合酶I催化的转录 RNA聚合酶I负责催化28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA的转录，转录场所为核仁。这三种rRNA共用一个启动子，含有多
20、个拷贝。45S rRNA是它们的共同前体，通过转录后加工分别得到各自的产物。 图7-24 rRNA基因的基因的结构和构和组织 RNA聚合酶I转录的基因启动子由两部分组成：核心启动子，是转录所必需的，与基因的基础转录有关；上游控制元件(UCE)，是基因的有关转录所必需的。 RNA聚合酶I需要两种转录因子：UBF(UCE结合因子)、SL1。SL1包含TBP(TATA盒结合蛋白)和TAF(TBP相关因子)两种成分。 TBP是三种RNA聚合酶催化的转录所必需的蛋白质。7.1.4.2.2 RNA聚合酶III催化的转录 RNA聚合酶III负责催化tRNA、5S rRNA、7SL RNA、小分子 核 仁 R
21、NA(SnoRNA)、 无 帽 子 结 构 的 小 分 子 细 胞 核RNA(SnRNA)和某些病毒的mRNA等。 RNA聚合酶III转录的基因启动子有两类：一类位于基因的上游，属于外部启动子；另一类位于基因内部，被称为内部启动子。 RNA聚合酶III需要的转录因子有三种：TF III A、B、C。图7-26 RNA polIII催化催化转录的基因的启的基因的启动子子结构构 7.1.4.2.3 RNA聚合酶II催化的转录 RNA聚合酶II负责催化mRNA、具有帽子结构的snRNA和某些病毒RNA的转录。 蛋白质基因的转录受到各种顺式作用元件的控制，包括核心启动子、调控元件、增强子和沉默子。 顺
22、式作用元件：某些具有调节功能的特定DNA序列只能影响同一分子中的相关基因，发生在一个序列中的突变不会改变其他染色体上等位基因的表达，这样的序列称为顺式作用元件。顺式作用元件一般没有转录产物。 反式作用因子：某些调节蛋白通过扩散结合于细胞内的多个靶位点，发生突变后将同时影响不同染色体上等位基因的表达，这样的蛋白称为反式作用因子。核心启动子 也称基础启动子，参与招募和定位RNA聚合酶II到转录起始点，从而正确地启动基因转录。包含下列元件： TATA盒 起始子(Initiator, Inr) TF II B识别元件(BRE) 下游启动子元件(DPE) GC盒 调控元件 包括上游临近元件(UPE)和上
23、游诱导元件(UIE)。 增强子和沉默子 增强子是一种能大幅度提高基因转录效率的顺式作用元件。可远距离作用(可大于几个kb)； 位于启动子上游或下游都可发挥作用；可在模板链上或也可位于编码链上；功能与序列方向性无关；具有组织特异性。 沉默子是一种抑制基因表达的顺式作用元件。图7-28 RNA polII负责转录的基因的启的基因的启动子子结构特征构特征 参与蛋白质基因转录的转录因子有两类：一类是基础转录因子或基础转录因子(GTF)，另一类为特异性转录因子。前一类为所有蛋白质基因表达所必需，后一类为特定的基因表达所必需。 基础转录因子的功能包括：识别和结合核心启动子，招募RNA聚合酶II，正确地与启
24、动子结合；与其他上游元件或反式作用因子结合或相互作用；参与蛋白质与蛋白质的相互作用，有助于转录起始复合物的装配和稳定。基础转录因子包括TF II A、B、C、C、E、F、H、J等。7.2 RNA复制复制 RNA复制是以RNA为模板合成RNA的过程，发生在许多RNA病毒的生活史中，由依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP，也称RNA复制酶)催化。 RdRP在正常宿主细胞中并不存在，必须由病毒基因组编码。 RNA复制具有以下特征： (1) 复制的方向为53； (2) 绝大多数在模板的一端从头合成，少数需要引物。引物为共价结合的蛋白质或5-帽子； (3) 属于易错、高突变的RNA合成； (4) 对放线
25、菌素D一般不敏感，但对核糖核酸酶敏感； (5) 复制绝大多数发生在宿主细胞的细胞质，少数在细胞核。7.2.1 双链RNA病毒的RNA复制 双链RNA病毒在感染宿主细胞后，其基因组RNA不能用作mRNA，因此在病毒包装的时候就将RdRP包装到病毒颗粒中，以便在病毒进入宿主细胞后能通过转录合成mRNA。 病毒侵入细胞后，借助病毒带进去的RNA复制酶合成正链RNA，再以后者为模板，合成病毒蛋白质和复制病毒RNA。7.2.2 单链RNA病毒的RNA复制7.2.2.1 正链RNA病毒的RNA复制 正链RNA病毒一旦进入宿主细胞，即可直接利用其RNA作为mRNA，翻译出蛋白质。病毒RNA的复制由RNA复制
26、酶催化，经过互补的反基因组负链RNA中间物，再合成出新的基因组RNA。 SARS病毒RNA复制的基本步骤包括： (1) 病毒感染宿主细胞后，其RNA复制酶基因立即被翻译； (2) 产生的RNA复制酶催化反基因组RNA(负链RNA)的合成； (3) 以负链RNA为模板，转录一系列3-端相同、但5-端不同的亚基因组mRNA； (4) 每一个亚基因组RNA只有第一个基因被翻译成蛋白质； (5) 全长的mRNA并不作为翻译模板，而是作为基因组RNA被包装到新病毒颗粒中。图7-32 正链RNA和负链RNA基因组的复制图7-33 正正链RNA病毒的病毒的RNA复制复制7.2.2.2 负链RNA病毒的RNA复制 负链RNA病毒进入宿主细胞后，必须拷贝成与其互补的正链RNA，才能制造出病毒蛋白。在新病毒颗粒包装时，需要将RNA复制酶包装到病毒颗粒中，以便在病毒进入新的宿主细胞后能够迅速转录出mRNA。图7-34 流感病毒的生活史流感病毒的生活史
