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1、果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作一、制作果酒果醋的微生物：一、制作果酒果醋的微生物：酵母菌酵母菌真菌真菌醋酸菌醋酸菌细菌细菌二、两种微生物的分类地位二、两种微生物的分类地位1.制作果酒制作果酒酵母菌酵母菌2.制作果醋制作果醋醋酸菌醋酸菌菌种菌种名称名称生物学生物学分类分类代谢代谢类型类型适宜适宜温度温度繁殖方繁殖方式式对氧的需求对氧的需求酵母菌酵母菌真核生真核生物物异养异养兼性厌氧兼性厌氧最适最适2020出芽生出芽生殖殖前期需氧，前期需氧，后期不需氧后期不需氧醋酸菌醋酸菌 原核生原核生物物异养异养需氧需氧30303535二分裂二分裂一直需氧一直需氧控制空气的一些措施控制空气的一些措施控制空气的
2、一些措施控制空气的一些措施三、繁殖方式和代谢类型三、繁殖方式和代谢类型出出出出芽芽芽芽生生生生殖殖殖殖二二二二分分分分裂裂裂裂生生生生殖殖殖殖比较比较果酒制作果酒制作果醋制作果醋制作制作制作原理原理 酵母菌先在有酵母菌先在有氧条件下大量繁殖，氧条件下大量繁殖，再在无氧条件下进再在无氧条件下进行酒精发酵行酒精发酵 醋酸菌在氧气、醋酸菌在氧气、糖源充足时糖源充足时, ,将糖分解将糖分解成醋酸；成醋酸； 当缺少糖源时，当缺少糖源时，将乙醇变为乙醛，再将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸将乙醛变为醋酸四、四、制作原理和发酵条件的比较制作原理和发酵条件的比较制作果酒制作果酒制作果酒制作果酒制作果醋制作果醋制
3、作果醋制作果醋最适发最适发最适发最适发酵温度酵温度酵温度酵温度18181818252525253030303035353535对氧对氧对氧对氧的需求的需求的需求的需求前期：需氧前期：需氧前期：需氧前期：需氧后期：不需氧后期：不需氧后期：不需氧后期：不需氧需充足氧需充足氧需充足氧需充足氧pHpHpHpH酸性环境酸性环境酸性环境酸性环境（3.33.53.33.5）酸性环境酸性环境酸性环境酸性环境（5.46.35.46.3）发酵时间发酵时间发酵时间发酵时间1010101012 d12 d12 d12 d7 7 7 7 8 d 8 d 8 d 8 dC6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2
4、O+能量能量酶酶1、有氧呼吸：、有氧呼吸：C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2+能量能量酶酶2、无氧呼吸：、无氧呼吸：酵母菌酵母菌制酒制酒制作果酒（前期需氧，后期厌氧）制作果酒（前期需氧，后期厌氧）出芽生殖，出芽生殖，出芽生殖，出芽生殖，增加酵母菌数量增加酵母菌数量增加酵母菌数量增加酵母菌数量产生酒精产生酒精产生酒精产生酒精1 1、若氧气、糖源充足时若氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，其反应式：分解成醋酸，其反应式：酶酶 C6H12O6 3CH3COOH（醋酸）（醋酸）2 2、若缺少糖源，氧气不足时，若缺少糖源，氧气不足时，醋酸菌将乙醇变为醋酸菌将乙
5、醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式：乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式： 酶酶2C2H5OH+O2 2CH3CHO（乙醛）（乙醛）+2H2O酶酶2CH3CHO+O2 2CH3COOH（醋酸）（醋酸）醋酸菌醋酸菌制醋制醋制作果醋（一直需要氧）制作果醋（一直需要氧） 五、实验流程示意图五、实验流程示意图1 1、材料的选择与处理材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。除去枝梗。、取葡萄、取葡萄500g500g，去除枝梗和腐烂的叶子。，去除枝梗和腐烂的叶子。、用清水冲洗葡萄、用清水冲洗葡萄1 12 2次除去污物。次除去污物。 讨论：
6、讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会六、实验操作六、实验操作2 2、清洗（、清洗（WHYWHY？）？）3 3、榨汁榨汁 将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。4 4、发酵：发酵装置如下、发酵：发酵装置如下5 5、注意事项、注意事项将葡萄汁装人发酵瓶，将葡萄汁装人发酵瓶， 要留大约要留大约1 13 3的空间的空间 ( (如图右图所示如图右图所
7、示) )，并封，并封闭充气口。闭充气口。（为什么？）（为什么？） 塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间，塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间，有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染70%70%70%70%酒精消毒酒精消毒酒精消毒酒精消毒制葡萄醋制葡萄醋的过程中，要适时的过程中，要适时通过充气口充气通过充气口充气。 将温度严格控制在将温度严格控制在30303535， 时间控制在前时间控制在前7 78d8d
8、左右。左右。制葡萄酒制葡萄酒的过程中，要的过程中，要严格密闭严格密闭， 将温度严格控制在将温度严格控制在18182525， 时间控制在时间控制在101012d12d左右左右，可通过出料口对发酵，可通过出料口对发酵的情况进行。及时的监测。的情况进行。及时的监测。 课题课题2腐乳的制作腐乳的制作专题专题1传统发酵技术的应用传统发酵技术的应用一、一、基础知识基础知识据史料记载，早在公元据史料记载，早在公元5世纪魏代古籍中，就有腐世纪魏代古籍中，就有腐乳生产工艺的记载，到了明乳生产工艺的记载，到了明代我国就大量加工腐乳，而代我国就大量加工腐乳，而今腐乳已成长为具现代化工今腐乳已成长为具现代化工艺的发酵
9、食品。艺的发酵食品。小资料小资料1.你能利用所学的知识，解释豆腐长白毛是怎么一回你能利用所学的知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事吗？事吗？想一想想一想2.王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。答：
10、盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。腐乳制作的原理腐乳制作的原理1、参与腐乳制作的主要微生物、参与腐乳制作的主要微生物主要作用青霉青霉曲霉曲霉酵母酵母毛霉毛霉1 1、关于毛霉：关于毛霉：（1 1）毛霉是一种）毛霉是一种丝状真菌丝状真菌。 繁殖方式为繁殖方式为孢子生殖孢子生殖， 新陈代谢类型为新陈代谢类型为异养需氧异养需氧型。型。（2 2）毛霉在腐乳制作中的作用：）毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶蛋白酶能将豆腐的蛋白质分解成能将豆腐的蛋白质分解成小分子的肽
11、和氨基酸小分子的肽和氨基酸，脂肪酶脂肪酶可将脂肪水解为可将脂肪水解为甘油和脂肪酸甘油和脂肪酸在多种微生物的协同作在多种微生物的协同作用下，普通的豆腐转变成我们爱吃的腐乳用下，普通的豆腐转变成我们爱吃的腐乳发酵的温度发酵的温度发酵的温度发酵的温度为为为为1515151518 18 18 18 。毛霉菌落形态毛霉菌落形态总状毛霉菌落形态总状毛霉菌落形态思思考考题题1. 1. 我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？答：含水量为答：含水量为答：含水量为答：含水量为70%70%左右的豆腐适于作腐乳。用左右的豆腐适于作腐乳。用左右的豆腐适于作腐乳。用左右的豆腐适于作腐
12、乳。用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。2. 2. 吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮皮”。这层。这层“皮皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？它的作用是什么？答：答：答：答：“ “皮皮皮皮” ”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的（匍匐菌丝），它能形成腐乳的（匍匐菌丝），它能
13、形成腐乳的（匍匐菌丝），它能形成腐乳的“ “体体体体” ”，使腐乳成形。，使腐乳成形。，使腐乳成形。，使腐乳成形。“ “皮皮皮皮” ”对人体无害。对人体无害。对人体无害。对人体无害。2、微生物的作用机理、微生物的作用机理酿造腐乳的主要工序是将豆腐进行酿造腐乳的主要工序是将豆腐进行前期发前期发酵酵和和后期发酵后期发酵。前期发酵过程中，毛霉在豆腐（毛坯）上前期发酵过程中，毛霉在豆腐（毛坯）上生长。毛霉生长大约生长。毛霉生长大约5天后使白坯变成毛坯。天后使白坯变成毛坯。豆腐表面被一层菌膜包住，形成腐乳的豆腐表面被一层菌膜包住，形成腐乳的“体体”。同时毛霉分解以蛋白质为主的蛋白酶，将豆腐同时毛霉分解以
14、蛋白质为主的蛋白酶，将豆腐所含有的蛋白质分解为各种氨基酸。所含有的蛋白质分解为各种氨基酸。 在后期发酵过程中，酶与微生物协同在后期发酵过程中，酶与微生物协同作用，通过研制并配入各种辅料（红曲、作用，通过研制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），是蛋白酶作用缓慢，促进面曲、酒酿），是蛋白酶作用缓慢，促进其他生化作用，生成腐乳的香气。其他生化作用，生成腐乳的香气。二二、实验设计实验设计让让豆腐上长豆腐上长出毛霉出毛霉加盐加盐腌制腌制加加卤汤装瓶卤汤装瓶密封腌制密封腌制温度保持在温度保持在15-18；豆腐水分；豆腐水分控制在控制在70%左右。左右。逐层加盐，随层数的加高而增逐层加盐，随层数的加高而增加
15、盐量，腌制大约加盐量，腌制大约8天左右。天左右。卤汤由酒及各种香辛料配制而成。卤汤由酒及各种香辛料配制而成。封瓶时瓶口通过酒精灯火焰防封瓶时瓶口通过酒精灯火焰防止瓶口污染。止瓶口污染。腐乳制作的具体操作步骤：腐乳制作的具体操作步骤：1.将豆腐切成将豆腐切成3cm3cm1cm的若干块；的若干块；2.将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用，每块豆腐等距离供菌种，并能起到保温的作用，每块豆腐等距离排放，周围留有一定距离，豆腐上面再铺上干净排放，周围留有一定距离，豆腐上面再铺上干净的粽叶；的粽叶；3.将平盘放入温度保持在将平盘放入
16、温度保持在15-18的地方；的地方；4.当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及扑在上面的粽叶，使裹平盘的保鲜膜以及扑在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味；散去霉味；5.当豆腐凉透后，将豆腐块间连接在一起的当豆腐凉透后，将豆腐块间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制；制；6.长满毛霉的毛坯与盐的质量分数比为长满毛霉的毛坯与盐的质量分数比为5：1，分层加盐，在瓶口表面盐要铺厚些，大，分层加盐，在瓶口表面盐要铺厚些，大约腌制约腌制8天；天；
17、7.将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤；卤汤；8.将广口玻璃瓶洗净，用高压锅在将广口玻璃瓶洗净，用高压锅在100蒸气灭菌，将腐乳咸坯摆入瓶中，加蒸气灭菌，将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料，密封放置，常温六个入卤汤和辅料，密封放置，常温六个月可以成熟。月可以成熟。三三、操作提示操作提示1、控制好材料的用量、控制好材料的用量a.腌制时注意控制盐的用量腌制时注意控制盐的用量 盐的浓度过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；浓度过高
18、会影响腐乳的口味。b.卤汤中酒的含量应控制在卤汤中酒的含量应控制在12%左右左右 酒精含量过高将会延长腐乳成熟的时间；含量过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。2、防止杂菌污染、防止杂菌污染用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。消毒。装瓶时，操作要迅速小心。装瓶时，操作要迅速小心。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。瓶口被污染。四、四、结果分析与评价结果分析与评价A是否完成腐乳的制作是否完成腐乳的制作a)能够合理的选择实验材料与用具；能够合理的选择实验材料与用具；b)前期发酵后豆腐的表
19、面长有菌丝，后期发酵制前期发酵后豆腐的表面长有菌丝，后期发酵制c)作基本没有杂菌的污染。作基本没有杂菌的污染。B腐乳质量的评价腐乳质量的评价成功的腐乳应具有以下特点：成功的腐乳应具有以下特点：色泽基本一致、味道鲜美、咸淡适口、无异色泽基本一致、味道鲜美、咸淡适口、无异味、块形整齐、厚薄均匀、质地细腻、无杂质。味、块形整齐、厚薄均匀、质地细腻、无杂质。C能否总结不同条件对腐乳风能否总结不同条件对腐乳风味和质量的影响味和质量的影响从盐、酒的用量、发酵的温度、发酵时间从盐、酒的用量、发酵的温度、发酵时间的长短、以及香辛料等因素中的某一因素说明的长短、以及香辛料等因素中的某一因素说明其对腐乳风味或质量
20、的影响。其对腐乳风味或质量的影响。制作制作原理原理实验实验设计设计主要微生物主要微生物根霉根霉酵母酵母结果分析与评价结果分析与评价毛霉毛霉蛋白酶蛋白酶蛋白质蛋白质小分子肽和氨基酸小分子肽和氨基酸腐腐乳乳的的制制作作曲霉曲霉机理机理脂肪酶脂肪酶脂肪脂肪甘油和脂肪酸甘油和脂肪酸让豆腐上让豆腐上长出毛霉长出毛霉加盐加盐腌制腌制加卤汤加卤汤装瓶装瓶密封密封腌制腌制操作提示操作提示控制盐酒的用量控制盐酒的用量防止杂菌污染防止杂菌污染课堂小结课堂小结专题专题1:1:传统发酵技术的应用传统发酵技术的应用一、乳酸菌一、乳酸菌乳酸菌乳酸菌是是发酵糖类发酵糖类主要产物为主要产物为乳酸乳酸的一类的一类细菌的总称。细
21、菌的总称。属于属于原核生物原核生物乳酸菌乳酸菌种类多，分布广种类多，分布广，常见乳酸菌有乳，常见乳酸菌有乳酸链球菌和酸链球菌和乳酸杆菌乳酸杆菌（用于制酸奶）。（用于制酸奶）。乳酸链球菌（球状）乳酸链球菌（球状）乳酸杆菌（杆状）乳酸杆菌（杆状）分布：分布：在自然界分布在自然界分布广泛广泛，空气、土壤、植，空气、土壤、植物体表、人或动物肠道内部都有物体表、人或动物肠道内部都有繁殖：繁殖：以二分裂方式进行繁殖（无性生殖）以二分裂方式进行繁殖（无性生殖）代谢类型：代谢类型：异养异养厌氧型厌氧型C6H12O62C3H6O3+能量能量酶酶乳酸菌耐盐，最适乳酸菌耐盐，最适pH=5，为发酵中的先锋队，为发酵中
