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1、实验实验光学显微镜使用及光学显微镜使用及显微摄影显微摄影实验一实验一 光学显微镜光学显微镜使用及显微摄影技术使用及显微摄影技术授课人：龚授课人：龚 莉莉3. 3. 激光共聚激光共聚焦扫描显微镜焦扫描显微镜 LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管 用用激光作扫描光源激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光
2、扫描显微镜显微镜有较高的分辨力有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的，大约是普通光学显微镜的3 3倍。倍。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计也可以用
3、于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。以及细胞形态的测量。 4.暗视野显微镜 暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microscopedark field microscope）的聚光镜中）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm4-200nm的的微粒子，分辨率可比普通显微镜高微粒子，分辨率可比普通
4、显微镜高5050倍倍。5.相差显微镜 一种介壳虫的染色体一种介壳虫的染色体 相差显微镜相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。标本和活细胞。 活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化振幅并不发生变化，仅相位发生变化( (振幅差振幅差) )，这，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，利用光的衍射和
5、干涉现象，把相差变把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。 相差显微镜和普通显微镜的区别是相差显微镜和普通显微镜的区别是: :用环状光用环状光阑代替可变光阑，阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。并带有一个合轴用的望远镜。6. 偏光显微镜偏光显微镜 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡偏光显微是
6、鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然具有双折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。利用偏光显微镜。 双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折应用在矿物、化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，这就需要利用偏光显微镜加以区分。在植物学方面，如射性，这就需要利用偏光显微镜加以区分。在植物学方
7、面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。 7.微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜nDICDIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体显微镜其
8、优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。体感更强。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）8. 倒置显微镜 组成和普通显微镜一组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观载物台之上，用于观察培养的活细胞，具察培养的活细胞，具有相差物镜。有相差物镜。9. 透射电子显微镜 JEM-1011透射电子显微镜 莱卡超薄切片机 u用透过样品的用透过样品的电子束电子束使其成像的电子
