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1、半抗原免疫分析(全面)Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望内容内容l一、基本概念一、基本概念l抗原抗原l抗体抗体l二、免疫分析方法二、免疫分析方法l分类分类lELISAELISA原理与方法原理与方法l方法建立方法建立- -苏丹红为例苏丹红为例23 抗原抗原 antigen,Agantigen,Ag4( (一一) )抗原的概念抗原的概念 抗原抗原(Antigen,Ag(Antigen,Ag) ) 是一类能是一类能刺激刺激机体免疫系统机体免疫系统产生特异性免疫应答产生特异性免
2、疫应答, ,并能与相应的免疫应答产并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生物在体内或体外发生特异性结合特异性结合的物质的物质. .5( (二二) )完全抗原与半抗原完全抗原与半抗原1.1.完全抗原（完全抗原（complex antigen):complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反应性的物质既具免疫原性又有免疫反应性的物质. . 如如: :大多数蛋白质大多数蛋白质. .2.2.半抗原半抗原(hapten):(hapten): 仅有免疫反应性而无免疫原性的物质仅有免疫反应性而无免疫原性的物质. .如如: :大多数多糖、类脂、某些药物大多数多糖、类脂、某些药物. . 半抗原半抗原
3、+ +载体载体( (蛋白质蛋白质) ) 完全抗原完全抗原6共同抗原与交叉反应8共同抗原与交叉反应共同抗原与交叉反应 1.1.共同抗原共同抗原( (Common antigens)Common antigens)： 存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。原决定簇，称为共同抗原。 2.2.交叉反应交叉反应( (Cross-reaction)Cross-reaction)： 由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应
4、。 检测检测意义：假阳性（避免）意义：假阳性（避免）意义：假阳性（避免）意义：假阳性（避免） 多残留检测（利用）多残留检测（利用）多残留检测（利用）多残留检测（利用）910农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗原腐剂、植物激素等半抗原 在食品安全、植物学、环境检在食品安全、植物学、环境检测等领域，主要是半抗原类物质。测等领域，主要是半抗原类物质。 抗体抗体 antibody,Ab抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁；抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。两者既是好朋友，又是一对冤家。 一、基本概念一、
5、基本概念 1. 1. 抗体（抗体（AntibodyAntibody，AbAb） 指指B B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。性结合的免疫球蛋白。 存在形式：存在形式： 膜型膜型（membrane immunoglobulin, mIgmembrane immunoglobulin, mIg） B B细胞膜上的抗原受体细胞膜上的抗原受体； 分泌型分泌型( (secreted immunoglobulin, sIgsecreted immunoglobulin, s
6、Ig) ) 分泌进入体液分泌进入体液, , 介导体液免疫应答。介导体液免疫应答。二、免疫球蛋白的分子结构二、免疫球蛋白的分子结构（一）免疫球蛋白的基本结构：（一）免疫球蛋白的基本结构： 由四条多肽链组成，呈由四条多肽链组成，呈“Y”Y”或或“T”T”型型 1.1.组成：组成：l 2 2条长链，又称重链（条长链，又称重链（Heavy chainHeavy chain，H H链）：链）： 含含450-550aa450-550aa，分子量为，分子量为55-75KD55-75KD。l 2 2条短链，又称轻链（条短链，又称轻链（Light chainLight chain，L L链）：链）： 含含214
7、aa214aa，分子量为，分子量为25KD25KD。l2.2.分类、分型：分类、分型：（1 1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig Ig 分为五类：分为五类： IgM (IgM (IgM (IgM ( ) ) ) ) 、IgG(IgG(IgG(IgG() ) ) )、IgA(IgA(IgA(IgA() ) ) )、IgD(IgD(IgD(IgD() ) ) )、 IgE(IgE(IgE(IgE() ) ) ) l l 亚类亚类亚类亚类：IgGIgGIgGIgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgG1, IgG2, IgG3,
8、IgG4 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA IgA IgA IgA：IgA1, IgA2IgA1, IgA2IgA1, IgA2IgA1, IgA2 IgM: IgM1, IgM2 IgM: IgM1, IgM2 IgM: IgM1, IgM2 IgM: IgM1, IgM2（2 2 2 2）分两型：）分两型：）分两型：）分两型： 根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻 链分为两型：链分为两型
9、：链分为两型：链分为两型：和和和和型型型型 l l 每一每一每一每一IgIgIgIg单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须l l 同型。同型。同型。同型。抗体的制备方法抗体的制备方法l3.3.基因工程抗体基因工程抗体(GeAb):(GeAb): 第三代抗体第三代抗体 由基因重组技术制备的抗体由基因重组技术制备的抗体, ,称为基因工程抗称为基因工程抗体。体。l 嵌合抗体嵌合抗体 (chimeric Ab) l 人源抗体（人源抗体（humanized Ab)l 双特异性抗体（双特异性抗
10、体（bispecific Ab) l Fab/ScFV（single chain FV fragment) 单域抗体（单域抗体（single chain Ab) 抗体的结构与功能的关系，抗体的结构与功能的关系，所展现出的生物学功能是其结构的所展现出的生物学功能是其结构的完美表演者。完美表演者。免疫分析技术免疫分析技术内内 容容l分析方法分类分析方法分类l几种常用免疫分析技术几种常用免疫分析技术lELISAELISAl侧流免疫层析侧流免疫层析l分析方法的建立分析方法的建立l分析数据的拟合分析数据的拟合常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别类别 标记物标记物 用途用途荧光素荧光素 FITC、RB
