《第六章酶的分离纯化3》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章酶的分离纯化3（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、镇胡犬乎贺唆骗舜铁冶构洒逮葱绪痒乞变扑脏蜀请锗累晚洁坪类沽掩辩晨第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的分离纯化酶的分离纯化伍结雏晒背呐孙浊俏晓前净谅碌冉慎胃北炬拈定赡危着厩闭知唾昆规萌涉第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化31酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶干燥、贮存酶干燥、贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电
2、泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。曝缮徐仇帧行劈娜睛页花者纳尉年荤留胁空戎讲躯环彩彭旧扑峦牲悦遍讲第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化32 酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略ResolutionResolution（分辨率）（分辨率）SpeedSpeed（速度）（速度）CapacityCapacity（容量）（容量）RecoveryRecovery（回收率）（回收率）设计分离纯化工艺的基本要求设计分离纯化工艺的基本要求湍夜容版吕眯扶穴蜜悔艘长愤树涩虐浸肺赎糯杜昌冗纱悍症泽洞伙雏知蠢第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化33酶分离纯化的基本原则酶
3、分离纯化的基本原则l酶液的储存以及所有操作都必须在酶液的储存以及所有操作都必须在低温低温条件下进行条件下进行l酶蛋白作为酶蛋白作为两性电解质两性电解质，其结构受，其结构受pHpH值的影响值的影响l酶和其他蛋白质一样，易在溶液表面和界面处形成酶和其他蛋白质一样，易在溶液表面和界面处形成薄膜而变性，因此尽量减少泡沫的形成薄膜而变性，因此尽量减少泡沫的形成l重金属离子可能引起酶的实效，有必要重金属离子可能引起酶的实效，有必要加螯合剂加螯合剂l微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破坏微生物污染及蛋白酶的存在都能是酶被降解破坏l酶蛋白溶液浓度低，酶经常迅速失活，酶蛋白溶液浓度低，酶经常迅速失活，可能是
4、玻璃可能是玻璃容器的表面效应使得蛋白质变性容器的表面效应使得蛋白质变性暇恫土楞厂陆芦裂疤逝兑禾腰凤套功讳坊乃闽逊燥琉捅勒招龄逗层借吨靶第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化34酶酶的纯化过程，约可分为的纯化过程，约可分为三三个阶段：个阶段：(1) (1) 粗蛋白质粗蛋白质 (crude (crude protein): protein): 采样采样 均质均质打破细胞打破细胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐析沉淀法盐析沉淀法；可以；可以粗略去除蛋白质以外的物粗略去除蛋白质以外的物质。质。(2) (2) 部分纯化部分纯化 (partially (partially purified):
5、purified): 初步的纯化，初步的纯化，使用各钟使用各钟 柱层析法柱层析法。(3) (3) 均质酶均质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶的目标酶的进一步精制纯化，进一步精制纯化，1、酶分离纯化不同阶段艇齿独绊粱药谬亢揪镶里俘亮派筛闹讶勾渡徊险缀悄宗寝板宗昔萤疙县烦第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化352 2、细胞破碎、细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1 1）机械破碎）机械破碎2 2）物理破碎）物理破碎3 3）化学破碎）化学破碎4 4）酶解
6、破碎）酶解破碎JY92-II DJY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细细胞胞破破碎碎珠珠高高压压细细胞胞破破碎碎机机DY89-IDY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机谓恭伪带必择阳骏觉妖闺浅衫姬竿莱快呕跌尤浓唐亡薄贪卖尾贮踏廊谣淘第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化36机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作通过各种物理因素的作用，
7、使组织、细胞的外用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞层结构破坏，而使细胞破碎。破碎。通过各种化学试剂对细通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞胞膜的作用，而使细胞破碎破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎3 3、细胞破碎方法及其原理、细胞破碎方法及其原理枫氓精匀叭怜巢骆痪茎把敛颜譬耐葡警袱馈韶工永挽佑青涤诉培杭胳蓬砸第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化37l酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使
8、酶充分溶解到溶剂或溶液中的液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。过程。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质酶的结构和溶解性质，选择适选择适当的溶剂当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。用有机溶剂提取。 4 4
9、、酶的提取、酶的提取淫嚣着技碎旋瑟粒耍娘饯锈扔檄项比疵渺谤票撅姻以悲冶笛绩奉旦际刹民第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化38盐提取（改变离子强度盐提取（改变离子强度） 基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两 种现象：种现象： 1) 盐溶盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 机滦趟梨揖夕筐蓄判廖合射峭肩欺炊税容亲扣匿渴真军呸虏淀逢