9、显微镜。使其成像的电子显微镜。u在光学显微镜下无法看清在光学显微镜下无法看清亚显微结构或超微亚显微结构或超微结构。结构。电子束的波长要比可见光和紫外光短电子束的波长要比可见光和紫外光短得多。目前得多。目前TEMTEM的分辨力可达的分辨力可达0.2nm0.2nm。u由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约标本须制成厚度约50nm50nm左右的左右的超薄切片超薄切片。这。这种切片需要用超薄切片机种切片需要用超薄切片机（ultramicrotomeultramicrotome）制作。电子显微镜的放）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍大倍数最
10、高可达近百万倍 要知道的几个重要的分辨率要知道的几个重要的分辨率n人眼：人眼：0.2mm/250mm0.2mm/250mmn光学显微镜：光学显微镜：0.2um0.2umn电子显微镜：电子显微镜：0.2nm0.2nm内质网透射电镜图（伪彩色）内质网透射电镜图（伪彩色） 冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片 10. 扫描电子显微镜 JEOLJEOL扫描电子显微镜扫描电子显微镜 人类血细胞SEM照片 11、显微操作仪、显微操作仪用显微镜附加细微操纵装置所组成的显微手术器械。用显微镜附加细微操纵装置所组成的显微手术器械。 转基因显微操作过程厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本4 - 5
11、 um4 - 5 um2um2um基础知识基础知识n显微摄影装置的安装与调试显微摄影装置的安装与调试nn显微镜的光路调整显微镜的光路调整nn装入胶片装入胶片nn取景聚焦取景聚焦nn暴光暴光: 1/15sec(应先测光应先测光:绿灯亮可以正确暴光绿灯亮可以正确暴光)nn黑白胶片的冲洗黑白胶片的冲洗:显影显影 3min停显停显 10sec定影定影 15min水洗水洗:流水流水冲洗冲洗30min 晾干晾干nn印相放大印相放大:取景聚焦取景聚焦暴光暴光显影显影 停显停显 10sec定影定影 15min水洗水洗:流水冲洗流水冲洗30min nn上光剪切上光剪切三、传统胶片显微摄影过程显微摄影技术利利用用
12、显显微微摄摄影影装装置置拍拍摄摄显显微微镜镜( (或或解解剖剖镜镜) )视野中物象的技术称为视野中物象的技术称为显微摄影显微摄影。 显微摄影技术主要包括两个方面：显微摄影技术主要包括两个方面： 1)1)拍拍摄： 需要一套完备的显微摄影装置需要一套完备的显微摄影装置 2)2)洗印放大洗印放大：需要一个较好的暗室和成套的需要一个较好的暗室和成套的洗印放大设备。洗印放大设备。一、显微摄影一、显微摄影n( (一一 ) )仪仪 器器 与与设备设备 n进进行行显显微微摄摄影影最最基本的仪器是：基本的仪器是： n显微镜显微镜 n显微镜摄影仪显微镜摄影仪 n1.1.材料材料 n(1)活植物材料如幼小器官，活的
13、组织切片，细胞和原生质体，细胞团、愈伤组织、植物表面等。材料新鲜无异物。 n(2)死植物材料如各种植物组织的永久切片(见树脂切片)，被分离的细胞与细胞器，染色体的压片等。切片清洁无尘，无气泡。所摄部份完整清晰。 材料与试剂材料与试剂 2.2.试剂试剂显微摄影后胶卷需冲冼，显微摄影常用显定影液的配方见表1 表表1 1几种显微摄影常用显定影液的配方几种显微摄影常用显定影液的配方 ( (三三) )操作方法及注意事项操作方法及注意事项n1.1.安装显微摄影装置安装显微摄影装置 n将相机，显微镜和照明设备连一起，并能在观察镜中看到所要拍摄的标本。 n安装时，需先细读说明书，熟悉仪器结构和功能，连接部位要
14、稳固。2.2.调整好显微镜调整好显微镜n(1)(1)聚光器和光源灯的聚光器和光源灯的调中中 显微摄影通常采用中心亮视野透射照明法，摄影前，要把聚光器和光源灯调中，使聚光器中心与视场光阑的中心处于同一光轴上。光源灯的灯丝照明于视野中心。3.3.底片选择底片选择n(1)1)底片种底片种类： n摄影用的底片有硬片(透明玻璃上涂以感光乳剂而成)和软片(胶片与胶卷)。4.4.曝光的确定曝光的确定n曝光是曝光是显微微摄影的一个关影的一个关键。 曝光过度，使底片密度很大，昏暗不清，丧失影纹细节，反差太小。 曝光不足，整个底片密度很小，比较透明，虽然最大密度部分影纹分明，但最小密度和灰雾密度一样，没有影纹存在
