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1、 38. 串联质谱在定性卷烟中串联质谱在定性卷烟中 Amadori 化合物的研究化合物的研究 王军 周宛虹 陆益敏 刘百战 上海烟草（集团）公司技术中心 摘要 摘要 Amadori 化合物（1-氨基-1-脱氧酮糖）是 Maillard 反应的关键中间产物，该类化合物能在不同的反应条件下生成各种芳香物质。在卷烟燃吸过程中 Amadori 化合物会反应生成多种具有芳香气味的小分子化合物，对卷烟烟气质量有重要影响，是卷烟中重要的一类前香物质。本文使用串联质谱方法定性研究卷烟中含有的多种 Amadori 化合物，研究它们的质谱规律。通过使用电喷雾离子源正离子模式（ESI+）以及使用选择离子扫描模式（S
2、IM） ，选择分子离子M+H+为母离子，再做母离子的二级质谱（MS2） ；并对所得质谱数据进行分析，总结出 Amadori 化合物质谱定性方法和质谱碎裂规律。串联质谱是定性分析烟草中 Amadori 化合物的一种有效方法。 关键词 关键词 Maillard 反应， Amadori 化合物，烟草前香物，卷烟，串联质谱 Qualitative Analysis of Amadori Compounds in Cigarette by Tandem Mass Spectrometry Wang Jun, Zhou Wanhong, Lu Yimin, Liu Baizhan The Technica
3、l Center of Shanghai Tobacco (group) Company, Shanghai, 200082, China Abstract: Amadori compounds are 1- amino- 1- deoxyketoses representing a key class of Maillard reaction intermediates. Amadori compounds can yield numerous aromatic substances under different reaction conditions. During cigarette
4、being burned, Amadori compounds produce abundant fragrant molecules, which play an important role in the quality of smoke. Therefore, Amadori compounds are important precursors of tobacco aroma. In this paper, tandem mass spectrometry was applied to qualitatively analyze Amadori compounds in cigaret
5、te and the rule of their mass spectrometry was researched. Positive electrospray ionization (ESI+) mode was used in the experiment. The molecule ions M+H+ of Amadori compounds were selected by SIM (Selected Ion Monitoring) mode and then the tandem mass spectrometry MS2 was acquired from the precurso
6、r ions. According to the analysis of MS2, we summarized the mass spectrometry analysis means and the main fragmentation pathways of the molecule ions M+H+ of Amadori compounds. Tandem mass spectrometry is an efficient method to qualitatively analyze Amadori compounds in tobacco. Keywords: Miallard r
7、eaction; Amadori compound; Precursor of tobacco aroma; Cigarette; Tandem mass spectrometry 1 前言 1 前言 Maillard 反应是一类非酶促棕色化反应，是氨基化合物和羰基化合物之间进行的一系列复杂反应1-2。在烟草、食物加热以及储存过程中，还原糖的羰基与氨基酸的氨基之间发生 Maillard 反应，这类反应是影响烟草、食品香味和颜色的重要反应3。在烟叶调制、醇化以及卷烟加工、贮藏、燃吸等过程中 Maillard 反应始终在发生，是形成均衡、丰富烟气香味不可缺少的方面。1953 年，J. E. Hod
8、ge 通过研究总结了 Maillard 反应的规律4（如图 1 所示） 。 葡萄糖 + 氨基酸N-取代葡萄糖胺+ H2O Amadori重排产物（1-氨基-1-脱氧-2-酮糖）Amadori重排糠醛或羟甲基 糠醛席夫碱还原酮-3H2O-2H2O 裂解产物（丙酮醇，丙酮醛，二乙酰化合物等）-氨基化合物+H2O羟甲基糠醛或糠醛+氨基化合物醛亚胺类-2H+2H脱氢还原酮类黑素（棕色含氮聚合物和共聚物）有或没有氨 基化合物醛（酮）醇类聚合物+氨基化合物醛亚胺或酮亚胺类CO2醛类+醛亚胺类+氨基酸Strecker 降解+氨基化合物+氨基化合物 图 1. Maillard 棕色化反应 Hodge 路线 从
