第八章酶分子化学修饰课件

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1、第八章酶分子化学修饰课件第第8 8章章 酶分子的化学修分子的化学修饰Chemical Modification of Enzyme Moleculel l酶的活性中心的活性中心l l酶化学修化学修饰的目的的目的l l酶化学修化学修饰的基本原理的基本原理l l酶化学修化学修饰的方法学的方法学l l酶化学修化学修饰的种的种类l l修修饰酶的化学性的化学性质l l酶化学修化学修饰的的应用和局限性用和局限性主要内容主要内容 一、活性中心的概念一、活性中心的概念v 酶的必需基的必需基团 (essential group): 与与酶活性有关的基活性有关的基团v 酶的活性中心的活性中心 (active ce

2、nter): 由必需基由必需基团构成的与构成的与酶催化活性有关的特定区域催化活性有关的特定区域 第一第一节 酶的活性中心（的活性中心（active site）酶分分子子非必需基非必需基团必需基必需基团活性中心活性中心必需基必需基团活性中心外活性中心外必需基必需基团结合基合基团催化基催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心 与底物相与底物相结合，使底合，使底物与物与酶的一的一定构象形成定构象形成复合物复合物 影响底物中某些影响底物中某些化学化学键的的稳定，定，催化底物催化底物发生化生化学反学反应并将其并将其转化成化成产物物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 Active siteu T

3、he active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. u The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interact

4、ions.u 7种氨基酸出种氨基酸出现的的频率最高率最高: Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉天果拌猪肉丝）u 某些功能基某些功能基团（如氨基、（如氨基、羧基、基、巯基、咪基、咪唑基基 和和羟基）是基）是酶的必需基的必需基团。 活性中心的重要化学基活性中心的重要化学基团半胱氨酸半胱氨酸谷氨酸谷氨酸丝氨酸氨酸组氨酸氨酸天冬氨酸天冬氨酸赖氨酸氨酸酪氨酸酪氨酸二、二、酶活性中心的共性活性中心的共性(1) 活性部位只占活性部位只占酶分子很小的一部分（分子很小的一部分（1-2%）。）。(2) 活性部位是一个三活性部位是一个三维实体。体。(3) 活性中心位于活性中心位于

5、酶分子表面的疏水性裂分子表面的疏水性裂缝中。中。 (4) 活性中心构象不是固定不活性中心构象不是固定不变的（的（诱导契合）。契合）。(5) 酶与底物通与底物通过盐键、氢键、范德、范德华力和疏水作用力和疏水作用等次等次级键结合。合。1. 物理学方法物理学方法2. 化学修化学修饰法法3. 动力学参数法力学参数法4. 蛋白蛋白质工程工程 三、研究三、研究酶活性中心的方法活性中心的方法（P13P13） 用用X射射线衍射法直衍射法直接接检测底物或其底物或其类似物似物与与酶形成的中形成的中间复合物复合物（包括（包括酶和底物）的相和底物）的相对位置。位置。1. 物理学方法物理学方法2. 化学修化学修饰法法u

6、 根据所用修根据所用修饰试剂不同，分不同，分为: 1) 非非专一性化学修一性化学修饰 用非用非专一性的修一性的修饰试剂与氨基酸与氨基酸侧链基基团作用。作用。u若某基若某基团被修被修饰后：后： 酶活性不活性不变该基基团可能不是可能不是酶的必需基的必需基团 酶活性降低或活性降低或丧失失该基基团可能是可能是酶的必需基的必需基团,但但不能确定化学不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基是同活性中心内的必需基团结合。合。 活性中心基活性中心基团的的鉴定定标准准 失活程度与修失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。度成一定比例关系。 S或可逆抑制或可逆抑制剂有保有保护作用（活性中心）。作用（活性中心）。先加先加

7、S或或竞 加共价修加共价修饰剂 透析除去透析除去S或或竞 活性不活性不丧失失差差别标记底物或抑制底物或抑制剂存在存在 活性基活性基团不与修不与修饰剂作用作用去除底物或抑制去除底物或抑制剂 原来被保原来被保护的基的基团带同位素同位素标记 可直接得到蛋白可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基功能作用的必需基团。化学修化学修饰含同位素含同位素标记 的同的同样试剂2) 专一性化学修一性化学修饰（基（基团专一性修一性修饰） 用用专一性化学修一性化学修饰剂修修饰酶活性中心的某一氨活性中心的某一氨基酸残基的基酸残基的侧链基基团。3) 亲和和标记（位点（位点专一性修一性修饰） 采用的修采用的修饰试剂是根据底物的