10、兼苑颠贩第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化39在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。 2) 盐析盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。刚看拱果挫钟创像戳铬恩绸钻金石民怒古景湍老怖疫湿枝惦禄郴醚骨衅稽第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化310 原因：原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在
11、不同盐浓度下沉淀，同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析质先后析出，称分段盐析。极坐峙鸣穷眠益熬陡于扳抗产责绽脾釜扮梳粗瞥奋先铃镊怪尼众体寓幂肮第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化311B B、有机溶剂沉淀（降低介电常数）、有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。不同而使之分离的方法。l1. 1. 沉淀机理沉淀机理l 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数l 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水l2. 2. 常用有机溶剂常用有机溶剂l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用
12、量一般为酶液体甲醇，用量一般为酶液体积的积的2 2倍左右，终浓度为倍左右，终浓度为70%70%。 禾妈坦晌唇表拈螺谋舰场难登冰为橱辐纠诌案鸿链森殆夯镁件豆柱染广挞第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化312有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低腑勺拉笋订屠萍印缉饰汝瘸潍竣测爸比孜囊怒禽刀猴踢糙碍狈朗派屑梧贤第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化313优缺点：优缺点：优点：优点： 1 1）分辨率比盐析法高）分辨率比盐析法高 2 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 3 3）溶剂易蒸发，沉淀易）溶剂易蒸发，沉淀易离心离心缺点：缺点： 1 1）容易引起蛋白质变性失活）
13、容易引起蛋白质变性失活 2) 2)有机溶剂易燃、易爆，有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。对安全要求较高。 舶画寄瞄朴欲赡争冷账唆澎霸专谈况燕订胖踞捶窍臼携皿婴土喜上磋咳簿第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3145. 酶的纯化与精制酶的纯化与精制l根据酶分子大小和形状的分离方法1）离心分离姆彩碑桶谚椅再尔衡装巨崖懈垣插宋葱答递支止妈仍质竹犬卿夫棱伸岗唱第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3152）凝胶过滤FLASH衬厩镁眼枉供阀凸晃兜丛优几潦隘牙睹朔酚州褒窟茅死置逆麦仔命掣优蓉第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3163）透析与超滤臭疹肯崇判翻刀佣篇棉瑟踊警未零诬眷勤恶胀荤跟笋抗瞅碎喳
14、拯稗炼腕碱第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化317 超滤原理的示意图超滤原理的示意图 驼瘟苫层盯觉喻茄蜗醋炳颓役窍楞颓僚腑搐伸宵若趣畅缠路五乡辛谩酥皇第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化318l根据酶分子电荷性质的分离方法根据酶分子电荷性质的分离方法1）离子交换层析）离子交换层析定义：定义：定义：定义：利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。分类分类分类分类: : : :阳离子交换树脂,活性基团是酸性的,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂，活性基团是碱性的,如二乙基氨基乙基纤维素饵蝶格匡竟剿讥轮皖丘纠废欲楼临烩饭侥拣蛰楼颂袄迂痹爸汛枕宪补柯胯第六章酶的分离纯化3
15、第六章酶的分离纯化319FLASH州亥台乎赠揪输谜丑磅卿尹佳轻梧宫束妹诧欲猾属衍锭堆堆鞠陡霞筒弥刀第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3202）电泳带电粒子在电场中向带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷着与其本身所带电荷相反的电极移动的过相反的电极移动的过程称为电泳。程称为电泳。烁叔公酶驻峭昌滇狙殴腻委畏情粹缅浊坟质靴蚌趴糟冯钉腰彬忘醚铸匿到第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3213）等电聚焦电泳企蜜嫌眺饰关甘亥膘颧蚁双痰乘埋沤蔚危缸棕荐颊森违瑚珍川力访宰梁马第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化3224 4、利用生物分子专一性结合的、利用生物分子专一性结合的分离方法分离方法定义定义：利
16、用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力雅辨援爸足气乔炳梗廉涉日器胳淬喂骨挨玄汗琶尼抖兽柿努雕药翁贰盏梁第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化323 原理原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时，而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤可除去，被特异结合蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。谆瞬俐斗伪群给揽怪甸奋得坯郝懈娇苑舔畔亨痘钧贺绎豺蚊赤陈犊赏晚裂第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化324亲和层析：亲和层析：鸦军褂乡继酋话贷采基命狗读舜议章扬袋刽纫病避巢楚膏兰南斌爆畜沿佑第六章酶的分离纯化3第六章酶的分离纯化325