9、图 1 可以看出，通常 Maillard 反应经历三个阶段：反应早期，反应中期和反应高级阶段。反应早期还原糖和氨基酸首先相互作用，重排生成 Amadori 化合物；反应中期 Amadori 化合物发生脱水、环化、裂解等一系列反应生成大量影响食品、烟草风味的物质，如醛酮类、呋喃类、吡喃类、吡咯类、吡嗪类等化合物5； 另外一部分产物在反应高级阶段发生聚合反应生成具有棕色到黑色的高分子聚合物 “类黑素”。“类黑素”对烟草和食品的颜色以及味道也具有重要影响（如图 2 所示）。 反应早期糖和氨基首先相互作用反应早期糖和氨基首先相互作用反应中期裂解，环化，脱水缩合以及寡聚反应中期裂解，环化，脱水缩合以及寡
10、聚风味物质气味，味道反应高级阶段聚合反应风味物质气味，味道反应高级阶段聚合反应高分子“类黑素”颜色，味道高分子“类黑素”颜色，味道Amadori重排产物重排产物 图 2. Maillard 反应经历的不同阶段 从图 2 可以看到 Amadori 化合物（1-氨基-1-脱氧酮糖）是 Maillard 反应的关键中间产物，它是Maillard 反应初期由 N-取代葡萄糖胺转化而来6（如图 3 所示）。 CHOOHHHHOOHHOHHCH2OH+H2NCHRCOOHCHOHOHHHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOH-H2OCHOHHHHOOHHOHHCH2OHNCHRCOOHN-取代葡萄糖
11、胺(Schiff 碱)CHC OHHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOHCH2OHHOOHHOHHCH2OHNHCHRCOOH1-氨基-1-脱氧-2-酮糖 (Amadori 重排产物) 图 3. 还原糖（葡萄糖）与氨基酸反应生成 Amadori 化合物的过程 Maillard 后续反应是从 Amadori 化合物开始进行，Amadori 化合物自身是没有芳香气味的非挥发性物质，但它能在不同的反应条件下以及卷烟燃吸过程中生成各种芳香物质，已经发现 Amadori 化合物是烟草7和食品的重要前香物质。因此，对卷烟中该类化合物的定性研究对深入了解 Maillard 反应，改善卷烟质量，提高卷
12、烟香气都具有重要意义。质谱不仅具有很高的灵敏度，而且还具有优良的选择性，是对化合物定性研究的有效工具。本文中我们使用 4000Q-Trap 型质谱仪对卷烟中的多种 Amadori 化合物 进行定性研究，总结这些化合物的质谱碎裂规律，并对碎裂方式进行合理推导。 2 实验部分 2.1 实验仪器 4000Q-Trap 型串联四极杆线性离子阱质谱仪（美国 ABI 公司） Harvard 连续进样器 2.2 实验试剂与卷烟样品处理方法 甲醇（色谱纯） 去离子水（Milli-Q 系统纯化） 甲酸（分析纯） 120mg 的中华牌卷烟烟丝（硬盒，焦油含量 15mg）放入 50mL 的锥形瓶中，加入 15mL
13、的水和甲醇的混合溶液(1:1/V:V),超声10分钟， 浸泡15小时后再超声10分钟。 取上层清夜， 用纤维素滤膜 （0.45m）过滤，取 1mL 滤液用 2 mL 的 0.1%甲酸混合溶液（水：甲醇 = 1:1/V:V）稀释。 2.3 实验方法 用连续进样器向 4000Q-Trap 质谱进样，流速为 5L/min。质谱使用选择离子扫描(SIM)模式和 MS2 (Product Ion Scan)扫描模式。离子源为 ESI 正离子模式（ESI+） ，离子源喷雾电压(IS)为 5500V。气帘气压(CG)10psi，离子源喷雾气压（GS1）12psi，进口电压(EP)10V，解簇电压(DP)根据
14、不同化合物分别实验优化，结果如表 1 所示。MS2实验用高纯氮气为碰撞气体，碰撞气(CAD)设为 Medium，碰撞电压(CE)20V-25V，根据不同化合物分别实验优化，结果如表 1 所示。碰撞池出口电压(CXP)10V，Q1 和 Q3的分辨率为 Unit。数据分析使用 Analyst 1.4.1 软件。 表 1 Amadori 化合物 DP 和 CE 值优化结果 Amadori 化合物 DP 电压(V) CE 电压(V) 表 1 Amadori 化合物 DP 和 CE 值优化结果 Amadori 化合物 DP 电压(V) CE 电压(V) 1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala
15、） 42 20 1-脱氧-1-L-缬氨酸-D-果糖（Fru-Val） 46 20 1-脱氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu） 48 20 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro） 43 20 1-脱氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe） 42 25 1-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp） 55 25 1-脱氧-1-L-丝氨酸-D-果糖（Fru-Ser） 47 25 1-脱氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖（Fru-Asn） 49 25 3 结果与讨论 将处理过的样品溶液按照上述的实验方法进行各种 Amadori 化合物的质谱图采集实验。在中华牌卷烟烟丝
16、（硬盒，焦油含量 15mg）中检测到多种 Amadori 化合物，每种 Amadori 化合物分别做各自的 MS2质谱图。以 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖(Fru-Pro)的 MS2质谱图为例（如图 4 所示） 。 +M S2 (278.00) CE (20): 10 MCA scans from Sample 2 (fru-pro) of fru-pro(0718).wiff (Turbo Spray), CentroidedMax. 3.8e7 cps.607080901001101201301401501601701801902002102202302402502602702802