8、化学是根据底物的化学结构构设计合合成的含有活成的含有活泼反反应基基团的底物的底物类似物。似物。u 作用机制：作用机制：利用利用酶对底物的特殊底物的特殊亲和力将和力将酶加以加以修修饰标记。u 亲和修和修饰剂：与与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。和力小。具有活具有活泼的化学基的化学基团（如（如卤素）可与活性中心素）可与活性中心的基的基团形成形成稳定的共价定的共价键。3) 亲和和标记（位点（位点专一性修一性修饰）化学修化学修饰的的专一性一性3. 动力学参数法力学参数法 pH-酶活力关系

9、的研究，可得到参与反活力关系的研究，可得到参与反应的必的必需基需基团的的pK值，通，通过比比较分析估分析估计基基团的种的种类。4. 蛋白蛋白质工程工程 将将酶相相应的的cDNA定点突定点突变，突，突变的的cDNA只表只表达一个或几个氨基酸被置达一个或几个氨基酸被置换的的酶蛋白，蛋白，测定其活性定其活性可知被置可知被置换的氨基酸是否的氨基酸是否为活力所必需。活力所必需。一、一、酶化学修化学修饰1. 限制限制酶大大规模模应用的原因：用的原因：1) 易于易于变性失活（酸、碱、有机溶性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；）；2) 容易受容易受产物和抑制物和抑制剂的抑制；的抑制；3) 工工业反反应要求的酸度和

10、温度并不要求的酸度和温度并不总是在是在酶反反应的最适酸度和温度范的最适酸度和温度范围内；内；4) 底物不溶于水，或底物不溶于水，或酶的米式常数的米式常数过高；高；5) 酶做做为药物在体内的半衰期物在体内的半衰期较短等因素限制了短等因素限制了酶制制剂的的应用。用。 第二第二节 酶化学修化学修饰的目的的目的1) 通通过分子修分子修饰的方法来改的方法来改变已分离出来的天然已分离出来的天然酶的活性。的活性。蛋白蛋白质水平水平2) 通通过基因工程方法改基因工程方法改变编码酶分子的基因而达分子的基因而达到改造到改造酶的目的。的目的。核酸水平核酸水平2. 改改变酶特性的两种主要方法：特性的两种主要方法：l

11、酶的的化学修化学修饰（chemical modification）通通过化学基化学基团的引入或除去，使的引入或除去，使酶的共价的共价结构构发生生改改变。l 酶的的选择性化学修性化学修饰：在在较温和的条件下，以可控制的方式使一种温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某同某些化学些化学试剂起特异反起特异反应，从而引起，从而引起单个氨基酸残基个氨基酸残基或其功能基或其功能基发生共价的化学改生共价的化学改变。3. 酶化学修化学修饰的概念的概念1. 研究研究酶的的结构与功能的关系（构与功能的关系（50年代末）年代末）探探测酶活性必需氨基酸的性活性必需氨基酸的性质和数目和数目酶蛋白一蛋白一级结构的构的测定

12、定酶蛋白的蛋白的结构构变化与运化与运动酶蛋白部分区域的构象状蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反的作用机理与催化反应历程程酶分子的拓扑学以及寡聚分子的拓扑学以及寡聚酶的的亚基基结合状合状态酶的固定化技的固定化技术酶纯度的分析与度的分析与检测二、二、酶化学修化学修饰的目的的目的2. 人人为改改变天然天然酶的某些性的某些性质，扩大大酶的的应用用 范范围（70年代末之后）年代末之后）1）提高）提高酶的生物活性（的生物活性（酶活力）。活力）。2）增）增强酶的的稳定性（定性（热稳定性、体内半衰期）。定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（）消除抗原性（针对特异性反特异性反应降低生物降低生物识别能力）能

13、力）。4）产生新的催化能力。生新的催化能力。二、二、酶化学修化学修饰的目的的目的一、增一、增强酶天然构象的天然构象的稳定性与耐定性与耐热性性 修修饰剂分子存在多个反分子存在多个反应基基团，可与，可与酶形成形成多点交多点交联，使，使酶的天然构象的天然构象产生生“刚性性”结构。构。二、保二、保护酶活性部位与抗抑制活性部位与抗抑制剂 大分子修大分子修饰剂与与酶结合后，合后，产生的空生的空间障碍障碍或静或静电斥力阻斥力阻挡抑制抑制剂，“遮盖遮盖”了了酶的活性部的活性部位。位。第三第三节 酶化学修化学修饰的基本原理的基本原理酶化学修化学修饰后通后通过两种途径抗蛋白水解两种途径抗蛋白水解酶：1. 大分子修