15、，缺乏正常反差。这类底片，根本不能印放出合格的照片。 n曝曝光光最最重重要要的的问题就就是是判判定定曝曝光光时间，确确定定快快门速度速度。 显微摄影的视野，亮度变化极大，曝光时间的变化范围宽广，正确估计曝光时间比普通野外摄影要困难得多。 常用的估计影象亮度来确定曝光时间的方法，往往因人眼对光强度的显著变化不会有科学的定量分析而致使发生错误。显微摄影曝光参考表显微摄影曝光参考表5.5.取景对焦和拍摄取景对焦和拍摄6.6.记录记录n由于显微摄影是记录科学研究结果的一种方法，因此在显微摄影中，每拍一张或每拍一批都要详细记录已拍底片的拍摄条件和情况，如被摄标本特点、仪器组合、照片条件、曝光时间、底片型
16、号等，以作往后工作参考。二、洗印和放大二、洗印和放大n1.1.显影罐法显影罐法 ( (一一) )底片冲洗底片冲洗显显 影影停停 影影定定 影影清清 洗洗晾晾 干干采用化学的方法(已感光的乳剂与显影液起化学反应)使底片上的潜影成为可见影象(不稳定)的过程。 显影前最好先向罐中倒入20左右的清水，浸洗12min，使底片的全部药膜均匀浸湿后，倒出清水。 n1.1.显影罐法显影罐法 ( (一一) )底片冲洗底片冲洗显显 影影停停 影影定定 影影清清 洗洗晾晾 干干停显液作用：一是制止显影后底片乳剂膜中残存的显影液继续发生作用，防止底片显影过度产生斑痕或灰雾等现象；二是防止显影液内碱性物质带入定影液，并
17、与定影液中的酸性物或矾类作用产生亚硫酸铝的白色沉淀。 常用停显液为1.34%醋酸水溶液，摇动几下，约半min倒出停显液。 n1.1.显影罐法显影罐法 ( (一一) )底片冲洗底片冲洗显显 影影停停 影影定定 影影清清 洗洗晾晾 干干用定影剂溶解感光乳剂中未感光的卤化银，使不稳定影象变为稳定影象的过程。 加入等量定影液，约1520min后，倒出定影液。 n1.1.显影罐法显影罐法 ( (一一) )底片冲洗底片冲洗显显 影影停停 影影定定 影影清清 洗洗晾晾 干干定影后的底片上还残留许多硫代硫酸钠或银的络合物。必须经充分水洗，以避免底片发黄或变色。中速流水冲洗时，胶卷不少于20min。用于制作单色
18、幻灯片的电影正片水洗干净后即可转入染色处理 至少要30min以上。n1.1.显影罐法显影罐法 ( (一一) )底片冲洗底片冲洗显显 影影停停 影影定定 影影清清 洗洗晾晾 干干科研底片或暂时不染色的幻灯片底片，水洗后可用片夹夹住胶卷两端，其中一端悬起，拭干底片水珠，用夹子夹住凉干。置通风阴凉而无尘处晾干。2.2.盆中显影法盆中显影法取三只搪瓷盘或塑料盘，排成一排，依次加入20显影液、停影液和定影液。要注意设法使温度保持20左右，如有空调设备最理想。 要求暗室内全暗，除彩色片外，也可在暗红或深暗绿色的安全灯下操作。 取出底片使药膜面向上，迅速而均匀地浸入显影液中，然后不断使盆中药液移动，显影时间
19、根据底片情况而定。显影结束后，洗相夹住底片边缘，投入停显液中约半min，再取出放入定影液中约1520min后，这时可开灯，检查底片上乳白色是否完全消除，再放15min，就可取出在流水中冲洗半小时以上。最后用夹子夹住底片凉干。血液凝塊構造（紅色為紅血球，藍色為血小板，黃色為纖維蛋白）原來長這種模樣啊海鹽晶體, 保持著大海的顏色,喜歡 !電腦晶片（有一點灰塵落在上面）有這麼顏色漂亮的灰塵嗎 ?蘿蔔種子正在發芽 ,神奇的感覺食糖晶體 ,以後不吃糖了T恤的領子 (汗垢粘在棉纖維表面)打結的頭髮帶有頭皮屑的頭髮廚房抹布（含有細菌、真菌菌絲和酵母菌）打印紙上的纖維 廚房砧板表面（含有桿菌、絲狀菌和真菌）覺
20、得挺漂亮的鵝的羽毛 ,好稀疏的感覺香煙過濾嘴纖維表面的煙霧粒子 ,一看就有毒, 嘿嘿絲綢纖維 ,好舒服的感覺我是說絲綢 ,可不是上面的灰塵食鹽的結晶房間裏的灰塵三、实验用品三、实验用品n双目显微镜，生物标本，擦镜纸等双目显微镜，生物标本，擦镜纸等四、实验内容四、实验内容1 1、双目显微镜的操作规范：、双目显微镜的操作规范：取送取送放置放置对光对光低倍物镜使用低倍物镜使用高倍物高倍物镜使用镜使用油镜使用油镜使用保养维护保养维护2 2、NIKON80iNIKON80i显微摄影系统的操作流程显微摄影系统的操作流程3 3、胶片放大洗印技术流程、胶片放大洗印技术流程取景聚焦取景聚焦曝光曝光显影显影蒸馏水蒸馏水10min 10min 定定影影15-30min 15-30min 水流冲洗过夜水流冲洗过夜五、作业五、作业1 1、双目显微镜操作流程、双目显微镜操作流程2 2、显微摄影技术流程、显微摄影技术流程