22、的先锋队为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？为什么含有抗生素的牛奶不能发酵为酸奶？牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的发酵作用，而作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。二、亚硝酸盐二、亚硝酸盐自然界中，亚硝酸盐自然界中，亚硝酸盐分布广泛分布广泛，蔬菜、咸菜、，蔬菜、咸菜、豆粉中均含有。豆粉中均含有。亚硝酸盐为亚硝酸盐为白色粉末白色粉末，外观与食盐相似，有，外观与食盐相似，有咸味，易溶于水，可作咸味，易溶于水，可作食品添加剂食品添加剂。亚硝酸盐为亚硝酸盐为强氧化剂强氧化剂，能够把血液中携带氧的，能够把血液中携带氧的低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋
23、白，从而导致缺氧低铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而导致缺氧性中毒症状。性中毒症状。膳食中的亚硝酸盐膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康一般不会危害人体健康，但，但是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到是，当人体摄入的亚硝酸盐总量达到0.30.5g时，时，会会引起中毒引起中毒，当摄入总量达到，当摄入总量达到3g时，会时，会引起死亡引起死亡。膳食中的膳食中的绝大部分绝大部分亚硝酸盐亚硝酸盐随尿排出随尿排出，只有在，只有在特定的条件下才会转变成致癌物特定的条件下才会转变成致癌物亚硝胺亚硝胺，亚硝，亚硝胺对动物还具有致畸和致突变作用（亚硝酸盐本身胺对动物还具有致畸和致突变作用（亚硝酸盐本身不是致癌物质）。
24、不是致癌物质）。亚硝酸盐在亚硝酸盐在pH=3，温度适宜和一定微生物的，温度适宜和一定微生物的作用下转变成致癌物质亚硝胺，因此，霉变的食作用下转变成致癌物质亚硝胺，因此，霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍。品亚硝胺可增至数十倍至数百倍。我国卫生标准规定：亚硝酸盐的残留量我国卫生标准规定：亚硝酸盐的残留量在在肉制品肉制品中不得超过中不得超过30mg/kg，酱菜酱菜中不超过中不超过20mg/kg，而而婴儿奶粉婴儿奶粉中不得超过中不得超过2mg/kg。选泡菜坛预处理新鲜蔬菜 配置盐水装坛发酵成品泡菜测定亚硝酸盐含量检查方法：坛口向上，检查方法：坛口向上，压入水中，看坛内壁有压入水中，看坛内壁有无渗水
25、现象。无渗水现象。无裂纹、无砂眼无裂纹、无砂眼坛沿深、盖子坛沿深、盖子吻合好吻合好火火候候好好蔬菜处理蔬菜处理将鲜菜将鲜菜修整、洗涤、阳光下晾晒修整、洗涤、阳光下晾晒，到菜表皮，到菜表皮萎焉时收下，切分成条状或片状。萎焉时收下，切分成条状或片状。配制盐水配制盐水清水与盐按4:1的比例配制好后煮沸冷却煮沸冷却。盐的作用：调味，抑制微生物生长，所以盐含量盐的作用：调味，抑制微生物生长，所以盐含量过低会造成细菌污染。过低会造成细菌污染。煮沸的目的：杀菌煮沸的目的：杀菌冷却是为了不影响乳酸菌的生命活动冷却是为了不影响乳酸菌的生命活动。装坛发酵装坛发酵将将泡菜坛洗净泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。，并
26、用热水洗坛内壁两次。将经过处理的蔬菜将经过处理的蔬菜混合混合均匀，装入泡菜坛内，均匀，装入泡菜坛内，装至装至半坛时半坛时放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至继续装至八成满八成满，再徐徐注入配好的盐水，再徐徐注入配好的盐水，使盐水没过使盐水没过全部菜料全部菜料，盖好坛盖。向坛盖边，盖好坛盖。向坛盖边缘的水槽中缘的水槽中注满水注满水。并注意发酵过程中补充。并注意发酵过程中补充水。水。坛沿注满水是为了保证坛内乳酸菌的发酵所需的无坛沿注满水是为了保证坛内乳酸菌的发酵所需的无氧环境。氧环境。腌制条件腌制条件温度不能过高温度不能过高食盐含量不能过低食盐含量不能过低腌制时间不能过
27、短腌制时间不能过短细菌污染大量繁殖后，细菌污染大量繁殖后，亚硝酸盐含量增加亚硝酸盐含量增加腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。腌制过程中，亚硝酸盐含量先增多，后减少。泡菜发酵的阶段泡菜发酵的阶段泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发泡菜在发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发酵产物乳酸不断累积，因此可以根据微生物的酵产物乳酸不断累积，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段。三个阶段。 蔬菜蔬菜蔬菜蔬菜刚入坛刚入坛刚入坛刚入坛时，时，时，时，蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物蔬菜表面带入的微生物，主
28、要是以，主要是以，主要是以，主要是以不抗酸的不抗酸的不抗酸的不抗酸的大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌和和和和酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌等较为活跃，它们产生较多等较为活跃，它们产生较多等较为活跃，它们产生较多等较为活跃，它们产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。 发发发发酵酵酵酵产产产产物物物物中
29、中中中除除除除乳乳乳乳酸酸酸酸外外外外，还还还还有有有有其其其其他他他他，如如如如乙乙乙乙醇醇醇醇、COCOCOCO2 2 2 2等等等等称称称称异型乳酸发酵异型乳酸发酵异型乳酸发酵异型乳酸发酵发酵前期：发酵前期：特点：还有一点点氧气，微生物（大肠杆菌，酵特点：还有一点点氧气，微生物（大肠杆菌，酵母菌）发酵，产生代谢产物，母菌）发酵，产生代谢产物，二氧化碳排出，形二氧化碳排出，形成无氧环境，为后面乳酸菌发酵提供条件，乳酸成无氧环境，为后面乳酸菌发酵提供条件，乳酸含量逐渐增加，抑制微生物生长繁殖。含量逐渐增加，抑制微生物生长繁殖。 由于由于由于由于前期前期前期前期乳酸的积累乳酸的积累乳酸的积累乳
30、酸的积累，pHpHpHpH下降下降下降下降，嫌气状态嫌气状态嫌气状态嫌气状态的形成，的形成，的形成，的形成，乳酸杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌进行活跃的进行活跃的进行活跃的进行活跃的同型乳酸发酵同型乳酸发酵同型乳酸发酵同型乳酸发酵，乳酸的积累量可达乳酸的积累量可达乳酸的积累量可达乳酸的积累量可达到到到到0.6%0.6%0.6%0.6%0.8%0.8%0.8%0.8%；乳酸积累乳酸积累乳酸积累乳酸积累pHpHpHpH达达达达3.53.53.53.5 3.8.3.8.3.8.3.8.大肠杆菌、酵母大肠杆菌、酵母大肠杆菌、酵母大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为菌、霉菌等的活动受到抑制。这
31、一期为菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段完全成熟阶段完全成熟阶段完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香泡菜有酸味且清香泡菜有酸味且清香泡菜有酸味且清香品质最好品质最好品质最好品质最好。 发酵产物发酵产物发酵产物发酵产物中中中中只有乳酸只有乳酸只有乳酸只有乳酸，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵，称为同型乳酸发酵发酵中期：发酵中期：特点特点:乳酸菌逐渐占据优势，其他发酵微生物受乳酸菌逐渐占据优势，其他发酵微生物受到抑制，乳酸积累增多到抑制，乳酸积累增多在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继在
32、此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继在此期间继续进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达续增加，可达续增加，可达续增加，可达1.0%1.0%1.0%1.0%以上。当以上。当以上。当以上。当乳酸积累乳酸积累乳酸积累乳酸积累达达达达1.21.21.21.2以上以上以上以上时，时，时，时，乳乳乳乳酸杆菌的活性受到抑制酸杆菌的活性受到抑制酸杆菌的活性受到抑制酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。，发酵速度逐渐变缓甚至停止。，发酵速度逐渐变缓甚至停止。，发酵速度逐渐变缓甚至停止。 发酵后期：发酵后期：此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。此阶段泡菜酸度过高、风味不协调。特点：乳酸含量过高，
33、抑制乳酸菌活动，乳酸特点：乳酸含量过高，抑制乳酸菌活动，乳酸菌减少。菌减少。 1 1、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？层白膜是怎么形成的？ 形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。 2 2、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？吃存放时间过长、变质的蔬菜？ 有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰
34、富的硝有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、酸盐。当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。四、亚硝酸盐含量的测定四、亚硝酸盐含量的测定1 1、测定亚硝酸盐含量的原理、测定亚硝酸盐含量的原理 比色法比色法 在在在在盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸发生发生发生发生重氮化重氮化重氮化
35、重氮化反应后，再与反应后，再与反应后，再与反应后，再与N-1N-1N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐结合生成结合生成结合生成结合生成玫玫玫玫瑰红瑰红瑰红瑰红溶液。溶液。溶液。溶液。 将经过反应显色后的将经过反应显色后的泡菜待测样品泡菜待测样品与与标准液标准液比色比色，即可，即可估算估算出样品中的亚硝酸盐含量。出样品中的亚硝酸盐含量。3、步骤、步骤（1 1）配置溶液）配置溶液（2）配制标准液配制标准液（3）制备泡菜样品处理液制备泡菜样品处理液（4）比色）比色2、材料与器具、材料与器具泡菜、泡菜、对氨基苯磺酸、对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺盐酸盐、盐酸萘
36、基乙二胺盐酸盐、盐酸亚硝酸钠、亚硝酸钠、氯化镉、氯化钡、氯化镉、氯化钡、氢氧化钠、氢氧化铝、氢氧化钠、氢氧化铝、蒸馏水、蒸馏水、榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等榨汁机、移液管、容量瓶、比色管等（1 1）配置溶液）配置溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液(4mg/mL)溶于溶于盐酸，避光保存盐酸，避光保存N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液(2mg/mL)避光保存避光保存亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液(5ug/mL)提取剂：提取剂：氯化镉、氯化钡氯化镉、氯化钡氯化镉、氯化钡氯化镉、氯化钡氢氧化铝乳液氢氧化铝乳液氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液（2 2） 配制标准显色液配制标准显色液 用移液管吸取用移
37、液管吸取用移液管吸取用移液管吸取0.20mL0.20mL0.20mL0.20mL、0.40mL0.40mL0.40mL0.40mL、0.60mL0.60mL0.60mL0.60mL、0.80mL0.80mL0.80mL0.80mL、1.00mL1.00mL1.00mL1.00mL、1.50mL1.50mL1.50mL1.50mL亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠溶液溶液溶液溶液( ( ( (相当于相当于相当于相当于1 1 1 1ugug，2ug2ug，3ug3ug，4ug4ug，5ug5ug和和和和7.5ug7.5ug亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠亚硝酸钠) ) ) )，分别置于，分别置于，分别置于，
38、分别置于50mL50mL50mL50mL比色管比色管比色管比色管中，中，中，中，再取再取再取再取1 1 1 1支比色管作为支比色管作为支比色管作为支比色管作为空白对照空白对照空白对照空白对照。 并分别加入并分别加入并分别加入并分别加入2.0mL2.0mL2.0mL2.0mL对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置，混匀，静置，混匀，静置，混匀，静置3 3 3 35 5 5 5分钟后；分钟后；分钟后；分钟后； 再分别加入再分别加入再分别加入再分别加入1.0mL 1.0mL 1.0mL 1.0mL N-1N-1N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液
39、萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液，加，加，加，加蒸馏水至蒸馏水至蒸馏水至蒸馏水至50mL50mL50mL50mL，混匀；，混匀；，混匀；，混匀； 观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化（玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色玫瑰红色逐渐加逐渐加逐渐加逐渐加深）。深）。深）。深）。制备样品制备样品样品处理液的制备样品处理液的制备增加亚硝酸盐的增加亚硝酸盐的溶解度溶解度中和乳酸中和乳酸吸附杂质，脱色，吸附杂质，脱色，净化作用净化作用比色比色样品即滤液加入比色管样品即滤液加入比色管显色反应显色反应：先加对氨基苯磺酸对氨