14、大分子修饰剂产生空生空间障碍阻障碍阻挡蛋白水解蛋白水解酶接近接近酶分子，分子，“遮盖遮盖”酶分子上敏感分子上敏感键免遭破坏。免遭破坏。2. 酶分子上分子上许多敏感基多敏感基团交交联上修上修饰剂后，减少了后，减少了受蛋白水解受蛋白水解酶破坏的可能性。破坏的可能性。三、三、维持持酶功能功能结构的完整性与抗蛋白水解构的完整性与抗蛋白水解酶1. 酶蛋白氨基酸蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修成的抗原决定簇，与修饰剂形成形成了共价了共价键。 破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体阻碍抗原、抗体结合合2. 大分子修大分子修饰剂

15、本身是多聚本身是多聚电荷体，能在荷体，能在酶分子表分子表面形成面形成“缓冲外壳冲外壳”，抵御外界，抵御外界环境的极性境的极性变化，化，维持持酶活性部位微活性部位微环境相境相对稳定。定。四、消除四、消除酶的抗原性及的抗原性及稳定定酶的微的微环境境 一、充分一、充分认识酶分子的特性分子的特性 包括包括酶的的 1. 活性部位情况活性部位情况 2. 稳定条件及反定条件及反应最佳条件最佳条件 3. 侧链基基团的化学性的化学性质及反及反应活活泼性性第四第四节 酶化学修化学修饰的方法学的方法学要考要考虑 1. 修修饰剂的分子量及的分子量及链的的长度（要求有度（要求有较大的分大的分子量）子量） 2. 修修饰剂

16、上反上反应基基团的数目及位置（要求有的数目及位置（要求有较多多的反的反应活性基活性基团） 3. 修修饰剂上反上反应基基团的活化方法与条件的活化方法与条件二、修二、修饰剂的的选择要注意要注意 1. 酶与修与修饰剂的分子比例的分子比例 2. 反反应体系的溶体系的溶剂性性质、盐浓度、度、pH条件条件 3. 反反应温度及温度及时间三、反三、反应条件的条件的选择 一、一、酶的表面化学修的表面化学修饰（一）大分子修（一）大分子修饰（大分子（大分子结合修合修饰）（二）小分子修（二）小分子修饰（酶蛋白蛋白侧链基基团修修饰）（三）交（三）交联修修饰（交（交联法）法）（四）固定化修（四）固定化修饰（共价偶（共价偶

17、联法）法） 二、二、酶分子内部修分子内部修饰（一）蛋白主（一）蛋白主链修修饰（肽链有限水解修有限水解修饰）（二）氨基酸置（二）氨基酸置换修修饰（三）金属离子置（三）金属离子置换修修饰第五第五节 酶化学修化学修饰的种的种类（一）大分子修（一）大分子修饰（大分子（大分子结合修合修饰）P295n 定定义： 利用利用水溶性大分子水溶性大分子与与酶结合，使合，使酶的空的空间结构构发生某些精生某些精细的改的改变，从而改，从而改变酶的特性与功能的方法。的特性与功能的方法。 n 修修饰剂： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、）、右旋糖右旋糖酐（dextran）、）、肝素肝素（heparin）、糖、糖肽（glyco

18、peptide）等。）等。n 修修饰方法：方法： 修修饰前活化，然后在一定条件下与前活化，然后在一定条件下与酶分子共价分子共价结合。合。1. 聚乙二醇的修聚乙二醇的修饰反反应聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）：线性大分子，具有良好的生物性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，可消除原性，可消除酶分子的抗原性，广泛用于分子的抗原性，广泛用于酶的修的修饰。PEG末端活化末端活化后可以与后可以与酶产生交生交联，使，使酶分子被覆分子被覆盖上一盖上一层疏松的疏松的亲水外壳，水外壳，导致致动力学力学发生改生改变，产生生许多有用的性多有

19、用的性质，如可在广泛的，如可在广泛的pH范范围内溶内溶解、不被离子交解、不被离子交换剂吸附，吸附，电泳迁移率下降等。泳迁移率下降等。修修饰方法：方法：叠氮法、琥珀酸叠氮法、琥珀酸酐法、三法、三氯均均嗪法、法、羰二二亚胺法、重氮法胺法、重氮法。 (1) 叠氮法叠氮法(2) 琥珀酸琥珀酸酐法法（3）三）三氯均均嗪法法（4）羰二二亚胺法胺法（5）重氮法）重氮法2. 糖糖类的修的修饰反反应：(1) 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修修饰反反应右旋糖苷：右旋糖苷： -葡萄糖通葡萄糖通过 -1, 6-糖苷糖苷键连接而成，接而成，双双羟基基经过活化后可与活化后可与酶分子上的游离氨基相分子上的游