11、200、TRITC 免疫组化免疫组化 镧系元素螯合物镧系元素螯合物 免疫分析测免疫分析测定定放射性核素放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定免疫分析测定 125I、131I酶酶 HRP、AP 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定化学发光物化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定免疫分析测定金属颗粒金属颗粒 胶体金、铁蛋白胶体金、铁蛋白 免疫组化免疫组化 免疫分析测定免疫分析测定 2024/7/2524一、标记免疫方法分类一、标记免疫方法分类1 1按标记物的种类分按标记物的种类分(1)(1)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay(r
12、adioimmunoassay，RIA)RIA)(2)(2)酶免疫分析酶免疫分析(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)(3)(3)(3)(3)化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)CIZIA)CIZIA)CI
13、ZIA)(4)(4)(4)(4)荧光免疫分析法荧光免疫分析法荧光免疫分析法荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，FIA)FIA)FIA)FIA)。2024/7/2525 2 2按是否加入分离剂分按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay) 在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离
14、的标记药物之中有一种不产生信号或信结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme (enzyme multiplied immunoassay techniquemultiplied immunoassay technique，EMIT) EMIT) 。(2)非均相免疫分析非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay) 在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应
15、达到平衡后，只有在在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液- -固两相后，固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme ELISA(Enzyme linked immunosorbent immunoassay)lin
16、ked immunosorbent immunoassay)ELISAELISA简介简介（一）（一） ELISA技术的原理技术的原理间接法间接法 夹心法夹心法 竞争法竞争法夹心法夹心法Sandwich竞争法竞争法（二）（二） ELISA所用试剂材料所用试剂材料l1、固相l2、酶l3、底物l4、缓冲液l5、仪器1、固定相、固定相聚次亚乙烯2024/7/25332、最常用的标记酶、最常用的标记酶1 1辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP):(HRP):约有约有5050的的EIAEIA使用此酶。使用此酶。2 2碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶(AP):AP(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活标记的结合物
17、性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量。性可用分光光度计或荧光计测量。3 36-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): (G-6-PD): 通常用于均相通常用于均相EIAEIA。4 4- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-Gal): (-Gal): 适用于均相适用于均相EIAEIA和非均相和非均相EIAEIA。5 5苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(MDH): (MDH): 多用于尿样的均相多用于尿样的均相EIAEIA。3、最常用的底物、最常用的底物l邻苯二酚(OPC)l四甲基联苯胺(TMB)4、缓冲液、缓冲液lPBS(T)lTris-HCllNa3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂酶标
18、仪酶标仪4、仪器、仪器酶标仪酶标仪（三）（三） 免疫分析方法建立免疫分析方法建立苏丹红为例苏丹红为例Step 1: Hapten and conjugateStep 2: characterization of conjugateStep 3: chessboard tiatrion and calibration curveStep 4: optimizationnonessential 例例1、标记抗原浓度对检测的影响、标记抗原浓度对检测的影响43例，例，pH影响影响Step 5: sample analysisStep 6: validation一个难点：基质效应一个难点：基质效应基质效
19、应基质效应l基质基质：样品中除了目标分析物外还含有其他的：样品中除了目标分析物外还含有其他的物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰，物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰，这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应(matrix effect)(matrix effect)l（1 1）基质来源）基质来源l水、土壤的腐殖质水、土壤的腐殖质l食品中的蛋白、脂肪等食品中的蛋白、脂肪等l溶液中作为促溶的有机溶剂等溶液中作为促溶的有机溶剂等例例1：环境水样的基质效应：环境水样的基质效应49（2）基质干扰的消除）基质干扰的消除l掩蔽剂（缓冲液调整）掩蔽剂（缓冲液调整）l样品稀释样品稀释l样品前处理：净化样品前处理：净化50