40、基苯磺酸，后加N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐比色比色：显色后与标准显色液对比，找出颜色：显色后与标准显色液对比，找出颜色最相近的记录对应亚硝酸盐含量最相近的记录对应亚硝酸盐含量测定反应原理总结酸化酸化：对氨基苯磺酸溶于对氨基苯磺酸溶于对氨基苯磺酸溶于对氨基苯磺酸溶于盐酸中盐酸中盐酸中盐酸中重氮化重氮化：亚硝酸盐亚硝酸盐亚硝酸盐亚硝酸盐+ +对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸重氮盐重氮盐 酸酸显色显色：重氮盐+N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐比色：样品和标准比色液对比，比色：样品和标准比色液对比，估算估算亚硝酸盐含量亚硝酸盐含量玫
41、瑰红色玫瑰红色基本基本知识知识实验实验设计设计乳酸菌发酵乳酸菌发酵定义定义分类分类分布分布亚硝酸盐亚硝酸盐操作提示操作提示泡菜坛选择泡菜坛选择腌制条件腌制条件泡泡菜菜的的制制作作及及亚亚硝硝盐盐检检测测发酵原理发酵原理乳酸杆菌乳酸杆菌乳酸链球乳酸链球菌菌葡萄糖葡萄糖乳酸乳酸国家标准国家标准危害危害泡菜制作泡菜制作亚硝酸盐含量测定亚硝酸盐含量测定时间、温度、食盐用量、微生物时间、温度、食盐用量、微生物测定亚硝酸盐含量的操作测定亚硝酸盐含量的操作结果分析与评价结果分析与评价课堂小结课堂小结果酒果酒果酒果酒果醋果醋果醋果醋腐乳腐乳腐乳腐乳泡菜泡菜泡菜泡菜微生物类微生物类微生物类微生物类型型型型原理原
42、理原理原理反应条件反应条件反应条件反应条件检测方法检测方法检测方法检测方法酵母菌，酵母菌，真菌，兼真菌，兼性厌氧性厌氧醋酸菌，醋酸菌，细菌，好细菌，好氧菌氧菌毛霉，真毛霉，真菌，好氧菌，好氧乳酸菌，细乳酸菌，细菌，厌氧菌菌，厌氧菌酵母菌的酵母菌的无氧呼吸无氧呼吸产生酒精产生酒精1825 1825 ，无氧，无氧重铬酸钾重铬酸钾与其反应与其反应呈灰绿色呈灰绿色醋酸菌的醋酸菌的有氧呼吸有氧呼吸产生醋酸产生醋酸30353035，通入，通入氧气氧气品尝、品尝、pHpH试纸检测试纸检测毛霉产生毛霉产生蛋白酶和蛋白酶和脂肪酶脂肪酶15151818接接种，酒精含种，酒精含量控制在量控制在1212左右左右乳酸菌
43、无乳酸菌无氧呼吸产氧呼吸产生乳酸生乳酸常温，无常温，无氧条件氧条件pHpH检测，亚检测，亚硝酸盐的检硝酸盐的检测方法测方法 某学生把甘某学生把甘蓝切切丝后制作泡菜，后制作泡菜，为了探究甘了探究甘蓝在不在不同的温度下同的温度下经过3天天发酵后所生成的乳酸量，在第酵后所生成的乳酸量，在第4天天检测的的实验结果如表：果如表： (1)分析分析资料，你可以得出什么料，你可以得出什么结论?(2)在泡菜制作在泡菜制作时，乳酸含量大致在，乳酸含量大致在0. .8左右左右时风味最味最好，此好，此时维生素生素C的保存率也的保存率也较高，高，结合以上材料，你合以上材料，你在制作泡菜在制作泡菜时应该注意什么注意什么?
44、练习题练习题(1)分析资料，你可以得出什么结论分析资料，你可以得出什么结论?从表中数据分析可得知，甘蓝在从表中数据分析可得知，甘蓝在31时所生成时所生成的乳酸含量最多，低于或者高于这个温度所生成的的乳酸含量最多，低于或者高于这个温度所生成的乳酸量都比较少一些。乳酸量都比较少一些。(2)在泡菜制作时，乳酸含量大致在在泡菜制作时，乳酸含量大致在0.8左右时风左右时风味最好，此时维生素味最好，此时维生素C的保存率也较高，结合以上的保存率也较高，结合以上材料，你在制作泡菜时应该注意什么材料，你在制作泡菜时应该注意什么?注意把温度控制在注意把温度控制在16左右为宜左右为宜2001年年1月月4日日（封坛前
45、）（封坛前）2001年年1月月8日日2001年年1月月12日日2001年年1月月15日日2001年年1月月19日日0.150.600.200.100.101号坛号坛2号坛号坛0.150.200.100.050.053号坛号坛0.150.800.600.200.20泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化 4 4、实验结果分析和讨论选录、实验结果分析和讨论选录 三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。在腌制后的第五天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量腌制后的第五
46、天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都达到最高峰（都达到最高峰（1 1、2 2、3 3号坛中的亚硝酸盐分别号坛中的亚硝酸盐分别达到达到 0.6mg/kg0.6mg/kg、0.2mg/kg0.2mg/kg、0.8mg/kg0.8mg/kg）在腌制后的前在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌
47、），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖，但随着腌制时间的延长，乳酸菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。降。专题专题2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题课题1 1微生物的实验室培养微生物的实验室培养. .微生物的类群微生物的类群微微生生物物原核类原核类: :真核类真核类非细胞类：非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结
48、构简单个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌酵母菌、霉菌、食用菌真菌：真菌：原生生物：原生生物： 显微藻类、原生生物显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形（如：草履虫、变形虫等）虫等）病毒、类病毒、朊病毒病毒、类病毒、朊病毒微生物的共同特点：微生物的共同特点：一一. .微生物基础知识微生物基础知识1.1.细菌的形态细菌的形态细菌主要是以二分裂的方式细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）进行增殖（如右图）2.2.细菌的繁殖细菌的繁殖3.3.细菌的菌落细菌的菌落. .定义：定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有繁殖时，会形成一
49、个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。. .特征：特征： 大小、形状、光泽度、颜色、硬度、大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。透明度等。. .功能：功能： 每种细菌在一定条件下所形成的菌落，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以可以作为菌种鉴定的重要依据作为菌种鉴定的重要依据。几种菌落及其形态几种菌落及其形态4.4.病毒的结构病毒的结构 : :由核酸和蛋白质构成。由核酸和蛋白质构成。病毒的结构病毒的结构吸附吸附吸附吸附注入注入注入注入合成合成合成合成释放释放释放释放组装组装组装组装5.5.病毒的繁殖病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五个阶段，
50、即：病毒的增殖一般可分五个阶段，即：吸附吸附注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质组装组装释放释放6.6.病毒的营养方式病毒的营养方式：寄生：寄生微生物需要的五大类营养要素物质是：微生物需要的五大类营养要素物质是：. .微生物需要的营养物质及功能微生物需要的营养物质及功能1.1.碳源碳源 2.2.氮源氮源 3.3.生长因子生长因子 4.4.无机盐无机盐 5.5.水水：凡是能为微生物提供所需碳元素的：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。营养物质。无机碳源：无机碳源：COCO2 2；NaHCONaHCO3 3等等有机碳源：有机碳源：糖类糖类、脂肪酸、花生、脂肪酸、花生粉饼、石油等粉饼
51、、石油等构成细胞物质和一些代谢产物构成细胞物质和一些代谢产物异养微生物的能源异养微生物的能源. .概念概念. .来源：来源：. .作用：作用：1.1.微生物的碳源微生物的碳源无机氮源：无机氮源：无机氮源：无机氮源：N N N N2 2 2 2、NHNHNHNH4 4 4 4+ + + +、NONONONO3 3 3 3- - - -、NHNHNHNH3 3 3 3等。等。等。等。有机氮源：有机氮源：有机氮源：有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等基酸等基酸等基酸等凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提
52、供凡是能够为微生物提供N N N N元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含N N N N的代谢产的代谢产的代谢产的代谢产物。物。物。物。2.2.微生物的氮源微生物的氮源. . . .概念：概念：概念：概念：. . . .来源：来源：来源：来源：. . . .作用：作用：作用：作用：3.3.生长因子生长因子. . . .常见的生长因子：常见的生长因子：常见的生长因子：常见的生长因子：. . . .概念：概念：概念：概念：. . . .作用：作用：作用：作用：微
53、生物生长不可缺少的微量有机物。微生物生长不可缺少的微量有机物。微生物生长不可缺少的微量有机物。微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。. .培养基培养基 培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制而成由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。基质。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途2.2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配不同的微生物往往
54、需要采用不同的培养基配方方( (参考教材附录内容参考教材附录内容) )3.3.不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、氮氮源源、无机盐无机盐、等等营养物质，另外还需要满足微营养物质，另外还需要满足微生物生长对生物生长对pHpH、特殊营养物质特殊营养物质, ,例如例如: :生长因子生长因子( (即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物, ,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) )以及以及氧氧气气、二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压等等的要求。的要求。 划分划分标准准培养基种培养基种类特点特点用途用途物理性物
55、理性质化学成分化学成分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基用途用途鉴别培养基培养基培养基的种类培养基的种类不加凝固不加凝固剂加凝固加凝固剂，如，如琼脂脂工工业生生产观察微生物的运察微生物的运动、分分类鉴定定微生物分离、微生物分离、鉴定、定、活菌活菌计数、保藏菌数、保藏菌种种含化学成分不明确的天然物含化学成分不明确的天然物质工工业生生产培养基成分明确培养基成分明确分分类、鉴定定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质, ,以抑制不需要的微生物的以抑制不需要的微生物的生生长, ,促促进所需要的微生物的所需要的微生物的生生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种
56、指示在培养基中加入某种指示剂或化学或化学药品品, ,用以用以鉴别不同种不同种类的微生物的微生物鉴别不同种不同种类微微生物生物选择培养基培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长沉淀生长沉淀生长backbackbackback半固体培养基：半固体培养基：( (是否运动是否运动) ) 无动力无动力无动力无动力有动力有动力有动力有动力( ( ( (弥散弥散弥散弥散) ) ) )固体培养基：菌落固体培养基：菌落分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因
57、的受体细胞几种选择培养基几种选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基backbackbackback血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子； 激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。原等。各种生长因子各种生长因子
58、转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。（如血清）。. .无菌技术无菌技术1.1.1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌技术的概念无菌技术的概念 无菌操作泛指无菌操作泛指无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。菌污染的方法。菌污染的方法。菌污染的方法。消毒定义：消毒定义：消毒定义：消毒定义： 利用化学或物理
59、方法，杀死利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死部份部份部份部份微生物的过程。微生物的过程。微生物的过程。微生物的过程。2.2.2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别 灭菌的定义：灭菌的定义：灭菌的定义：灭菌的定义：以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭所有所有所有所有微生物，包微生物，包微生物，包微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及