20、离氨基相结合。合。修修饰方法：方法：溴化溴化氰法、高碘酸氧化法法、高碘酸氧化法。(2) 糖糖肽（Glycopeptide)的修的修饰反反应: 糖糖肽：人：人纤维蛋白或蛋白或 - 球蛋白球蛋白经蛋白蛋白酶水解后得到的水解后得到的产物，物，分子上的游离氨基活化后可与分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反分子上的氨基反应。修修饰方法：方法：2,3-异异氰酸甲苯活化法、戊二酸甲苯活化法、戊二醛法。法。(3) 聚乳糖修聚乳糖修饰反反应：聚乳糖在一定温度下，通聚乳糖在一定温度下，通过适当的适当的还原原剂可与可与酶分子上氨基反分子上氨基反应。3. 其他大分子多聚物的修其他大分子多聚物的修饰反反应(1)

21、聚聚N - 乙乙烯吡硌吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量用水溶性的分子量为10,000的的PVP，经过开开环水解活化后，与水解活化后，与酶结合。合。(2) 聚乙聚乙烯醇醇(PVA):PVA与与对硝基苯氧硝基苯氧酰氯反反应，其硝，其硝基再用基再用连二二亚硫酸硫酸钠还原原为氨基，与氨基，与酶分子中的分子中的羧基共价基共价连接。接。(3) 聚丙聚丙烯醇醇(PAA):用分子量用分子量为250,000的的PAA，经过N - 羟基琥珀基琥珀酰亚胺活化后与胺活化后与酶的氨基反的氨基反应。(4) 聚聚顺丁丁烯二酸二酸酐:用分子量用分子量为98,000的聚的聚顺丁丁烯二二酸酸酐，可以直接与，可以直接与酶分子

22、的氨基分子的氨基发生反生反应。(5) 聚氨基酸：用分子量聚氨基酸：用分子量为5,700的聚的聚赖氨酸做修氨酸做修饰剂时，其氨基与，其氨基与酶分子上的分子上的羧基通基通过羰二二亚胺胺产生交生交联。用丙氨酸的二。用丙氨酸的二肽或三或三肽做修做修饰剂时，其酸，其酸酐可可以与以与酶发生反生反应。聚丙聚丙烯醇醇(PAA)修修饰酶:4. 天然大分子天然大分子对酶的修的修饰反反应(1) 肝素：由氨基葡萄糖和两种糖肝素：由氨基葡萄糖和两种糖醛酸酸组成，平均成，平均分子量分子量约为20000，是一种含硫酸，是一种含硫酸酯的黏多糖。的黏多糖。经过肝素修肝素修饰的的酶具有良好的具有良好的稳定性，不定性，不仅可以可以

23、提高提高酶的的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。脂等活性。修修饰方法：方法：羰二二亚胺法、三胺法、三氯均均嗪法、溴化法、溴化氰法法(2) 人血清白蛋白：人血清白蛋白：相相对分子分子质量大量大修修饰方法：戊二方法：戊二醛法、法、羰二二亚胺法、活性胺法、活性酯法法5. 大分子修大分子修饰酶的的应用用u PEG超氧化物歧化超氧化物歧化酶（SOD） PEG溶血溶血类蛋白蛋白质（链激激酶、尿激、尿激酶等）等） PEG天天门冬冬酰胺胺酶（ASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延延长了了酶在体内的半衰期在体内的半衰期u 用用Dextran修修饰 -淀粉淀粉酶，

24、淀粉淀粉酶，胰蛋白，胰蛋白酶、过氧化氧化氢酶：提高了提高了酶的的热稳定性。定性。（二）小分子修（二）小分子修饰 （酶蛋白蛋白侧链基基团修修饰）P285u 定定义：通通过选择性的性的试剂或或亲和和标记试剂与与酶分子分子侧链上特定的功能基上特定的功能基团发生化学反生化学反应。u 侧链基基团：组成蛋白成蛋白质氨基酸残基上的功能氨基酸残基上的功能团。主。主要有：要有：氨基、氨基、羧基、胍基、基、胍基、巯基、酚基、咪基、酚基、咪唑基基。u 20种不同氨基酸的种不同氨基酸的侧链基基团中只有中只有极性氨基酸极性氨基酸的的侧链易被修易被修饰，它，它们一般具有一般具有亲核性。核性。u 侧链基基团修修饰剂：采用的

25、各种小分子化合物。采用的各种小分子化合物。 根据氨基酸根据氨基酸侧链R基的极性，基的极性，20种氨基酸可分成种氨基酸可分成4类。u 非极性非极性R基氨基酸基氨基酸（共（共8种）：种）： 丙氨酸丙氨酸 (Alanine, Ala, A), 亮氨酸亮氨酸 (Leucine, Leu, L), 缬氨酸氨酸 (Valine, Val, V), 异亮氨酸异亮氨酸 (Isoleucine, Ile, I), 苯丙氨酸苯丙氨酸 (Phenylalanine, Phe, F), 色氨酸色氨酸 (Tryptophan, Trp, W), 甲硫氨酸甲硫氨酸 (Methionine, Met, M), 脯氨酸脯氨酸

