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1、实验实验二二 琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测HBV PCRHBV PCR结果结果- -琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测apoBapoB基因多态性基因多态性分子医学技能分子医学技能分子医学技能分子医学技能基因检测基因检测电泳基本原理及相关电泳基本原理及相关知识知识电泳的概念电泳的概念l l带电粒子带电粒子（胶体颗粒、离子等）在（胶体颗粒、离子等）在电场电场的作用下在特定的的作用下在特定的介质介质中向与其电荷性中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。质相反的电极方向定向泳动的现象。l l广泛应用于生物大分子的分离和鉴定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定实验室中常用到的电泳实验室中常用到的电泳方法方法
2、（以介质分类（以介质分类） 纸电泳泳 醋酸醋酸纤维膜膜电泳泳 凝胶凝胶电泳泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳的电泳的基本原理基本原理利用物利用物质的两个差异来分离物的两个差异来分离物质l l电电荷差异荷差异荷差异荷差异 电荷性质电荷性质电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量电荷数量电荷数量l l分子差异分子差异分子差异分子差异 分子大小分子大小分子大小分子大小 分子形状分子形状分子形状分子形状DNA琼脂糖琼脂糖基本原理基本原理琼琼脂脂糖糖是是一一种种天天然然聚聚合合长长链链状状分分子子，常常温温下下为为固固体体粉粉末末，在在电电泳泳缓缓冲冲液中液中9090
3、以上溶解，以上溶解，4545 开始形成多孔性刚性滤孔开始形成多孔性刚性滤孔；在在在在pH8.0pH8.0（碱碱碱碱性性性性）的的的的环环境境境境中中中中DNADNA的的的的磷磷磷磷酸酸酸酸基基基基团团解解解解离离离离，使使使使DNADNA在在在在该该环环境境境境中中中中带带上上上上负电负电荷荷荷荷，在，在，在，在电场电场中向正极方向泳中向正极方向泳中向正极方向泳中向正极方向泳动动；因因因因为为各各各各种种种种DNADNA分分分分子子子子的的的的电电荷荷荷荷数数数数、构构构构象象象象、分分分分子子子子量量量量不不不不同同同同，它它它它们们在在在在通通通通过过凝凝凝凝胶胶胶胶立立立立体体体体网网网
4、网络络时时所所所所受受受受的的的的动动力力力力和和和和阻阻阻阻力力力力不不不不同同同同，所所所所以以以以泳泳泳泳动动的的的的速速速速度度度度有有有有差差差差异异异异，达达达达到到到到分分分分离离离离的的的的目的；目的；目的；目的；DNADNA显显 色色色色 剂剂 多多多多 用用用用 EBEB， 它它它它 能能能能 和和和和 碱碱碱碱 基基基基 间间 的的的的 氢氢 键键 结结 合合合合 ， 在在在在 波波波波 长长 为为254254nm365nmnm365nm的紫外光照射下呈橘的紫外光照射下呈橘的紫外光照射下呈橘的紫外光照射下呈橘红红色（色（色（色（530530nmnm）的的的的荧荧光。光。光
5、。光。EBEB的替代染料：的替代染料：的替代染料：的替代染料：SYBR GREENSYBR GREEN，GOLDVIEWGOLDVIEWDNADNA带中含带中含0.05g0.05g的微量的微量DNADNA，可以清晰地检测出来，可以清晰地检测出来实验试剂与实验试剂与材料材料基因组DNA及PCR产物电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1TAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB）， 6加样缓冲液 ： 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液HBV-PCRHBV-PCR产物产物产物产物实验评
6、价与总结实验评价与总结实验评价与总结实验评价与总结制备制备制备制备琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(1.5%(1.5%，已加，已加，已加，已加DNADNA染料染料染料染料) )PCRPCR产物电泳产物电泳产物电泳产物电泳apoBapoB基因基因基因基因PCRPCR产物产物产物产物制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶(1%(1%，已加，已加，已加，已加DNADNA染料染料染料染料) )PCRPCR产物电泳产物电泳产物电泳产物电泳观察结果观察结果观察结果观察结果电泳电泳染色染色制胶制胶观察结果观察结果观察结果观察结果本次实验课时间安排本次实验课时间安排15-20 min
7、40-50mA，1小时小时15-20 min30 min2个组个组 1-2个组个组 HBV-PCR电泳胶上样：电泳胶上样：PCR apoB电泳胶上样：电泳胶上样：正对照负对照待测样品1待测样品2待测样品3待测样品4正对照负对照待测样品1待测样品2待测样品3待测样品4正对照负对照待测样品1待测样品2待测样品3待测样品4第第1 1大组大组第第2 2大组大组第第3 3大组大组每块胶上样每块胶上样6-7个样品个样品 第第4 4大组大组电泳实验电泳实验的步骤及注意事项的步骤及注意事项 琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、凝固后拔梳） 倒缓冲液 （样品中加入1/5体积的上样buffer）加样，电泳（
8、方向、电压、时间） 染色与检测 （已在胶中加入染料，紫外下检测）实验注意实验注意事项事项1 .倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制板变形2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔3 .点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4 .EB染料有毒（强致癌物），切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔5 .紫外线观察不要太久实验结果与实验结果与分析分析HBV PCR检测结果（示例）检测结果（示例）PCR检测检测人人apoB基因多态性分析基因多态性分析PCR实验操作及注意事项实验操作及注意事项 ApoB 基因I. ApoB是富含胆固醇和甘油三酯脂蛋白