60、病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到到到到完全无菌完全无菌完全无菌完全无菌之过程。之过程。之过程。之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。也是最重要的技术。也是最重要的技术。也是最重要的技术。煮沸消毒法：煮沸消毒法：100100煮沸煮沸5-6min5-6min。巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-7570-75下煮下煮30min30min或或 8080下煮下煮15min15min。化学药剂消毒法：用化学药剂消毒法：用75%75%酒精、新洁尔酒精
61、、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。紫外线消毒。紫外线消毒。. .消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌：干热灭菌：160-170 160-170 下加下加热热1-2h1-2h。高压蒸气灭菌：高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min. .灭菌的方法：灭菌的方法： 最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保
62、持培养基的营养成的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。不能通过。 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的
63、污染而设计的。器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 二二. .实验操作实验操作( (以培养大肠杆菌为例以培养大肠杆菌为例) ). .制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基1.1.计算计算2.2.称量称量3.3.溶化溶化4.4.灭菌灭菌: : 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa100kPa、温度为、温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。5 5. .倒平板倒平板: : 待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯左右时，在酒精灯附近倒平板。附近倒平板。2d2d后观察平板，无杂菌污染才可后观察平板，无杂菌
64、污染才可用来接种用来接种。倒倒平平板板操操作作. .纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法。微生物的接种的微生物的接种的常用接种方法有常用接种方法有：1.1.平板划线的操作方法平板划线的操作方法平板划线的操作平板划线的操作一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。状的菌落。2.2.稀释涂布平板稀释涂布平板的操作方法的操作方法
65、4.4.菌种的保存菌种的保存接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。3.3.微生物的恒温培养微生物的恒温培养. .长期保存：长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法. .临时保藏：临时保藏：三三. .结果分析与评价结果分析与评价 . . . .培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 1 1 12d2d2d2d后无菌落生长后无菌落生长后无菌落生长后无菌落生长，说明培养基的制
66、备是成功的，否则需要重新制备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。. . . .接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，
67、则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。. . . .是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录培养
68、培养培养培养12h12h12h12h与与与与24h24h24h24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。些细微的变化。些细微的变化。些细微的变化。营养类型营养类型营养类型营养类型能源能源能源能源氢的供体氢的供体氢的供体氢的供体基本碳源基本碳源基本碳源基本碳源微生物举例微生物举例微生物举
69、例微生物举例代谢类型代谢类型光能无机营养光能无机营养光能无机营养光能无机营养( ( ( (光能自养型光能自养型光能自养型光能自养型) ) ) )光能有机营养光能有机营养光能有机营养光能有机营养( ( ( (光能异养型光能异养型光能异养型光能异养型) ) ) )化能无机营养化能无机营养化能无机营养化能无机营养( ( ( (化能自养型化能自养型化能自养型化能自养型) ) ) )化能有机营养化能有机营养化能有机营养化能有机营养( ( ( (化能异养型化能异养型化能异养型化能异养型) ) ) )光光光光光光光光无无无无机机机机物物物物有有有有机机机机物物物物无机物无机物无机物无机物有机物有机物有机物有
70、机物无机物无机物无机物无机物有机物有机物有机物有机物二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳及简单有及简单有及简单有及简单有机物机物机物机物二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳有机物有机物有机物有机物大多数已知细大多数已知细大多数已知细大多数已知细菌和全部真核菌和全部真核菌和全部真核菌和全部真核微生物微生物微生物微生物硝化细菌硝化细菌硝化细菌硝化细菌氢细菌氢细菌氢细菌氢细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌蓝细菌蓝细菌蓝细菌蓝细菌绿色硫细菌绿色硫细菌绿色硫细菌绿色硫细菌藻类藻类藻类藻类本课题知识小结本课题知识小结: :课题课题2 2土壤中分解尿素的土壤中分解尿
71、素的细菌的分离与计数细菌的分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶脲酶脲酶 + H+ H2 2O O+ CO+ CO2 22NH2NH3 33 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、
72、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例： PCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的时要根据它对生存环境的要求，到要求，到相应的环境相应的环
73、境中去寻找。中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是一是一种在种在体外将少量体外将少量DNADNA大量大量复制复制(PCR)(PCR)的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。. .筛选菌株筛选菌株 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法：方法：
74、 抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的的生长生长结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微，同时抑制或阻止其他微生物生长。生物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2
75、 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素，只，只，只，只有能合成有能合成有能合成有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才的微生物才的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，
76、以尿素作为能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为氮源。氮源。氮源。氮源。缺乏缺乏缺乏缺乏脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿素的微生物。素的微生物。素的微生物。素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选
77、择分解尿素的微生物的原理允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜直接计数：、显微镜直
78、接计数：利用利用血球计数板血球计数板( (血细胞计数板血细胞计数板），在显微镜，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。下计算一定容积里样品中微生物的数量。. .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细
79、胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性
80、。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致致，意意味味着着操操作作有有误误，需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平板中个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。计算公式：计算公式：
81、每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的
82、是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混混入入了了其其他他的的含氮物质含氮物质)小结：通过这个事例
83、可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制
84、有问题。从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3 3 cmcm左左右右，再再取取样样，将将样样品品装装入入事事先先准准备备好的信封中。好的信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基” 一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 二二 制备培养基制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：择了一
85、个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释每个稀释度下需要度下需要3个选择培养基，个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要需要8个灭菌试管和个灭菌试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了基是否
86、起到了选择选择作用。作用。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得
87、菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（三）（三）样品的稀释样品的稀释问问题题：为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样
88、样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。. .取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或
89、2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，
90、需要重新实验。，需要重新实验。. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察操作
91、提示操作提示 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。 三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间 三、
92、三、四四. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。1
93、.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将升高，指示剂将变红变红，说明该细菌能够，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到滤膜放到 伊红伊红- -美蓝美蓝 培养基上培养，大培养基上培养，大肠杆菌肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记算得出水，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。五五. .课外延伸课外延伸大肠杆菌呈深紫色大肠杆
94、菌呈深紫色, ,中心有或无金属光泽中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :纤维素：棉花棉花是自然是自然界中纤维素界中纤维素含量最高的含量最高的天然产物；天然产物；纤维素是地球上含量最丰富的纤维素是地球上含量最丰富的多糖类多糖类物质，植物质，植物每年产生的纤维素超过物每年产生的纤维素超过7070亿吨；分布植物的亿吨；分布植物的根、茎、叶中；根、茎、叶中；1 1、在草食性动物等的消化道内，也、在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素共生有分解纤维素的微生物的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维