26、 (Proline, Pro, P)u 无无电荷的极性荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共7种）：种）： 丝氨酸氨酸 (Serine, Ser, S), 苏氨酸氨酸 (Threonine, Thr, T), 酪氨酸酪氨酸 (Tyrosine, Tyr, Y), 半胱氨酸半胱氨酸 (Cysteine, Cys, C), 天冬天冬酰胺胺 (Asparagine, Asn, N), 甘氨酸甘氨酸 (Glycine, Gly, G), 谷氨谷氨酰胺胺 (Glutamine, Gln, Q)u带正正电荷的极性荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共3种）：种）： 赖氨酸氨酸 (Lysine, Lys, K),

27、精氨酸精氨酸 (Arginine, Arg, R), 组氨酸氨酸 (Histidine, His, H)u带负电荷的极性荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共2种）：种）： 天冬氨酸天冬氨酸 (Aspartic acid, Asp, D), 谷氨酸谷氨酸 (Glutamic acid, Glu, E)烷基化反基化反应酰化反化反应氧化氧化还原反原反应芳香芳香环取代反取代反应u 几种重要的修几种重要的修饰反反应：1. 化学修化学修饰反反应的的类型型 1) 烷基化反基化反应试剂特特点点：烷基基上上带活活泼卤素素，导致致酶分分子子的的亲核核基基团（如（如NH2，-SH等）等）发生生烷基化。基化。可作用基可

28、作用基团： 氨氨基基（Lys，Arg），巯基基（Cys），羧基基（Asp、Glu），甲硫基（），甲硫基（Met），咪），咪唑基（基（His）。）。修修饰剂：2, 4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。胺等。 烷基化反基化反应 2) 酰基化反基化反应试剂特点：特点： 含含有有 结构构，作作用用于于侧链基基团上上的的亲核核基基团，使之使之酰基化。基化。可作用基可作用基团： 氨氨基基，巯基基，醇醇羟基基（Ser、Thr），酚酚羟基基（Tyr）酰基化反基化反应 3) 氧化和氧化和还原反原反应试剂特点：具有氧化性或特点：具有氧化性或还原性。原性。氧化氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀

29、溴代琥珀酰亚胺胺 可可被被氧氧化化的的侧链基基团：巯基基、甲甲硫硫基基、吲哚基基、咪咪唑基、酚基等。基、酚基等。还原原剂：2-巯基乙醇、基乙醇、DTT等。等。 可被可被还原的原的侧链基基团：二硫：二硫键。连四硫酸四硫酸盐氧化氧化巯基，基，DTT还原逆回，用于保原逆回，用于保护巯基。基。 4) 芳香芳香环取代反取代反应u 试剂：卤（碘）化、硝化（碘）化、硝化试剂（四硝基甲（四硝基甲烷）I2+HI(NO2)4C+(NO2)3CH2. 特定氨基酸残基特定氨基酸残基侧链基基团的化学修的化学修饰1) 氨基的化学修氨基的化学修饰：u来源：来源：Lys、 Arg、Hisu修修饰反反应：酰基化、基化、烷基化基

30、化u酰基化基化修修饰剂: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）、）、丹磺丹磺酰氯（DNS）u烷基化基化修修饰剂： 2, 4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）、）、碘乙酸、碘乙碘乙酸、碘乙酰胺、胺、亚硝酸等硝酸等三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸 2) 羧基的化学修基的化学修饰 修修饰羧基的反基的反应专一性一性较差。差。 常用常用水溶性碳化二水溶性碳化二亚胺胺修修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定天冬氨酸和谷氨酸，可定量量测定定酶分子中分子中羧基的数目。基的数目。+水溶性碳化二水溶性碳化二亚胺胺3) 胍基的化学修胍基的化学修饰来源：来源：Arg修修饰反反应：本：本质上是上

31、是羰基基对氨基氨基酰基化。基化。修修饰剂： 丁二丁二酮 二二羰基化合物基化合物 1，2环己二己二酮 苯乙二苯乙二醛4) 巯基的化学修基的化学修饰 来源：来源：Cys 修修饰反反应: 烷基化基化 修修饰剂：碘乙酸：碘乙酸(IAA) 碘乙碘乙酰胺胺(IAM)E-SH+R-XE-SR+HXN-乙基乙基马来来酰亚胺（胺（NEM）:常用的常用的专一修一修饰巯基基试剂ESH5) 二硫二硫键的化学修的化学修饰还原：原：巯基乙醇、二硫基乙醇、二硫苏糖醇（糖醇（DTT） 6) 咪咪唑基的化学修基的化学修饰 来源：来源：His 修修饰反反应: 酰基化、基化、烷基化基化 酰基化修基化修饰剂: 焦碳酸二乙焦碳酸二乙酯

