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1、第第4 4章章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构Chapter 4. The covalent Chapter 4. The covalent structure of proteinstructure of protein 蛋蛋白白质质（proteinprotein）是是生生活活细细胞胞内内含含量量最最丰丰富富、功功能能最最复复杂杂的的生生物物大大分分子子，并并参参与与了了几几乎乎所所有有的的生生命命活活动动和和生生命命过过程程。因因此此，研研究究蛋蛋白白质质的的结结构构与与功功能始终是生命科学最基本的命题。能始终是生命科学最基本的命题。 一、蛋白质通论一、蛋白质通论（一）蛋白质的元素组成与
2、分类（一）蛋白质的元素组成与分类l 蛋白质主要元素组成：蛋白质主要元素组成：蛋白质主要元素组成：蛋白质主要元素组成：C C、HH、OO、N N、S S 及及及及 P P、FeFe、CuCu、ZnZn、MoMoI I、Se Se 等微量元素。等微量元素。等微量元素。等微量元素。 蛋蛋白白质质平平均均含含N量量为为16,这这是是凯凯氏氏（Kajedahl）定定 氮法测蛋白质含量的理论依据氮法测蛋白质含量的理论依据.蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N量量6.25根据分子根据分子形状分类形状分类球状蛋白质球状蛋白质纤维状蛋白质纤维状蛋白质结合结合蛋白质蛋白质根据组根据组成分类成分类活性蛋白质（如酶
3、蛋白、转运蛋白、运动蛋白、活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、 保护和防御蛋白、受体蛋白保护和防御蛋白、受体蛋白）根据功根据功能分类能分类非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）l 蛋白质的分类：蛋白质的分类：蛋白质的分类：蛋白质的分类：简单蛋白质简单蛋白质简单蛋白质分类结合蛋白质分类结合蛋白质分类(二）蛋白质分子的形状和大小：二）蛋白质分子的形状和大小： 纤维状蛋白：多数不溶于水和稀盐酸，少数如血纤维蛋白可溶纤维状蛋白：多数不溶于水和稀盐酸，少数如血纤维蛋白可溶 球状蛋白：可溶球状蛋白：可溶 膜蛋白：不溶于水，可溶于去污剂膜蛋白：不溶于水，可溶于去污剂蛋白质相对
4、分子量变化很大，一般在蛋白质相对分子量变化很大，一般在6000-1106（肌联蛋白）（肌联蛋白）(三三) 蛋白质结构和功能的多样性蛋白质结构和功能的多样性 蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性。蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性。 如：如：20种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为：次）可以形成的异构体为： 20！= 2 1018 又如：相对分子质量为又如：相对分子质量为34000的蛋白质含的蛋白质含12种氨基种氨基酸，假定在肽链的任一位置，酸，假定在肽链的任一位置， 12种氨基酸出现的概率种氨基酸出现的概率相等，则相等，则340
5、00/120 = 283 12283 = 103051.1.催化：大多数酶是蛋白质。催化：大多数酶是蛋白质。 2. 2.调节：如激素和反式作用因子。调节：如激素和反式作用因子。 3. 3.转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。 4. 4.贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。 5. 5.运动：如肌肉、微管蛋白等。运动：如肌肉、微管蛋白等。 6. 6.结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。 7. 7.支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。 8. 8.防御和进
6、攻：如抗体、毒蛋白等。防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。 9. 9.特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等蛋白质的主要功能：蛋白质的主要功能：二、肽二、肽 肽肽(peptide)(peptide)是是氨氨基基酸酸的的线线性性聚聚合合物物，因因此此也也称称肽肽链链（peptide peptide chain)chain)。蛋蛋白白质质中中氨氨基基酸酸的的基基本本连接方式是肽键连接方式是肽键(peptide bond)(peptide bond)。肽键肽键 肽单位肽单位 (酰胺基、肽基酰胺基、肽基)N端端C端端（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构共价主链共价主链l最简单的肽为
7、二肽（最简单的肽为二肽（dipeptide),dipeptide),含一个肽键；含一个肽键；l一般把不多于一般把不多于1212个残基的肽叫二肽、三肽个残基的肽叫二肽、三肽十十二肽；二肽；l不多于不多于2020个残基的肽叫寡肽个残基的肽叫寡肽(oligoteptide)(oligoteptide)l多于多于2020个残基的肽叫多肽；个残基的肽叫多肽；l氨基酸残基（氨基酸残基（amino acid residue).amino acid residue).共振产生的重要结果：共振产生的重要结果： 限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面或肽（基）平面（形成酰胺平面或肽（基）平面（am
8、ide/peptide plane） 产生键的平均化产生键的平均化(键长：键长：1.33 nm， 介于介于1.25-1.45 nm之间之间) 肽键呈反式构型肽键呈反式构型共振杂化体共振杂化体肽基的肽基的C C、O O和和N N原子间的共振相互作用原子间的共振相互作用（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质l肽的晶体熔点高，说明是离子晶格；肽的晶体熔点高，说明是离子晶格；l肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是两性肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是两性化合物，至少有化合物，至少有2 2级解离，通常都有多级解离。因此，级解离，通常都有多级解离。因此，肽在水溶液中也能够带电，也有自己