9、的重要组成成分，对脂质在人体转运、代谢、维持体内脂质水平的恒定起重要作用。II. 大量临床资料及流行病学调查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白（LDL）水平与动脉粥样硬化、高脂血症、心肌梗塞、动脉粥样硬化、高脂血症、心肌梗塞、动脉粥样硬化、高脂血症、心肌梗塞、动脉粥样硬化、高脂血症、心肌梗塞、冠心病冠心病冠心病冠心病呈正相关，是其主要危险因素之一。近十年来，从分子水平研究ApoB，阐明动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机理，寻找其遗传标志受到广泛重视，pp独立位于独立位于独立位于独立位于2 2号染色体短臂末端（号染色体短臂末端（号染色体短臂末端（号染色体短臂末端（2p232p23），单拷贝。基因），
10、单拷贝。基因），单拷贝。基因），单拷贝。基因全长全长全长全长43kb43kb，含，含，含，含2828个内含子和个内含子和个内含子和个内含子和2929个外显子。个外显子。个外显子。个外显子。pp功能：载脂蛋白功能：载脂蛋白功能：载脂蛋白功能：载脂蛋白ppApoBApoB基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有7575处，处，处，处，其中导致氨基酸变异的有其中导致氨基酸变异的有其中导致氨基酸变异的有其中导致氨基酸变异的有5454处。处。处。处。pp3 3 端高变区的数目可变的串联重复顺序（端高变
11、区的数目可变的串联重复顺序（端高变区的数目可变的串联重复顺序（端高变区的数目可变的串联重复顺序（VNTRVNTR），信），信），信），信号肽（号肽（号肽（号肽（SPSP）多态性。）多态性。）多态性。）多态性。ApoBApoB基因基因基因基因DNA 3 端高变异区域端高变异区域存在存在一种由一种由一种由一种由11-16bp11-16bp重复排列重复排列重复排列重复排列的富含的富含的富含的富含A-TA-T的超变异小卫星的超变异小卫星的超变异小卫星的超变异小卫星序列，分布于序列，分布于序列，分布于序列，分布于500-800bp500-800bp之间。之间。之间。之间。ApoB基因基因在此区域两端设计
12、引物，可检测其多态性在此区域两端设计引物，可检测其多态性利用利用ApoB基因多态性进行遗传多样性分析基因多态性进行遗传多样性分析Faisal Khan, Suhasini Bhatnagar and Suraksha Agrawal, Genetic variation of ApoB 3 hyper variable region polymorphism among Brahmins of North India, CURRENT SCIENCE, VOL. 86, NO. 5, 10 MARCH 20045% PAGEPCR-apoBPCR-apoB基因多态性产物的基因多态性产物的鉴定鉴
13、定取PCR产物全部上样14325671.5%胶，电泳（80mA, 120min）1：Marker2：待测样品13：待测样品24: 待测样品35: 待测样品46: 待测样品57：待测样品6-DNA-DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳EB染色10分钟，紫外灯下观察结果基因诊断基因诊断pp定义：应用分子生物学技术定义：应用分子生物学技术,在在DNA或或RNA水平，通过检测致病基因（内源或外源）的水平，通过检测致病基因（内源或外源）的存在、基因结构缺陷或表达异常，对人体状存在、基因结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。态和疾病作出诊断的方法。pp常用方法：核酸
14、杂交；常用方法：核酸杂交；PCR；限制性内切酶；限制性内切酶pp基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在DNADNA水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。pp对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，间接判别致病基因是否存在
15、，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。pp感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源 ( (病原体病原体病原体病原体) DNA) DNA的检测而作的检测而作的检测而作的检测而作出诊断。出诊断。出诊断。出诊断。基因诊断基因诊断pp基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在DNADNA水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。pp对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，
16、或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。pp感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源 ( (病原体病原体病原体病原体
17、) DNA) DNA的检测而作的检测而作的检测而作的检测而作出诊断。出诊断。出诊断。出诊断。基因诊断基因诊断基因突变的检测基因突变的检测 1、限制性酶切图谱直接分析法、限制性酶切图谱直接分析法 2、寡核苷酸探针斑点印迹杂交分析法、寡核苷酸探针斑点印迹杂交分析法 3、扩增阻滞突变体系、扩增阻滞突变体系 4、单链构象多态性分析法、单链构象多态性分析法 5、 DNA序列测定序列测定pp基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在DNADNA水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。pp对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已