32、（diethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2 烷基化修基化修饰剂：碘乙酸：碘乙酸+ICH2COOH+HI7）酚）酚羟基的化学修基的化学修饰来源：来源：Tyr修修饰反反应：芳香：芳香环取代反取代反应修修饰剂：碘、硝化：碘、硝化试剂（四硝基甲（四硝基甲烷）8）吲哚基的化学修基的化学修饰 来源：来源：Trp 修修饰反反应：氧化反：氧化反应 修修饰剂： N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺胺氨基酸氨基酸侧链基基团修修饰剂Lys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺胺、丹磺酰氯、亚硝酸硝酸Asp、Glu羧基基水溶性碳化二水溶性碳

33、化二亚胺胺Arg胍基胍基苯乙二苯乙二醛，1,2环己二己二酮、丁二、丁二酮Cys巯基基碘乙酸、碘乙碘乙酸、碘乙酰胺、胺、N-乙基乙基马来来酰亚胺胺二硫二硫键巯基乙醇、基乙醇、DTTHis咪咪唑基基焦碳酸二乙焦碳酸二乙酯、碘乙酸、碘乙酸Tyr酚酚羟基基碘、四硝基甲碘、四硝基甲烷Trp吲哚基基N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺胺 各种氨基酸各种氨基酸侧链的修的修饰剂u 对修修饰效果的解效果的解释须十分小心：十分小心：任何一种修任何一种修饰剂不是不是绝对专一的。一的。有些修有些修饰剂引起蛋白引起蛋白质构象构象变化化失活，失活， 不一定不一定是活性中心基是活性中心基团被共价修被共价修饰。不同部分的相同基不同部分

34、的相同基团，修，修饰效果不同，分子内部的效果不同，分子内部的必需基必需基团不易被修不易被修饰。（三）交（三）交联修修饰（交（交联法）法） 分子内交分子内交联：提高：提高酶稳定性的有效方法之一定性的有效方法之一例：胰凝乳蛋白例：胰凝乳蛋白酶上的上的羧基基经过羰二二亚胺活化后，可胺活化后，可以与一系列二胺以与一系列二胺发生作用，使生作用，使酶的的稳定性得到改善。定性得到改善。 分子分子间交交联：形成：形成杂化化酶例：用戊二例：用戊二醛交交联胰蛋白胰蛋白酶和胰凝乳蛋白和胰凝乳蛋白酶，可以降，可以降低胰凝乳蛋白低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂与碱性磷酸脂酶交交联形成的形

35、成的杂化化酶可作可作为部分代部分代谢途径的模型，可途径的模型，可在体内将它在体内将它们输送到同一部位而提高送到同一部位而提高药效。效。（四）固定化修（四）固定化修饰（共价偶（共价偶联法）法） 通通过酶表面的酸性或碱性残基，将表面的酸性或碱性残基，将酶共价共价连接到惰性接到惰性载体上，由于体上，由于酶所所处的微的微环境境发生生改改变，使，使酶的最适的最适pH、最适温度和、最适温度和稳定性定性发生生改改变。（一）蛋白主（一）蛋白主链修修饰（肽链有限水解修有限水解修饰）P285蛋白主蛋白主链修修饰利用利用酶分子主分子主链的切断和的切断和连接，接，使使酶分子的化学分子的化学结构及其空构及其空间结构构发

36、生某些改生某些改变，从而改，从而改变酶的特性和功能的方法。的特性和功能的方法。采用采用酶法法 酶蛋白主蛋白主链修修饰主要是靠主要是靠酶切切/酶原激活法（用原激活法（用专一性一性较强的蛋白的蛋白酶或或肽酶为修修饰剂）。）。u 酶蛋白的蛋白的肽链被水解后，可能出被水解后，可能出现以下三种情以下三种情况中的一种：况中的一种：1. 引起引起酶活性中心的破坏，活性中心的破坏，酶失去催化功能。失去催化功能。2. 仍仍维持活性中心的完整构象，保持持活性中心的完整构象，保持酶活力。活力。3. 有利于活性中心与底物有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化合并形成准确的催化部位，部位，酶活力提高。活力提高。u 后