9、的等电点肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点pIpI，其计算与测定同于氨基酸。其计算与测定同于氨基酸。Glu-Gly-Ala-Lysl肽游离的肽游离的a a- -氨基、氨基、a a- -羧基、羧基、R R基团的化学反应与氨基基团的化学反应与氨基酸类似；酸类似；l双缩脲反应：（双缩脲相似于三肽，即双缩脲反应：（双缩脲相似于三肽，即2 2个肽键），个肽键），与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物。与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物。l凡大于三肽的肽都能发生此反应，凡大于三肽的肽都能发生此反应，2 2肽不行。肽不行。（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽 谷谷胱胱甘甘肽肽在在体体内内参
10、参与与氧氧化化还还原原过过程程，作作为为某某些些氧氧化化还还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。谷胱甘肽谷胱甘肽基本策略：基本策略： 片段重叠法氨基酸顺序直测法片段重叠法氨基酸顺序直测法 基本步骤：基本步骤： (1) (1) 测定蛋白质分子中多肽链数目；测定蛋白质分子中多肽链数目； (2) (2)拆分蛋白质的多肽链，拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；断开多肽链内二硫键； (3) (3)分析每一条多肽链的氨基酸组成；分析每一条多肽链的氨基酸组成； (4) (4)鉴定多肽链鉴定多肽链N N末端、末端、C C末端氨基酸残基；末端氨基酸
11、残基； (5) (5)裂解多肽链成较小的片段；裂解多肽链成较小的片段； (6) (6)测定各肽段的氨基酸顺序；测定各肽段的氨基酸顺序； (7) (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8) (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。三、蛋白质（多肽）一级结构的测定三、蛋白质（多肽）一级结构的测定将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质蛋白质顺序测定蛋白质顺序
12、测定基本方法路线基本方法路线N N端：端： Sanger Sanger法（二硝基氟苯反应）法（二硝基氟苯反应） DNSDNS法（丹磺酰氯反应）法（丹磺酰氯反应） EdmanEdman法（苯异硫氰酸脂反应）法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法氨肽酶法 C C端：端： 肼解法肼解法 还原法还原法 羧肽酶法羧肽酶法多肽多肽N N、C-C-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定Sanger法法N-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定丹磺酰氯法丹磺酰氯法多肽多肽多肽多肽DNS-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸混合物混合物+-HCl水解水解N-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定Edman化学降解法化学降解法1.1.偶联反应偶联反
13、应2. 2. 环化反应环化反应ATZATZ（噻唑啉酮苯胺）噻唑啉酮苯胺）少一个氨基酸残基的肽少一个氨基酸残基的肽N-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定3.3.3.3.转化反应转化反应转化反应转化反应PTH-PTH-氨基酸氨基酸（苯乙内酰硫尿氨基酸）（苯乙内酰硫尿氨基酸）ATZ(ATZ(噻唑啉酮苯胺噻唑啉酮苯胺) )N-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定ABI protein sequencer氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶：从N端开始一个个水解肽键 氨肽酶（氨肽酶（amino peptidaseamino peptidase）：从）：从N N端开始一个个水解端开始一个个水解肽键肽键; ;常用的异亮氨酸氨肽
14、酶（常用的异亮氨酸氨肽酶（Ieu amino Ieu amino peptidasepeptidase） N- N-末端氨基酸被封闭。末端氨基酸被封闭。 如：焦谷氨酰环化、乙酰化等。如：焦谷氨酰环化、乙酰化等。 焦谷氨酸氨肽酶处理。焦谷氨酸氨肽酶处理。 N-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定C-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定肼解法肼解法C-末末端端氨氨基基酸酸的的测测定定羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基除外的氨基酸残基羧肽酶羧肽酶B：仅：仅Arg、Lys羧肽酶羧肽酶C：除羟脯氨酸外的所有的氨基酸残基：除羟脯氨酸外的所有的氨基酸残基羧肽酶羧肽酶Y：所有的氨基
15、酸残基：所有的氨基酸残基二硫键的断裂二硫键的断裂 氨基酸组分的分析氨基酸组分的分析氨基酸的薄层层析分析氨基酸的薄层层析分析（Phe.Tyr.Trp）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶（脂肪族）（脂肪族）弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶（Arg.Lys）胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶胃蛋白酶胃蛋白酶多肽链的部分裂解多肽链的部分裂解酶法裂解酶法裂解化学裂解化学裂解质谱法测定多肽氨基酸的序列质谱法测定多肽氨基酸的序列MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSLC-ESI-MS/MSLC-ESI-MS/MS片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意 所得资料：所得资
16、料： 氨基末端残基氨基末端残基 H 羧基末端残基羧基末端残基 S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序：末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS第一套肽段第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序推断全顺序 HOWTOUSEOVERLAPSBrown & Hartly Diagonal Electrophoresis过甲酸熏蒸过甲酸熏蒸含磺基丙酸的肽段含磺基丙酸的肽段第二向电泳第二向电泳多肽水解多肽水解第一向电泳第一向电泳基本要求基本要求 1.1.掌握蛋白质的分类和功能多样性；掌握蛋白质的分类和功能多样性； 2. 2.掌握肽的结构特点和基本性质；掌握肽的结构特点和基本性质； 3. 3.熟悉蛋白质一级结构的测定方法；熟悉蛋白质一级结构的测定方法；