95、素，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。而人没有分解纤维素的能力。2 2、农作物秸秆农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑 等富等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源科学家正致力于研究，怎样将科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，速的草本植物，转化为种类繁多转化为种类繁多的生物燃料的生物燃料（甚至是航空燃油）。（甚
96、至是航空燃油）。一、基础知识一、基础知识1.1.纤维素纤维素纤维素是一种由纤维素是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高高分子分子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类物质。类物质。 土壤中某些微生物能够产生土壤中某些微生物能够产生纤维素酶纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。2.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少包至少包括三种组分括三种组分，即，即C C1 1酶酶( (外切酶外切酶) )、C CX X酶酶( (内切酶内切酶) )和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤
97、维二，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素一、基础知识一、基础知识在在2支支20mL的试管中，分别放入的试管中，分别放入16cm的滤纸条，再分别加入的滤纸条，再分别加入pH为为4.8、物质的量、物质的量浓度为浓度为0.1mol/L的的醋酸醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入。在加入10mL缓冲液的试管中加入缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（纤维素酶（7080U/mL）。将二支试）。将二支试管固定在管固定在50mL的锥形瓶
98、中，在摇床上以的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应的转速振荡反应1h，观察结果。，观察结果。1U表示表示1个酶活力单位，是指在温度为个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，其他反应条件，如如pH等，均为最适的情况下，在等，均为最适的情况下，在1min内转化内转化1mmol的底物所的底物所需的酶量。需的酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶所作用和催化的化合物。 在在一支试管中添加一支试管中添加纤维素酶，纤维素酶，另另一支试管不添加一支试管不添加纤维素酶；纤维素酶；思考思考1实验分析：实验分析：P27的小的小实验是如何构成对照的？实验是如何构成对照的？滤滤纸纸崩崩溃溃
99、法法（2 2）纤维素分解菌的筛选）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，分解后，红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_来来筛选纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛
100、选纤维素分解菌素分解菌练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维
101、二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到布到鉴别鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样? 培养的目的培养的目的? ? 选择培养基的选择培养基的特点特点? ?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要
102、求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落 挑取产生挑取产生明显的透明圈的菌落，明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。一般即为分解纤维素的菌落。 接种到接种到纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养培养基上，在基上，在30300 0C C 37 370 0C C培养，可获得纯培养，可获得纯培养。培养。四、结果分析与评价四、结果分析与评价1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的
103、制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染
104、色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结专题专题3 3植物组织培养技术植物组织培养技术一、基础知识一、基础知识课题课题1 1：菊花的组织培养菊花的组织培养（1 1）细胞的分化）细胞的分化概念：概念： 在个体发育中，在个体发育中，由一个或一种由一个或一种细胞增殖产生细胞增殖产生的后代，在形的后代，在形态、结构、生态、结构、生理功能上发生理功能上发生稳定性差异的稳定性差异的过程过程 过程：过程：1 1、植物的组织培养的基本过程、植物的组织培养的基本过程特点：特点：（2 2）稳定性：稳定性：（1 1）持久性：持久性：一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后一般来说，分化了的细胞将一直保持
105、分化后的状态，直到死亡的状态，直到死亡（3 3）普遍性：普遍性：原因：原因： 基因在特定的时间和空间条件下的选基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果择性表达的结果结果：结果： 形成不同的细胞和组织形成不同的细胞和组织（2 2）细胞的）细胞的全能性全能性定义：定义： 已经分化的细胞，仍然具有发育成完整已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能个体的潜能原理：原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的特有的全套遗传物质全套遗传物质，都有发育成为完，都有发育成为完整个体所必需的整个体所必需的全部基因全部基因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能高度
106、特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的该物种遗传性所需要的遗传物质遗传物质已分化的植物细胞，仍具有已分化的植物细胞，仍具有全能性全能性实例实例受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞全能性的比较全能性的比较: :（3 3）植物组织培养）植物组织培养细胞离体细胞离体必要条件：必要条件：一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件原理原理: :细胞的全能性细胞的全能性外植体：离体的器官、组织、细胞外植体：离体的器官、组织、细胞相关
107、概念相关概念: :脱分化：脱分化：再分化：再分化：细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则, ,是高度液泡化的、成是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞无定形状态的薄壁细胞由高度分化的植物组织或细胞产由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。也叫去分化生愈伤组织的过程。也叫去分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程又可以重新分化成根或芽等器官的过程愈伤组织愈伤组织: :人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织2 2、影响植物组织培养的因素、影响植物组织培
108、养的因素（1 1）植物材料的选择）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞枸杞愈伤组织的芽诱导比较难愈伤组织的芽诱导比较难B B、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝上部新萌生的侧枝A A、植物材料的选择直接关系到实验的成败、植物材料的选择直接关系到实验的成败（2 2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，件的要求相对特殊，需配置适宜的培养基需配置适宜的培
109、养基MSMS培养基主要成分包括：培养基主要成分包括：A A、大量元素大量元素: N: N、P P、 S S 、 K K、CaCa、MgMg等等B B、微量元素微量元素:B:B、MnMn、CuCu、ZnZn、FeFe、MoMo、I I、 CoCo等等C C、有机物、植物激素有机物、植物激素常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素赤霉素生长素类：生长素类：2 2，4 4二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）、）、吲吲哚乙酸（哚乙酸（IAAIAA）、）、萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）、）、吲吲哚丁酸（哚丁酸（IBAIBA）细胞分裂素类：细胞分裂素类：
110、激动素（激动素（KTKT）、）、6 6苄基嘌呤苄基嘌呤（ 6 6BABA）、）、玉米素（玉米素（ZTZT）赤霉素类：赤霉素类：赤霉酸（赤霉酸（GA3GA3）（3 3）植物激素的影响）植物激素的影响生长素和细胞分裂素作用生长素和细胞分裂素作用植物中植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长素，后使用先使用生长素，后使用细胞分裂素细胞分裂素有利于细胞分裂，但不有利于细
111、胞分裂，但不利分化利分化先使用细胞分裂素后使先使用细胞分裂素后使用生长素用生长素细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化同时使用同时使用分化频率高分化频率高生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 有利于根的分化有利于根的分化生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素再分化再分化再分化再分化植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养不需要光不需要光不需要光不需要光需要光需要光需要光需要光1 1、培育无病毒植株、培育无病毒植株2 2、 培养紫草愈伤组织培养紫草愈伤组织, ,提取紫草素（提取紫草素（治疗烫治疗烫伤和割伤
112、的药物以及染料和化妆品的原料）伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4 4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法4 4、植物组织培养的应用：植物组织培养的应用： 3 3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题或发芽率低等问题二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分
113、，实验室一般使多种营养成分，实验室一般使用用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量2 2、配置培养基、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形
114、瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素添加植物激素3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌灭菌1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻刷洗，刷洗后在
115、流水下冲洗20min20min左右左右 酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为放入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无菌水中至少清洗取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液（三）接种三）接种污染的主要来源
116、是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精喷雾使空的酒精喷雾使空气消毒，气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射外线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无、无菌菌操作要求操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种4 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分
117、每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7070的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充分块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养
118、基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒。培养温度期间应定期消毒。培养温度1822