18、明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。pp感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源 ( (病原体病原体病原体病原体) D
19、NA) DNA的检测而作的检测而作的检测而作的检测而作出诊断。出诊断。出诊断。出诊断。基因诊断基因诊断 基因连锁分析基因连锁分析 限制性片段长度多态性间接限制性片段长度多态性间接 (连锁连锁)分析法分析法pp基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在基因结构的异常可在DNADNA水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。水平直接检出。pp对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构对于致病基因尚未明确，或虽已明确但尚不知其结构和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借
20、助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，和突变位点，必需借助与致病基因连锁的遗传标记，间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。间接判别致病基因是否存在，称为基因连锁分析。pp感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源感染性疾病可通过对外源 ( (病原体病原体病原体病原体) DNA) DNA的检测而作的检测而作的检测而作的检测而作出诊断。出诊断。出诊断。出诊断。基因诊断基因诊断w 外源外源 DNA的检测的检测 检检检检测测测测是是是是否否否否存存存
21、存在在在在已已已已知知知知的的的的突突突突变变变变。适适适适用用用用于于于于对对对对发发发发病病病病具具具具有有有有直直直直接接接接因因因因果果果果关关关关系系系系的的的的致致致致病病病病基基基基因因因因已已已已明明明明确确确确，对对对对致致致致病基因的序列结构已完全或部分了解，分子机制已完全或部分清楚者。常用方法：病基因的序列结构已完全或部分了解，分子机制已完全或部分清楚者。常用方法：病基因的序列结构已完全或部分了解，分子机制已完全或部分清楚者。常用方法：病基因的序列结构已完全或部分了解，分子机制已完全或部分清楚者。常用方法：单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（s
22、ingle-strand comformational polymorphism,SSCPsingle-strand comformational polymorphism,SSCP）异源双链分析法（异源双链分析法（异源双链分析法（异源双链分析法（heteroduplex analysis,HAheteroduplex analysis,HA） 突变体富集突变体富集突变体富集突变体富集PCRPCR法（法（法（法（mutant-enriched PCRmutant-enriched PCR） 变性梯度凝胶电泳法（变性梯度凝胶电泳法（变性梯度凝胶电泳法（变性梯度凝胶电泳法（denaturing g
23、radinent electrophoresis,DGGEdenaturing gradinent electrophoresis,DGGE） 温度梯度凝胶电泳（温度梯度凝胶电泳（温度梯度凝胶电泳（温度梯度凝胶电泳（ temperature gradient gelelectrophoresis,TGGEtemperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。）。）。）。 化学切割错配法（化学切割错配法（化学切割错配法（化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCMchemical cleavage of mismatch
24、,CCM）等位基因特异性扩增法（等位基因特异性扩增法（等位基因特异性扩增法（等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASAAllele-specific amplification,ASA） 等位基因特异性寡核苷酸分析法（等位基因特异性寡核苷酸分析法（等位基因特异性寡核苷酸分析法（等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASOallele-specific oligonucleotide,ASO） 连接酶链反应（连接酶链反应（连接酶链反应（连接酶链反应（ligase chain reaction,L
25、CRligase chain reaction,LCR） DNADNA芯片技术（芯片技术（芯片技术（芯片技术（DNA chipDNA chip） 染色体原位杂交（染色体原位杂交（染色体原位杂交（染色体原位杂交（In situ hybridization of chromosomeIn situ hybridization of chromosome） 荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridiaation,FISHfluorescent in situ hybridiaation,FISH） RNARNA酶酶酶酶A A切割法（切割法（切割法（切割法（RNase A cleavageRNase A cleavage） DNADNA序列分析（序列分析（序列分析（序列分析（DNA sequencingDNA sequencing）基因突变的直接检测基因突变的直接检测