37、两种情况，后两种情况，肽链的水解在限定的的水解在限定的肽键上上进行，行，称称肽链有限水解。有限水解。 应用用实例例1 1）提高）提高酶活力：活力：u 胃蛋白胃蛋白酶原的激活原的激活 u 天天门冬氨酸切除冬氨酸切除1010个氨基酸残基，可使其活力提个氨基酸残基，可使其活力提高高4-54-5倍。倍。胰蛋白胰蛋白酶原（原（trypsinogen）的激活）的激活 2）消除抗原性）消除抗原性一般大分子的外源蛋白抗原性一般大分子的外源蛋白抗原性较强，经肽链有限有限水解，降低分子量，抗原性水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。著降低，甚至消失。木瓜蛋白木瓜蛋白酶用亮氨酸氨用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除

38、去行有限水解，除去了了2/3肽链，酶活性不活性不变，抗原性大大降低。，抗原性大大降低。u 肽链上氨基酸上氨基酸发生置生置换，引起，引起酶蛋白空蛋白空间构象的构象的改改变，从而改，从而改变酶的某些特性和功能。的某些特性和功能。u 方法：化学修方法：化学修饰法、蛋白法、蛋白质工程工程（二）氨基酸置（二）氨基酸置换修修饰1. 化学修化学修饰法法例：利用化学修例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白法将枯草杆菌蛋白酶活性中心活性中心的的丝氨酸氨酸转换为半胱氨酸，修半胱氨酸，修饰后，后，该酶失去失去对蛋白蛋白质和多和多肽的水解能力，却出的水解能力，却出现了催化硝基苯了催化硝基苯酯等底物水解的活性。等底物水解的活

39、性。化学修化学修饰法法难度大，成本高，度大，成本高，专一性差，而且要一性差，而且要对酶分子逐个分子逐个进行修行修饰，操作复，操作复杂，难以工以工业化化生生产。2. 蛋白蛋白质工程：利用基因操工程：利用基因操纵技技术。u定点突定点突变1、基因序列分析、基因序列分析2、蛋白、蛋白质结构分析构分析3、酶活性中心分析活性中心分析4、引物、引物设计进行基因定点突行基因定点突变5、酶基因克隆表达基因克隆表达6、变异特性分析异特性分析u改改变酶分子中所含的金属离子，使分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能的特性和功能发生改生改变。u例：例：-淀粉淀粉酶中的中的钙离子离子(Ca2+)，谷氨酸脱，谷氨酸脱氢酶中

40、的中的锌离子离子(Zn2+)，过氧化氧化氢酶分子中的分子中的铁离子离子(Fe2+)，酰基氨基酸基氨基酸酶分子中的分子中的锌离子（离子（Zn2+）,超氧化物歧超氧化物歧化化酶分子中的分子中的铜、锌离子离子(Cu2+、Zn2+) u从从酶分子中除去其所含的金属离子，分子中除去其所含的金属离子，酶往往会往往会丧失失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子离子进行置行置换，则可使可使酶呈呈现出不同的特性。出不同的特性。（三）金属离子置（三）金属离子置换修修饰第六第六

41、节 修修饰酶的化学性的化学性质一、一、热稳定性：定性： 一般来一般来说，经过化学修化学修饰的的酶，热稳定性有定性有较大的提高。主要是由于修大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基的多个功能基团与与酶分子的多个功能基分子的多个功能基团相互交相互交联增加了增加了酶分分子构象的子构象的稳定性（定性（表表6-1）。）。二、抗原性：二、抗原性： 修修饰酶的抗原性与修的抗原性与修饰剂有关，目前比有关，目前比较公公认的是的是PEG和人血清白蛋白在消除和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性分子抗原性方面效果方面效果较好（好（表表6-2）。）。三、三、对各各类失活因子的抵抗力失活因子的抵抗力:化学修化学修饰酶与天然与

42、天然酶相比，相比，对蛋白蛋白酶、抑制、抑制剂等失活因子的抵抗力均等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（有不同程度的提高（表表6-3）。）。四、修四、修饰酶在体内的半衰期：多数修在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的在体内的半衰期得到有效延半衰期得到有效延长（表表6-4） 。五、最适五、最适pH:大多数大多数酶经化学修化学修饰后，最适后，最适pH发生生了了变化，化，这在在应用上具有重要意用上具有重要意义（表表6-5） 。六、六、Km 的的变化化:有些有些酶经化学修化学修饰后，后，Km变大，大，这可能是由于屏蔽效可能是由于屏蔽效应引起的。（引起的。（表表6-6）第七第七节 酶化学修化学修饰的的应用和局