119、1822，每日用，每日用日光灯光照日光灯光照12h12h（五）移栽五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间（六）栽培六）栽培3 3、移栽、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤
120、中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花植物的花药培养在育种上有什植物的花药培养在育种上有什么意义？么意义？花粉粒（花粉粒（1N）单倍体植株单倍体植株（1N）二倍体纯合子二倍体纯合子植株（植株（2N）缩短了缩短了育种周期，育种周期，为新品种的为新品种的培育开辟了培育开辟了新途径。新途径。花的结构花的结构花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉囊状结构，内有很多花粉花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）经花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）经过过减数分裂减数分裂而形成的，因此，花
121、粉是而形成的，因此，花粉是单倍体的单倍体的生殖细胞生殖细胞。花粉的发育要经历：花粉的发育要经历：四分体四分体时期、单核时期、单核期、双核期期、双核期等阶段。等阶段。（一）被子植物的花粉发育一）被子植物的花粉发育雄蕊雄蕊（一）被子植物的花粉发育（一）被子植物的花粉发育1花粉母细花粉母细胞（胞（2n）4个小个小孢子孢子(小孢子小孢子四分体四分体)（n）减分减分有分有分1个花粉管细胞核个花粉管细胞核（n）1个生殖细胞核个生殖细胞核（n）有分有分2个精子个精子单核居中期单核居中期（n）单核靠边期单核靠边期（n）注意：二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管花粉管细胞核和生
122、殖细胞核细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个一个营养核和两个精子。精子。两个精子和一个营养核的两个精子和一个营养核的基因型基因型相同。相同。（二）产生花粉植株的两种途径二）产生花粉植株的两种途径形成原因：主要形成原因：主要取决于培养基中取决于培养基中的激素的种类及的激素的种类及其浓度的配比其浓度的配比体细胞胚（胚状体）：体细胞胚（胚状体）：在组织培
123、养过程中，某些体细胞在在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为被称为体细胞胚（胚状体）体细胞胚（胚状体）。（三）影响花药培养的因素（三）影响花药培养的因素1、材料的选择、材料的选择不同植物不同植物同一植物的不同生理状况同一植物的不同生理状况（花期早期初花期花期早期初花期）合适的花粉发育期合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间单核居中期与靠边期之间）此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等密度等2、培养基的组成、培养基
124、的组成实验操作实验操作材料选取材料选取材料和材料和消毒消毒接种和接种和培养培养（一）材料选取（一）材料选取通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法：最常用的方法：醋酸洋红法。醋酸洋红法。某些植物的花粉细胞核不易着色，某些植物的花粉细胞核不易着色，采用采用焙花青焙花青-铬矾法铬矾法，这种方法能将，这种方法能将花粉细胞核花粉细胞核染成染成蓝黑色蓝黑色。月季的初花期月季的初花期。选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，重要因素。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向在单核期，
125、细胞核由中央移向细胞一侧的时期细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。，花药培养成功率最高。二、材料的消毒：二、材料的消毒：花花蕾蕾（70酒精）酒精）大约大约30s（无菌（无菌水）水）清洗清洗（无菌吸（无菌吸水纸）水纸）吸干水分吸干水分（1氯化氯化汞溶液）汞溶液）24min（无菌（无菌水）水）冲洗冲洗 月月季花蕾的消毒与菊花外植体的消季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？毒相比较，二者有何不同？在酒精消毒前，花药不需要预先用流在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗三、接种和培养三、接种和培养剥取剥取花药花药接种花药接种花药培养培养分化
126、培养基培养分化培养基培养鉴定和筛选鉴定和筛选不要损伤花药不要损伤花药？要彻底除去花丝要彻底除去花丝？常常会出现染色体倍性的变化常常会出现染色体倍性的变化？每个培养瓶接种每个培养瓶接种 （7 710 10 ） 个花药个花药？花药长出愈伤组织还要转移花药长出愈伤组织还要转移到哪？到哪？主要原因是主要原因是营营养核和生殖核养核和生殖核融合融合造成的造成的植物组织培养技术与花药培养技术的植物组织培养技术与花药培养技术的异同点异同点项目项目相同点相同点不同点不同点植物组织培养植物组织培养技术技术离体的植物离体的植物组织经脱分组织经脱分化形成愈伤化形成愈伤组织，再分组织，再分化成丛芽，化成丛芽，诱导出根，
127、诱导出根，然后进行移然后进行移栽。栽。外植体为体细胞，外植体为体细胞，染色体数染色体数无无需加倍。需加倍。花药培养技术花药培养技术取材为花药，培养的为取材为花药，培养的为单倍体幼苗单倍体幼苗，植株，植株弱小，弱小，高度不育高度不育，必须用，必须用秋水秋水仙素处理仙素处理，使染色体加，使染色体加倍，恢复正常植株的染倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。色体数，而且为纯种。专题4酶的研究与应用课题1 果胶酶在果汁 生产中的作用一、课题目标一、课题目标 1.1.简述果胶酶的作用；简述果胶酶的作用； 2.2.检测果胶酶的活性；检测果胶酶的活性； 3.3.探究温度和探究温度和pHpH对果胶酶活性对果胶
128、酶活性的影响以及果胶酶的最适用量；的影响以及果胶酶的最适用量； 4.4.搜集有关果胶酶应用的资料。搜集有关果胶酶应用的资料。二、课题重点与难点二、课题重点与难点课题重点：课题重点： 温度和温度和pHpH对果胶酶活性的影响。对果胶酶活性的影响。课题难点：课题难点： 果胶酶的最适用量。果胶酶的最适用量。三、基础知识分析三、基础知识分析知识要点知识要点: :1.1.果胶酶的作用；果胶酶的作用；2.2.酶的活性的定义；酶的活性的定义；3.3.影响酶活性的因素；影响酶活性的因素；4.4.果胶酶的用量。果胶酶的用量。(一)细胞壁的结构及作用：作用是什么？作用是什么？特点？特点？结构组成？结构组成？保护植物
129、细胞；支撑植物细胞弹性小；全透性纤维素、果胶1.1.果胶果胶植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分 植物细胞壁以及胞间层的主要组成植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由成分之一，它是由半乳糖醛酸半乳糖醛酸聚合而成聚合而成的一种的一种高分子化合物高分子化合物，不溶于水。，不溶于水。果胶果胶: :在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果果胶胶，瓦解植物细胞的，瓦解植物细胞的细胞壁细胞壁及及胞间层胞间层，使，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的榨取果汁更容易，而果胶分解成
130、可溶性的半乳糖醛酸半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。，也使得浑浊的果汁变得澄清。果胶酶果胶酶 果胶酶并不特指某一种酶，而是分果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括解果胶的一类酶的总称，包括多聚多聚半乳半乳糖醛酸糖醛酸酶酶、果胶分解酶果胶分解酶和和果胶脂酶果胶脂酶等。等。果胶酶果胶酶: :2.2.酶的活性与影响酶活性的因素酶的活性与影响酶活性的因素 指酶催化一定化学反应的能力。酶反指酶催化一定化学反应的能力。酶反应速度用应速度用单位时间单位时间内内单位体积单位体积中中反应物反应物的减少量的减少量或或生成物的增加量生成物的增加量来表示来表示. .(1)(1)酶的活性酶的活性(
131、2)(2)影响酶活性的因素影响酶活性的因素a.a.温度温度b.pHb.pHC. .酶的抑制酶的抑制剂剂. .果胶酶的用量果胶酶的用量()探究温度和探究温度和pH对酶活性的影响对酶活性的影响四、实验设计1、设计实验方案、设计实验方案A、确定温度确定温度/PH梯度（梯度（5C0/10C0）/PH5、6、7、8探究控制温度探究控制温度/PH的方法和的方法和措施措施你的实验变量是什么？如何设定？你的实验变量是什么？如何设定？B、确定水果的种类、确定水果的种类确定制备果汁的方确定制备果汁的方法法确定实验用的水果用量确定实验用的水果用量确定果胶酶的确定果胶酶的用量用量控制测定果胶酶活性的方法控制测定果胶酶
132、活性的方法()探究温度和pH对酶活性的影响2、实验操作步骤：、实验操作步骤：制备水果泥制备水果泥配制果胶酶配制果胶酶水果泥与果胶酶分别水浴保温水果泥与果胶酶分别水浴保温将水果泥和果胶酶混合保温将水果泥和果胶酶混合保温过滤出果汁过滤出果汁记录果汁量记录果汁量改变不同的温度改变不同的温度/PH后重复以上实验后重复以上实验()探究温度和pH对酶活性的影响3、设计记录数据的表格、设计记录数据的表格4、得出结论与分析：、得出结论与分析：画曲线图；最适温度画曲线图；最适温度/PH是是温度温度/PH果汁果汁量量/ml在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：1 1与其他
133、工业用酶基本相同，果胶酶的与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用10 10 作为温度梯度，设置的具体温度为作为温度梯度，设置的具体温度为10 10 、20 20 、30 30 、40 40 、50 50 和和60 60 等，也等，也可以尝试以可以尝试以5 5 作为温度梯度。作为温度梯度。2 2苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水一般可按每个中等大小的苹果加水100100200 200 mL
134、mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。3 3果泥的用量可以采用果泥的用量可以采用5 5 mLmL左右，果左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为胶酶的用量可采用质量浓度为2%2%的果胶酶溶的果胶酶溶液液2 2 mLmL。4 4水浴时间可以为水浴时间可以为202030 min30 min。5 5过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。6 6探究探究pHpH对果胶酶活性的影响，只须对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成将温度梯度改成pHpH梯度，并选定一个适宜的梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的温度进行水浴加热。反应液中的pHpH可以通过
135、可以通过体积分数为体积分数为0.1%0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。调节。( () )探究果胶酶的用量探究果胶酶的用量 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和度和pHpH对果胶酶活性影响的基础之上的。对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是此时，研究的变量是 ，其，其他因素都应他因素都应 。果胶酶的用量果胶酶的用量保持不变保持不变方案方案：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，后使用不同的体积
136、即可。需要注意的是，反应液的反应液的pH必须相同，否则将影响实验结必须相同，否则将影响实验结果的准确性。果的准确性。五、结果分析与评价五、结果分析与评价 根据实验数据绘制出的温度和根据实验数据绘制出的温度和pHpH对对果胶酶活性影响的曲线图；果胶酶活性影响的曲线图； 不同果胶酶用量对出汁量影响的曲不同果胶酶用量对出汁量影响的曲线图（在浓度和体积相同的条件下）；线图（在浓度和体积相同的条件下）； 果胶酶最适温度、果胶酶最适温度、pHpH以及果胶酶的以及果胶酶的最适用量。最适用量。六、本课题知识小结六、本课题知识小结（一）普通洗衣粉（一）普通洗衣粉一、基础知识一、基础知识表面活性剂，水软化剂，碱剂
137、，漂白剂等成分表面活性剂，水软化剂，碱剂，漂白剂等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂，香精和色素，有的洗衣粉中还含有增白剂，香精和色素，以以及填充剂等及填充剂等1 1、洗衣粉主要成分：、洗衣粉主要成分：作用：作用：洗衣粉的主要成分，优先吸附在各种界洗衣粉的主要成分，优先吸附在各种界面上，面上，降低水的表面张力，改变体系界面的状降低水的表面张力，改变体系界面的状态，去除衣物的污渍态，去除衣物的污渍表面活性剂表面活性剂种类：种类：阴离子、阳离子、非离子和两性离子等阴离子、阳离子、非离子和两性离子等四大类，四大类，但用于洗涤的表面活性剂则以但用于洗涤的表面活性剂则以阴离子阴离子和非离子和非离子为主为主一
138、般表面活性剂中含有疏水基团和亲水基团，在一般表面活性剂中含有疏水基团和亲水基团，在洗涤过程中其乳化作用和通透作用，是衣服中的洗涤过程中其乳化作用和通透作用，是衣服中的脂肪类物质进入水中脂肪类物质进入水中应用：表面活性剂有最普通、最传统的应用：表面活性剂有最普通、最传统的阴离子阴离子表面活性剂就是人类使用了几百年的表面活性剂就是人类使用了几百年的肥皂肥皂（高（高级脂肪酸钠）。合成洗涤工业问世之后，使用级脂肪酸钠）。合成洗涤工业问世之后，使用最普遍的是最普遍的是十二烷基苯磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠，非离子表面活非离子表面活性剂应用最广泛的是性剂应用最广泛的是聚氧乙烯醚类聚氧乙烯醚类应用：三聚磷酸钠广
