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1、第七章第七章 植物表达载体构建与遗植物表达载体构建与遗传转化传转化 植物基因工程植物基因工程 植物基因工程以植物为对象，将从不同生物中分离到的基因，经酶切连接构成重组DNA分子，然后转入受体植物细胞使新基因在受体细胞内整合、表达，获得新的植物类型，再生植株通过无性或有性增殖将外源基因遗传给后代。 植物基因工程的作用与意义 植物基因工程能顺利地在不同物种间进行基因转移，因此育种学家可根据意愿改造植物的一些性状，在较短时间内使获得高产、优质、抗逆性强的作物新品种成为现实。 植物基因工程主要研究内容1) 目的基因的克隆与分离；2) 植物表达载体构建；3) 建立适宜的遗传转化再生体系；4) 遗传化即转
2、基因；5) 转化细胞或植物的筛选；6) 转化植株检测；7) 转基因植物环境释放的安全评价。一、植物表达载体构建一、植物表达载体构建 构建植物表达载体的目的 构建植物表达载体的主要目的是将目的基因进行修饰改造，使其转入受体植物后的表达符合目的需要。 分离获得的目的基因往往不具有完整的基因结构，而只是表达产物的可读框（ORF：open reading Frame）；还需加上启动子和终止子。 如果分离到的目的基因拥有完整的基因结构（即拥有启动子、表达产物的开放阅读框和终止子），因基因的表达特点不符合要求也需进行修饰改造；有些基因例外，如C4光合代谢途径的一些关键酶基因只能用原基因的所有完整结构才有可
3、能达到目的。 启动子（promoter） 启动子是位于基因的5端外测，紧挨转录起始位点一段非编码的核苷酸序列，它的功能是引导RNA聚合酶同基因的正确部位相结合； 终止子（terminator） 终止子是在基因3端下游外测与终止密码相邻的一段核苷酸序列，具有转录终止信号的功能。 一）影响构建植物表达载体的 主要因素 1)目的基因的结构特点；2)转化受体植物类型与种类；3)转化方法；4)转入受体植物的表达要求；5)植物表达载体类型；6)选择适宜的启动子与终止子；7)选择性标记基因及报告基因；(二）构建植物表达载体的一些基本知识与实验技能 从事植物表达载体构建工作主要是进行各种质粒的提取、纯化、酶切
4、、相关DNA片段的回收、连接、转化与验证等，需要一些分子生物学相关的知识和实验技能。 常用的基本技能：常用的基本技能：1)大肠杆菌、农杆菌的培养、继代与保存；2)大肠杆菌、农杆菌中的质粒小量提取、大肠杆菌中质粒大量提取与纯化；3)各种质粒载体的酶切，回收；4)大肠杆菌与农杆菌感受态细胞的制备；5)相关酶切DNA片段的连接与转化；6)PCR引物设计与检测。 进行植物表达载体构建时，根据所选载体的内切酶位点进行准确设计是工作的关键；但是这种仅仅基于分子生物学常识的设计不一定能保证成功，还有许多未知因素影响实验工作，能及时发现问题及并进行再次的合理设计有助于加快工作进度。 三）植物表达载体构建实例
5、1 1、 质粒质粒 构建含不同启动子的植物表达载体，构建含不同启动子的植物表达载体，用到用到pUCpepc、pSCL0041、 pUC19、pBI121四个不同的质粒。四个不同的质粒。 1）pUCpepc:为pUC19克隆载体，经XbaI内切酶位点插入甘蔗C4Ppc基因，抗性为Amp，由张木清研究员提供。2）pBI121BI121：植物表达载体，内含gus和nptII基因,启动子为35S,终止子为nos poly(A)，由本所陈平华博士提供。 3) pUC19:克隆载体，用于构建含2x35S启动子和35S poly(A)载体，从华美公司购买。4) pSCL0041植物表达载体植物表达载体:在左
6、右边界内含有hyg和带内含子的gus基因，且各自带有35S启动子和35S poly(A)、nos poly(A)。外源基因的启动子为2x35S，终止子为35S poly(A) 。 2、工具酶1）限制性内切酶;2）T4 DNA连接酶;3）RNaseA;4）CAIP;5) Taq DNA 聚合酶 ;二、植物二、植物遗传转化研究进展传转化研究进展 1、遗传转化效率、遗传转化效率 转化效率因转化再生体系与之相结合的转化方法，造成许多作物的转化植株出现嵌合体与育性问题嵌合体与育性问题，导致遗传转化效率比较低。 从理论上讲，一个好的遗传转化体系应能解决嵌合体及育性问题。即受体再生系统要再生效率高、再生植株
7、可育且不受基因型影响；另外，两者相互较好地匹配。 而实际上，由于多种因素的影响如转化方法要高效、被转化的部位与可转化再生部相同等问题至今仍未能很好解决。 农杆菌介导转化技术比较简单，但转化有基因型依赖、质粒与菌株特异性。 2 2、遗传转化与安全性、遗传转化与安全性 转基因研究中另一个焦点是转基因植物及产品的安全性问题，根据转化的对象不同通过选择不同的选择标记基因、使用Cre-lox重组系统或质体转化等手段解决。3、定向转化定向转化 在植物中IR HR几个数量级，因此不能定向插入外源基因。原因：外源DNA进入基因组时，与双链DNA发生断裂后进行修复时机制在前关：同源重组修复（HR）为主时外源基因按定向插入，非同源末端连接重组修复（NHEJ）时则能达到外源基因不能定向插入。而 Physcomitrella（moss基因组大小与水稻相当）能定向插入。