43、限性用和局限性一、一、酶化学修化学修饰的的应用用n 医医药方面：化学修方面：化学修饰可以提高医用可以提高医用酶的的稳定性，定性，延延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降生，降低免疫原性和抗原性。低免疫原性和抗原性。n 生物技生物技术领域：化学修域：化学修饰酶能能够提高提高酶对热、酸、酸、碱和有机溶碱和有机溶剂的耐受性，改的耐受性，改变酶的底物的底物专一性和最一性和最适适pH等等酶学性学性质。 n酶结构功能研究：构功能研究：1. 研究研究酶空空间结构与功能的关系，如构与功能的关系，如酶的活性中的活性中心研究；心研究；2. 确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基

44、的功能；3. 测定定酶分子中某种氨基酸的数量。分子中某种氨基酸的数量。二、二、酶蛋白化学修蛋白化学修饰的局限性的局限性1. 某种修某种修饰剂对某一氨基酸某一氨基酸侧链的化学修的化学修饰专一性一性是相是相对的，很少有的，很少有对某一氨基酸某一氨基酸侧链绝对专一的一的化学修化学修饰剂。2. 化学修化学修饰后后酶的构象或多或少都有一些改的构象或多或少都有一些改变，因，因此此这种构象的种构象的变化将妨碍化将妨碍对修修饰结果的解果的解释。3. 酶的化学修的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基只能在具有极性的氨基酸残基侧链上上进行，目前行，目前还不能用化学修不能用化学修饰的方法研究非极的方法研究非极性氨基酸

45、残基在性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。构与功能关系中的作用。4. 酶化学修化学修饰的的结果果对于研究于研究酶结构与功能的关构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，后，酶活力完全活力完全丧失，失，说明明该残基是残基是酶活性所活性所“必需必需”的，的，为什么是必需的，什么是必需的，还得用得用X射射线和其他方法来确定。因此化学修和其他方法来确定。因此化学修饰法研究法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。性。思考思考题：1. 酶活性中心的共性是什么？活性中心的共性是什么？2. 名名词解解释：酶分子化学修分子化

46、学修饰3. 酶分子的化学修分子的化学修饰方法有哪些？方法有哪些？4. 化学修化学修饰剂与与酶蛋白反蛋白反应的的类型有哪些型有哪些？5. 酶肽链的大分子共价修的大分子共价修饰的修的修饰剂和修和修饰反反应有哪些？有哪些？6. 分析分析说明修明修饰酶的性的性质。表表6-1 天然天然酶和修和修饰酶的的热稳定性比定性比较 酶 修修饰剂 修修饰酶 处理条件理条件(/时间) 残留残留酶活活(%)酰苷脱苷脱氢酶 胰蛋白胰蛋白酶 过氧化氧化氢酶 溶菌溶菌酶 尿激尿激酶糜蛋白糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min

47、100/30min 50/10min 100/30min 37/48h 37/24h 70 100 46 64 40 90 20 99 80 0 95 50 天然天然酶酶L-Asn 酶SOD酶 Gln-Aln 酶尿酸尿酸酶腺苷脱腺苷脱氢酶Arg 酶过氧化氧化氢酶胰蛋白胰蛋白酶抗原性抗原性修修饰剂 - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶核糖核酸核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除表表6-2 修修饰酶的抗原性的抗原性变化化表表6-3 天然天然酶和

48、修和修饰酶抗失活因子能力比抗失活因子能力比较酶抗抑制抗抑制剂抗蛋白抗蛋白酶修修饰剂抗失活抗失活剂过氧化氧化氢酶核糖核酸核糖核酸酶溶菌溶菌酶胰蛋白胰蛋白酶 - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶尿激尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白抗胰蛋白酶抗蛋白抗蛋白酶抗糜蛋白抗糜蛋白酶抗胰蛋白抗胰蛋白酶抗抗SDS抗大豆抑制抗大豆抑制剂抗胃蛋白抗胃蛋白酶抗胎抗胎盘抑制抑制剂抗尿素抗尿素抗抗SDS表表6-4 天然天然酶与修与修饰酶的半衰期比的半衰期比较酶羧肽酶Arg 酶Gln-Asn酶尿酸尿酸酶超氧化物岐化超氧化物岐化酶过氧化氧化氢酶修修饰剂半衰期半衰期天然天然酶修修饰酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5 h17 h1.4 h1 h4 h6 min6 h12 h8 h20 h4 h8 h表表6-5 天然天然酶与修与修饰酶的最适的最适pH酶修修饰酶天然天然酶修修饰剂糜蛋白糜蛋白酶猪肝尿酸猪肝尿酸酶吲哚-3 -链烷羟化化酶猪肝尿酸猪肝尿酸酶产沅假沅假丝酵母尿酸酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEG聚丙聚丙烯酸酸肝肝 素素10.57.4 - 8.55.0 - 5.59.08.83.58.28.28.09.0 表表6-6 天然天然酶与修与修饰酶的的Km值