139、泛应用于各种洗衣粉中，应用：三聚磷酸钠广泛应用于各种洗衣粉中，无磷洗衣粉中不含有三聚磷酸钠无磷洗衣粉中不含有三聚磷酸钠作用：作用：防止水中的钙、镁离子造成的阴离子表防止水中的钙、镁离子造成的阴离子表面活性剂失活，提高表面活性剂利用率面活性剂失活，提高表面活性剂利用率种类：种类：三聚磷酸钠三聚磷酸钠是最为常用的一种水软化剂，是最为常用的一种水软化剂，它具有它具有软化水质、分散污垢、缓冲碱剂及抗结块软化水质、分散污垢、缓冲碱剂及抗结块性能等特点性能等特点水软化剂水软化剂漂白剂：可漂白剂：可延缓衣物的泛黄延缓衣物的泛黄程度，但对衣物有程度，但对衣物有一定的损伤。一定的损伤。碱剂：碱剂：作用：作用：在
140、适当的碱度下，纤维和污垢可被最大在适当的碱度下，纤维和污垢可被最大限度地离子化，更易于污垢的水解和分散限度地离子化，更易于污垢的水解和分散应用：一般洗衣粉配方中都含有应用：一般洗衣粉配方中都含有纯碱和硅酸钠，纯碱和硅酸钠，其中硅酸钠还具有使污垢颗粒悬浮、防止再沉积其中硅酸钠还具有使污垢颗粒悬浮、防止再沉积的作用的作用增白剂增白剂香精和色素香精和色素丝、棉、毛类等天然纤维的浅色衣物容易变黄，丝、棉、毛类等天然纤维的浅色衣物容易变黄，加入增白剂后，它能够留存在衣物上，吸收阳加入增白剂后，它能够留存在衣物上，吸收阳光中的紫外线，反射出与黄光互补的蓝色光线，光中的紫外线，反射出与黄光互补的蓝色光线，从
141、而掩盖了衣物上的黄色。从而掩盖了衣物上的黄色。改善洗衣粉的气味和外观，给人清新愉悦的感改善洗衣粉的气味和外观，给人清新愉悦的感受，并掩盖某些化学成分的异味受，并掩盖某些化学成分的异味2 2、种类、种类洗衣粉含磷量洗衣粉含磷量无磷洗衣粉、含磷洗衣粉无磷洗衣粉、含磷洗衣粉含磷洗衣粉：以含磷洗衣粉：以磷酸盐磷酸盐为主要助洗剂的一类产品为主要助洗剂的一类产品助洗剂：助洗剂：结合钙镁离子，阻止污垢再沉积，有结合钙镁离子，阻止污垢再沉积，有助于提高表面活性剂的去污能力助于提高表面活性剂的去污能力磷：磷：一种营养元素，易造成水体富营养化，从而一种营养元素，易造成水体富营养化，从而破坏水质，污染环境破坏水质，
142、污染环境无磷洗衣粉：无磷洗衣粉：不用磷酸盐不用磷酸盐作助洗剂的一类产品，作助洗剂的一类产品，无水质富营养化这一特点，有利于水体环境保护无水质富营养化这一特点，有利于水体环境保护洗涤效果洗涤效果普通洗衣粉、浓缩洗衣粉普通洗衣粉、浓缩洗衣粉普通、浓缩洗衣粉的特点普通、浓缩洗衣粉的特点普通洗衣粉：普通洗衣粉：颗粒大而疏松，溶解性好，泡颗粒大而疏松，溶解性好，泡沫较为丰富，但去污力相对较弱，不易漂洗，沫较为丰富，但去污力相对较弱，不易漂洗，一般适用于手洗一般适用于手洗浓缩洗衣粉：浓缩洗衣粉：颗粒小，密度大，泡沫较少，颗粒小，密度大，泡沫较少，但去污力至少是普通洗衣粉的两倍，易于清但去污力至少是普通洗衣
143、粉的两倍，易于清洗，节约水，一般适用于机洗洗，节约水，一般适用于机洗1 1、定义：、定义：（二）加酶洗衣粉（二）加酶洗衣粉含有酶制剂的洗衣粉含有酶制剂的洗衣粉2 2、成分、成分除含有普通洗衣粉的成分外，还含有多种酶除含有普通洗衣粉的成分外，还含有多种酶制剂：制剂：蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，复合酶复合酶蛋白酶：蛋白酶：应用：有助于取出例如汗渍，血渍，青草，应用：有助于取出例如汗渍，血渍，青草，粘液，粪便以及各种食品类的蛋白质污垢粘液，粪便以及各种食品类的蛋白质污垢作用：作用：碱性蛋白酶能使蛋白质水解成可溶于水碱性蛋白酶能使蛋白质水解成可溶于水的多肽和氨基
144、酸的多肽和氨基酸种类：我国在洗衣粉中添加的酶最主要的是种类：我国在洗衣粉中添加的酶最主要的是碱碱性蛋白酶性蛋白酶产生：主要产生菌是某些产生：主要产生菌是某些芽孢杆菌芽孢杆菌脂肪酶脂肪酶应用：可以催化水解各类动植物油脂和人体皮应用：可以催化水解各类动植物油脂和人体皮脂腺分泌物及化妆品污垢，脂腺分泌物及化妆品污垢，种类：种类：碱性脂肪酶碱性脂肪酶作用：作用：碱性脂肪酶能使甘油三脂水解成容易用碱性脂肪酶能使甘油三脂水解成容易用水冲洗掉的甘油二脂、甘油单脂和游离脂肪酸。水冲洗掉的甘油二脂、甘油单脂和游离脂肪酸。从而达到清除衣物上脂质污垢的作用从而达到清除衣物上脂质污垢的作用产生：产生菌是某些产生：产生
145、菌是某些青霉青霉脂肪脂肪 甘油甘油 + + 脂肪酸脂肪酸脂肪酶脂肪酶方程式：方程式：淀粉酶淀粉酶应用：可以去除例如来自面条、巧克力、肉汁应用：可以去除例如来自面条、巧克力、肉汁和婴儿食品中含有淀粉的污垢和婴儿食品中含有淀粉的污垢作用：作用：水解直链淀粉中的水解直链淀粉中的1 1，4 4a a糖苷键，糖苷键，使糊化淀粉迅速分解为可溶解的糊精和低聚糖使糊化淀粉迅速分解为可溶解的糊精和低聚糖淀粉淀粉 麦麦芽糖芽糖淀粉酶淀粉酶方程式：方程式：纤维素酶纤维素酶应用：去除棉纺织品表面的浮毛，使洗涤后的应用：去除棉纺织品表面的浮毛，使洗涤后的棉纺织品柔软蓬松，织纹清晰，色泽更加鲜艳，棉纺织品柔软蓬松，织纹清
146、晰，色泽更加鲜艳，穿着更加舒适穿着更加舒适作用：作用：碱性纤维素酶本身不能去除衣物上的污碱性纤维素酶本身不能去除衣物上的污垢，它的作用是使纤维的结构变得蓬松，从而垢，它的作用是使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深层的尘土和污垢能够与洗衣粉使渗入到纤维深层的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，从而达到更好的去污效果充分接触，从而达到更好的去污效果种类：种类：碱性纤维素酶碱性纤维素酶纤维素纤维素 葡萄糖葡萄糖纤维素酶纤维素酶方程式：方程式：复合酶复合酶实际污垢组成复杂，实际污垢组成复杂，往往蛋白污垢被脂肪污垢往往蛋白污垢被脂肪污垢或淀粉污垢覆盖，或淀粉污垢覆盖，单一酶的作用一般达不到彻单一酶的作用
147、一般达不到彻底清除污垢的作用。底清除污垢的作用。而复合酶可以发挥其独特而复合酶可以发挥其独特的的“协同效应协同效应”。试验测定，单独使用蛋白酶或淀粉酶，得到的试验测定，单独使用蛋白酶或淀粉酶，得到的洗涤效果远不如把每种酶用量减半后放在一起洗涤效果远不如把每种酶用量减半后放在一起使用的效果。即给定酶的用量，复合酶的效果使用的效果。即给定酶的用量，复合酶的效果远远超过单一酶的效果。原因是淀粉酶分解了远远超过单一酶的效果。原因是淀粉酶分解了污渍表面的淀粉污垢，使蛋白酶能以更有效的污渍表面的淀粉污垢，使蛋白酶能以更有效的方式向蛋白质污垢进攻。方式向蛋白质污垢进攻。 （三）普通洗衣粉和加酶洗衣粉异同（三
148、）普通洗衣粉和加酶洗衣粉异同相同点：相同点：不同点：不同点：表面活性剂可以产生泡沫，可以将表面活性剂可以产生泡沫，可以将油脂分子分散开；水软化剂可以分油脂分子分散开；水软化剂可以分散污垢；等等散污垢；等等酶可以将大分子有机物分解为小分酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易于溶于子有机物，小分子有机物易于溶于水，从而与纤维分开水，从而与纤维分开（四）（四）影响酶活性的因素影响酶活性的因素 温度、温度、pHpH等等成分：略成分：略用法：洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的用法：洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的水内数小时，用温水浸泡效果更佳水内数小时，用温水浸泡效果更佳, ,切勿用切
149、勿用6060以上的水以上的水. .注意：切勿用于丝质及羊毛衣料，用后须彻底注意：切勿用于丝质及羊毛衣料，用后须彻底清洗双手。清洗双手。( (五）资料分析五）资料分析一般洗衣粉不易清除衣物的血渍和奶渍，但加一般洗衣粉不易清除衣物的血渍和奶渍，但加酶洗衣粉则可以。酶洗衣粉则可以。 一生物活性洗衣粉包装盒上一生物活性洗衣粉包装盒上印有以下材料：印有以下材料：二、实验设计二、实验设计（一）（一）子课题一：子课题一：探究普通洗衣粉和加酶洗衣探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果粉对衣物污渍的洗涤效果1 1、实验原理、实验原理生活中的各种污渍主要是蛋白质、脂质、淀粉生活中的各种污渍主要是蛋白质、脂
150、质、淀粉等多种不溶于水的有机物，这些有机物能在相等多种不溶于水的有机物，这些有机物能在相应的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的作用下水解成应的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的作用下水解成易溶于水的小分子有机物易溶于水的小分子有机物2 2、遵循原则、遵循原则实验变量为洗涤剂，设计时应遵循单一变量原则、实验变量为洗涤剂，设计时应遵循单一变量原则、对照性原则有效的控制其他变量，如水的用量、对照性原则有效的控制其他变量，如水的用量、污染物的量，所用实验用布的质地大小、两种洗污染物的量，所用实验用布的质地大小、两种洗衣粉的用量，搅拌及洗涤时间，衣粉的用量，搅拌及洗涤时间，3 3、实验操作流程、实验操作流程（1 1）实验准
151、备）实验准备带有污染物的实验用布的制取：取一定量的污带有污染物的实验用布的制取：取一定量的污染物制成溶液，取等量的污染物滴加在相同大染物制成溶液，取等量的污染物滴加在相同大小、质地的新布上小、质地的新布上称取等量的洗衣粉：用天平准确称取等量普通称取等量的洗衣粉：用天平准确称取等量普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗衣粉和加酶洗衣粉（2 2）实验过程）实验过程取两只大烧杯并编号，用量筒分别量取两只大烧杯并编号，用量筒分别量500500mlml蒸馏水放入其中。放入蒸馏水放入其中。放入40400 0C C的的水浴锅保温。水浴锅保温。将制好的污染布和洗衣粉（一组为污染布将制好的污染布和洗衣粉（一组为污染布和普通洗
152、衣粉，另一组为污染布和加酶洗衣和普通洗衣粉，另一组为污染布和加酶洗衣粉）分别放入两只烧杯中。粉）分别放入两只烧杯中。用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时间后搅拌可重复进行。间后搅拌可重复进行。过相同的时间后观察洗涤效果。过相同的时间后观察洗涤效果。（3 3）实验结论）实验结论 加酶洗衣粉的效果好加酶洗衣粉的效果好1 1、分析资料二、分析资料二温度梯度设置并不恰当和完善，主要是梯度差温度梯度设置并不恰当和完善，主要是梯度差值偏大。在达到最适温度之前提高温度，可以值偏大。在达到最适温度之前提高温度，可以增加酶促反应的速度，每提高反应温度增加酶促反应的速度，每提高
153、反应温度1010度，度，所增加的反应速度称为反应的温度系数，对于所增加的反应速度称为反应的温度系数，对于许多酶来说，这个系数为许多酶来说，这个系数为1 12 2，也就是每增高，也就是每增高1010度，酶反应速度增加度，酶反应速度增加1 12 2倍，假定用上述梯倍，假定用上述梯度测得度测得4040度时洗涤效果最好，但并不能说最适度时洗涤效果最好，但并不能说最适温度就是温度就是4040度度结论结论（二）探究加酶洗衣粉使用时的最适温度（二）探究加酶洗衣粉使用时的最适温度改进改进制取同样的污染布，称取等量的同一种洗衣粉，制取同样的污染布，称取等量的同一种洗衣粉，分几个温度不同的试验组，温度梯度可设为分
154、几个温度不同的试验组，温度梯度可设为2020、2525、3030、3535、4040、4545、5050、5555度，若测出在度，若测出在4040度时洗涤效果最好，可设置更细的试验组如度时洗涤效果最好，可设置更细的试验组如3535、3636、3737、3838、3939、4040、4141、4242、4343、4444、4545度，度，直至测出具体的最适温度直至测出具体的最适温度实验原理实验原理酶的活性受温度的影响，最适温度时酶的活酶的活性受温度的影响，最适温度时酶的活性最大，去污力最强，高于或低于此温度酶性最大，去污力最强，高于或低于此温度酶的活性降低，去污力下降的活性降低，去污力下降洗涤效
155、果的判断洗涤效果的判断可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积缩小等，最好能进行定量的比颜色变浅、面积缩小等，最好能进行定量的比较较2 2、实验设计、实验设计材料器具：材料器具：加酶洗衣粉、鸡血、新白棉布、蒸馏水、烧加酶洗衣粉、鸡血、新白棉布、蒸馏水、烧杯、滴管、温度计、恒温水浴锅、玻璃棒、杯、滴管、温度计、恒温水浴锅、玻璃棒、量筒、直尺、天平等量筒、直尺、天平等实验步骤实验步骤实验准备实验准备（1 1）制取带有污物的实验用布制取带有污物的实验用布将等量的鸡血滴到将等量的鸡血滴到7 7块大小相同的、质地相同块大小相同的、质地相同的新布上
156、的新布上（2 2）称取称取1 1g g加酶洗衣粉：用天平准确的称取加酶洗衣粉：用天平准确的称取等量的同种加酶洗衣粉等量的同种加酶洗衣粉（1 1）配制系列温度梯度水溶液）配制系列温度梯度水溶液 取大烧杯取大烧杯7 7只，用量筒量取只，用量筒量取500500mlml的蒸馏水放的蒸馏水放入其中。然后将入其中。然后将7 7只烧杯分别放入只烧杯分别放入25250 0C C、30300 0C C、35350 0C C、40400 0C C、45450 0C C、50500 0C C、55550 0C C的恒温水箱加热。的恒温水箱加热。（2 2）将制好的污染布和称好的洗衣粉分别放入）将制好的污染布和称好的洗
157、衣粉分别放入7 7只烧杯中。只烧杯中。（3 3）用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时）用玻璃棒同时充分搅拌一段时间。一段时间后搅拌可重复进行，持续保持各自的温度。间后搅拌可重复进行，持续保持各自的温度。（4 4）过相同的时间后观察洗涤效果）过相同的时间后观察洗涤效果实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同基本相
158、同实验遵循的原则：实验遵循的原则：单因子变量的原则和对照原则单因子变量的原则和对照原则（三）（三）子课题三：子课题三：不同种类的加酶洗衣粉的洗不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果涤效果1 1、实验原理、实验原理不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有专一性，所以对不同污渍洗涤效果不同具有专一性，所以对不同污渍洗涤效果不同2 2、实验步骤、实验步骤取取3030块大小相同的白棉布，分成块大小相同的白棉布，分成6 6组，每组组，每组5 5块，依次编号块，依次编号1 1a a、1b1b、1c1c、1d1d、1e1e、2a2a、2b2b6a6a、6b6b、6c6c、6d
159、6d、6e6e。（a a为蛋白酶处理组，为蛋白酶处理组，b b为脂肪酶处理组，为脂肪酶处理组，c c为淀粉为淀粉处理组，处理组，d d为复合酶处理组，为复合酶处理组，e e为普通洗衣粉组为普通洗衣粉组) )制取带有污染物的实验用布制取带有污染物的实验用布给给第一组白布滴加鸡血，待血渍扩散停止后，第一组白布滴加鸡血，待血渍扩散停止后，记录血渍面积记录血渍面积按同样的方法给第按同样的方法给第2 26 6组分别滴加牛奶、菜组分别滴加牛奶、菜油、番茄汁、墨水、颜料，并记录污渍面积油、番茄汁、墨水、颜料，并记录污渍面积将上述白棉布分别放入将上述白棉布分别放入3030个已编号的个已编号的烧杯中，各注入烧杯