17、90300m/z, amu5%10%15%20%25%30%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%85%90%95%100%RlIt(% )163.1260.1242.1278.0128.0232.0116.1213.9157.8187.9132.1173.184.1105.8149.098.0217.8195.870.1H2COHHOOHHOHHCH2OHNCOOHH+Fru-Pro+H+ 图 4 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖分子离子Fru-Pro+H+的 MS2质谱图图 4 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖分子离子Fru-Pro+H+的 MS2质谱图 根据每种
18、 Amadori 化合物的 MS2质谱图总结出它们各自的分子离子M+H+和M+H+的 MS2 离子碎片质荷比(m/z)， （如表 2 所示） 。 表 2 Amadori 化合物的 MS2数据总结 Amadori 化合物 M+H+ (m/z) M+H+ 的 MS2离子 (m/z) 表 2 Amadori 化合物的 MS2数据总结 Amadori 化合物 M+H+ (m/z) M+H+ 的 MS2离子 (m/z) Fru-Ala 252.0 252.0，234.0，216.0，205.9，188.0，163.1，102.0，90.0 Fru-Val 280.1 280.1，262.1，244.2，
19、234.1，216.2，163.1，129.9，118.2 Fru-Leu 294.1 294.1，276.2，258.1，248.1，230.1，163.2，132.2，115.9 Fru-Pro 278.0 278.0，260.1，242.1，232.0，213.9，163.1，128.0，116.1 Fru-Phe 328.1 328.1，310.1，292.1，282.0，264.1，178.1，166.2，163.1 Fru-Trp 366.9 366.9，349.1，331.2，320.8，302.9，217.1，205.0，163.1 Fru-Ser 268.0 268.0，24
20、9.9，232.0，221.8，204.0，135.9，118.0，106.0 Fru-Asn 295.1 295.1，277.1，259.0，249.0，231.3，163.0，145.1，133.0 从表 2 的质谱数据我们总结出 Amadori 化合物的分子离子M+H+容易发生下列几种碎裂： (1) M+H+离子失去 1H2O， 再失去 1CO，M+H-H2O+和M+H-H2O-CO+分别得到 m/z = M+H+-18 和M+H+-18-28； (2) M+H+离子失去 2H2O，再失去 1CO，M+H-2H2O+和M+H-2H2O-CO+分别得到 m/z = M+H+-36 和M+H
21、+-36-28； (3) M+H+离子失去氨基酸分子，得到糖残基离子 m/z = 163.0； (4) M+H+离子碎裂失去糖残基得到氨基酸分子离子AA+H+，m/z = AA+H+； (5) M+H+离子碎裂失去糖残基片段得到 AA+CH2+离子，m/z = AA+CH2+. 根据各种 Amadori 化合物的 MS2质谱碎裂离子可以推导出 Amadori 化合物的合理碎裂规律（如图 5所示） 。 CH2OHHOOHHOHHCH2OH+NH2CHRCOOHM+H+-H2O-2H2OCH2OHOHHCHOH+NH2CHRCOOHCH2OHHHCHO+NH2CHRCOOHOH-COCH2OHHH
22、H+NH2CHRCOOHOHCH2OHHOOHHHCHOH+NH2CHRCOOHCH2OHHOOHHHCHO+NH2CHRCOOHH-COCH2OHHOOHHHH+NH2CHRCOOHH+NH3CHRCOOHCH2NHCHRCOOH+CH2OHHOOHHOHHCH2OH+M+H-2H2O+M+H-2H2O+M+H-2H2O-CO+M+H-H2O+M+H-H2O+M+H-H2O-CO+AA+H+AA+CH2+m/z = 163.0注：注：AA表示氨基酸表示氨基酸-AA-糖残基-糖残基 图 5 Amadori 化合物的质谱碎裂形式推导图 5 Amadori 化合物的质谱碎裂形式推导 表 2 中总结
23、的数据与 Amadori 化合物易发生的合理碎裂方式非常吻合证实了卷烟中这些物质的存在。这些合理碎裂途径的发生和碎裂离子的存在是定性 Amadori 化合物有力的证据。 4 结论 串联质谱不仅具有非常高的灵敏性，而且具有很高的分辨和选择质量的能力，是定性分析烟草中Amadori 化合物的有效方法。测定烟草中由分子量分析可能存在的 Amadori 化合物的 MS2质谱数据，分析这些物质碎裂路径和碎裂产生的离子形式从结构上是否符合 Amadori 化合物的碎裂形式，这是定性Amadori 化合物的重要依据。分子离子M+H+合理的碎片离子质量和碎裂途径可用于 Amadori 化合物的确定。本项实验研
24、究中我们找到了八种 Amadori 化合物，其中 1-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖(Fru-Trp)和1-脱氧-1-L-丝氨酸-D-果糖(Fru-Ser)两种 Amadori 化合物由于含量低且分离困难还未见在烟草中有检测到的报道，使用串联质谱的方法能够简单准确的定性检测这些化合物。 参考文献 参考文献 1. Waller G R, Feather M S. The Maillard Reaction in Food and Nutrition; American Chemical Society: Washington, DC, 1983 1983, 3-18. 2. Nursten H.
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