160、中，各注入500500mlml蒸馏水，用玻璃棒蒸馏水，用玻璃棒搅拌使白棉布湿透搅拌使白棉布湿透温度控制温度控制烧杯均放入温度为烧杯均放入温度为4545度的水浴锅度的水浴锅洗衣粉洗涤洗衣粉洗涤给给1 1a a6a6a号烧杯中加入等量的蛋白酶洗衣粉，号烧杯中加入等量的蛋白酶洗衣粉，给给1 1b b6b6b号烧杯中加入等量的脂肪酶洗衣粉，号烧杯中加入等量的脂肪酶洗衣粉，给给1 1c c6c6c号烧杯中加入等量的淀粉酶洗衣粉，号烧杯中加入等量的淀粉酶洗衣粉，给给1 1d d6d6d号烧杯中加入等量的复合酶洗衣粉，号烧杯中加入等量的复合酶洗衣粉，给给1 1e e6e6e号烧杯中加入等量的普通酶洗衣粉，号
161、烧杯中加入等量的普通酶洗衣粉，各烧杯均搅拌洗涤各烧杯均搅拌洗涤1010分钟后，用清水漂洗分钟后，用清水漂洗3 3次，次，晾干晾干（6 6）记录结果：将实验结果记入下表。）记录结果：将实验结果记入下表。3 3、实验结论：、实验结论：编编编编号号号号123456污渍类型污渍类型污渍类型污渍类型鸡血鸡血牛奶牛奶牛奶牛奶菜油菜油菜油菜油番茄汁番茄汁番茄汁番茄汁墨水墨水墨水墨水染料染料染料染料洗涤效果洗涤效果洗涤效果洗涤效果蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶脂肪酶脂肪酶脂肪酶脂肪酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶复合酶复合酶复合酶复合酶普通洗衣粉普通洗衣粉普通洗衣粉普通洗衣粉温故知新温故知新：1 1、洗衣粉中添加洗衣粉中
162、添加_，可以可以更有效地清除顽渍。常用的酶制剂更有效地清除顽渍。常用的酶制剂有有_四类四类。2 2、影响酶活性的因素有影响酶活性的因素有_、_和和_。酶制剂的优点：酶制剂的优点： 催化效率高、低耗能、低污染，催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个大规模地应用于食品、化工等各个领域。领域。酶制剂存在的缺陷：酶制剂存在的缺陷： 1 1、通常对通常对强酸强酸、强碱、高温和强碱、高温和有机溶剂有机溶剂等条件非常敏感，容易失等条件非常敏感，容易失活；活； 2 2、溶液中的酶很难回收，不能、溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；被再次利用，提高了生产成本； 3 3、反应后
163、会混在产物中，可能、反应后会混在产物中，可能影响产品质量。影响产品质量。如果你是工程技术人员，你如果你是工程技术人员，你如何解决这个问题如何解决这个问题？固定化酶技术固定化酶技术 阅读阅读P49-50P49-50，并思考：并思考：1 1、解决酶应用中存在问题的方法是？、解决酶应用中存在问题的方法是？2 2、什么是高果糖浆？使用它有何好处、什么是高果糖浆？使用它有何好处？3 3、生产高果糖浆需要什么酶？其作用、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？是什么？这种酶有何特点？4 4、了解高果糖浆生产过程。、了解高果糖浆生产过程。5 5、这种方法的优点是什么？、这种方法的优点是什么？一
164、、固定化酶的应用实例一、固定化酶的应用实例1 1、固定化酶技术。即将酶固定在、固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。于水的载体上）。1、解决酶应用中存在问题的方法是？、解决酶应用中存在问题的方法是？2 2、高果糖浆是果糖含量为、高果糖浆是果糖含量为42%42%左右左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。康有利。你能写出果糖的分子式吗你能写出果糖的分子式吗? ?它属于什么糖它属于什么
165、糖? ?2、什么是高果糖浆？使用它有何好处？、什么是高果糖浆？使用它有何好处？3 3、生产高果糖浆需要、生产高果糖浆需要葡萄糖异构葡萄糖异构酶酶；其作用是将葡萄糖转化为果；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。挥作用。3、生产高果糖浆需要什么酶？其作用、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？是什么？这种酶有何特点？4 4、固定化酶技术生产高果糖浆的过程：、固定化酶技术生产高果糖浆的过程：注意反应柱的注意反应柱的各部分名称。各部分名称。你能说出反应你能说出反应柱的优点吗？柱的优点吗？5 5、固定化酶技术的优点：、固定化酶技术的优点
166、：（1 1）使酶既能与反应物接触，又使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；能与产物分离；（2 2）固定在载体上的酶可以被反）固定在载体上的酶可以被反复利用。复利用。5、这种方法的优点是什么？、这种方法的优点是什么？ 在生产实际中使用固定化酶技在生产实际中使用固定化酶技术的不足：术的不足：一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。所以操作比较麻烦。怎么办怎么办?可采用固定化细胞技术。可采用固定化细胞技术。二、固定化细胞技术二、固定化细胞技术1 1
167、、概念：、概念：利用物理或化学方法将细胞固利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间的技术。定在一定空间的技术。细胞中含有一系列酶，在细胞细胞中含有一系列酶，在细胞正常生命活动的过程中，通过正常生命活动的过程中，通过代谢产生所需要的代谢产物。代谢产生所需要的代谢产物。阅读阅读P50P50：思考第二段的问题思考第二段的问题2.2.将酶或细胞固定化的方法将酶或细胞固定化的方法将酶（或细胞）包将酶（或细胞）包埋在细微网格里埋在细微网格里将酶（或细胞）将酶（或细胞）相互连接起来相互连接起来将酶（或细胞）吸将酶（或细胞）吸附在载体表面上附在载体表面上包埋法包埋法化学结合法化学结合法物理吸附法物理吸附法酶和细
168、胞固定方法的选择酶和细胞固定方法的选择酶适合采用化学结合和物酶适合采用化学结合和物理吸附法固定理吸附法固定细胞适合采用包埋法固定细胞适合采用包埋法固定（1 1）、方法）、方法（2 2）、原因）、原因细胞个大，酶分子很小细胞个大，酶分子很小个体大的细胞难以被吸附或结合而个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出个小的酶容易从包埋的材料中漏出3 3、固定化细胞常用的载体、固定化细胞常用的载体常用的不溶于水的多孔性载体常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？有哪些？明胶、琼脂糖、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等 如果反应底物是大分如果反应
169、底物是大分子物质，能否用固定化细子物质，能否用固定化细胞技术胞技术? ? 为什么？为什么？ 那应该采用何种技术那应该采用何种技术? ?三、实验操作三、实验操作（一）制备固定化酵母细胞（一）制备固定化酵母细胞阅读阅读P50P50 5151思考下列问题：思考下列问题：（1 1）制备过程包括哪几个步骤？）制备过程包括哪几个步骤？（2 2）你认为哪个步骤的操作是最）你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？重要的一环？1 1、酵母细胞的活化、酵母细胞的活化思考：思考：关于酵母菌你有哪些知识？关于酵母菌你有哪些知识？什么是活化？什么是活化？怎样活化？怎样活化？应注意什么？应注意什么？活化：活化：让处于休眠状态
170、的微生物重让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态；新恢复正常的生活状态；本质：本质：加快新陈代谢；加快新陈代谢；方法：方法：加入适量的水。加入适量的水。取取1g1g干酵母，放干酵母，放入入50ml50ml的小烧杯的小烧杯中，加入蒸馏水中，加入蒸馏水10ml10ml，用玻璃棒用玻璃棒搅拌，使酵母细搅拌，使酵母细胞混合均匀，成胞混合均匀，成糊状，放置糊状，放置1h1h左左右使其活化右使其活化思考：思考：你认为酵母的活化操作有你认为酵母的活化操作有哪些注意事项？哪些注意事项？1 1、所用容器要大一些；、所用容器要大一些；2 2、要保证酵母菌的活性；、要保证酵母菌的活性；2 2、配制物质的量浓度
171、为、配制物质的量浓度为0.05mol/L0.05mol/L的的CaClCaCl2 2溶液溶液称取无水称取无水CaClCaCl2 2 0.83g 0.83g。放入放入200mL200mL的烧杯中，加入的烧杯中，加入150mL150mL的蒸的蒸馏水，使其充分溶解，待用。馏水，使其充分溶解，待用。3 3、配制海藻酸钠溶液、配制海藻酸钠溶液操作：操作： 称取称取0.7g0.7g海藻酸钠，放入海藻酸钠，放入50mL50mL小烧杯中小烧杯中. .加人加人10mL10mL水，用酒精灯加水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水成糊状，直至完全溶化
172、，用蒸馏水定容至定容至10mL10mL。注意，注意，加热时要用小加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止到海藻酸钠溶化为止加热使海藻酸钠溶化是操作中加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要最重要的一环，涉及到实验的成败，的一环，涉及到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。一定要按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，
173、影响实验效果。数目少，影响实验效果。应当注意什么问题？应当注意什么问题？4 4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 将溶化好的海藻酸钠溶液冷将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的醉母细却至室温，加入已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。匀，再转移至注射器中。为什么海藻酸钠溶液要冷却为什么海藻酸钠溶液要冷却？5 5、固定化酵母细胞、固定化酵母细胞 以以恒定的速度缓慢地恒定的速度缓慢地将注射将注射器中的溶液器中的溶液滴加滴加到配制好的到配制好的CaClCaCl2 2溶液中，观察液滴在溶液中，观察液滴在CaClCaCl
174、2 2溶溶液中形成凝胶珠的情形。将这些液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中溶液中浸泡浸泡30 30 minmin左右。左右。 刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：使用下列方法： 一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。作成
175、功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。的凝胶珠是成功的。这一阶段成功与否呢？怎样评价？这一阶段成功与否呢？怎样评价？观察凝胶珠的颜色和形状观察凝胶珠的颜色和形状:如果制作的凝胶珠如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白颜色过浅、呈白色色，说明海藻酸钠的浓度，说明海藻酸钠的浓度偏低偏低，固，固定的酵母细胞数目定的酵母细胞数目较少较少；如果形成；如果形成的凝胶珠的凝胶珠不是圆形或椭圆形不是圆形或椭圆形，则说，则说明海藻酸钠的浓度偏明海藻酸钠的浓度偏高高，制作失败，制作失败，需要再作尝试。需要再作
176、尝试。（二）用固定化细胞发酵（二）用固定化细胞发酵1 1、将固定好的酵母细胞、将固定好的酵母细胞( (凝胶凝胶珠珠) )用蒸馏水冲洗用蒸馏水冲洗2-32-3次。次。 2 2、 将将150mL150mL质量分数为质量分数为10%10%的的葡萄糖溶液转移到葡萄糖溶液转移到200mL200mL的锥形的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于胞，置于2525下发酵下发酵24h24h。这一阶段成功与否呢？怎这一阶段成功与否呢？怎样评价？样评价？观察发酵的葡萄糖溶液；观察发酵的葡萄糖溶液；利用固定的酵母细胞发酵产生利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气酒精，可以看到产
177、生了很多气泡，同时会闻到酒味。泡，同时会闻到酒味。还有其他方法吗？还有其他方法吗？类型类型优点优点不足不足直直接接使使用用酶酶催化效率高，低耗催化效率高，低耗能、低污染等。能、低污染等。对环境条件非常敏感，容对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影酶会混在产物中，可能影响产品质量。响产品质量。固固定定化化酶酶酶既能与反应物接酶既能与反应物接触，又能与产物分触，又能与产物分离，同时，固定在离，同时，固定在载体上的酶还可以载体上的酶还可以被反复利用。被反复利用。一
178、种酶只能催化一种化学一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到系列的酶促反应才能得到的。的。固固定定化化细细胞胞成本低，操成本低，操作更容易。作更容易。固定后的酶或细胞与固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，反应物不容易接近，可能导致反应效果下可能导致反应效果下降等。降等。类类型型优点优点不足不足DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 目的要求目的要求1 1、了解从细胞中提取、了解从细胞中提取DNADNA的基本原的基本原理理2 2、初步掌握、初步掌握DNADNA的粗提取和鉴定的的粗提取和鉴定的方法方法3
179、3、观察提取出来的、观察提取出来的DNADNA实验思路实验思路1、DNA从哪提取？从哪提取？2、怎样将、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？与细胞中的其他物质分离？3、怎样鉴定我们提取的、怎样鉴定我们提取的DNA？实验原理实验原理1. DNA1. DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的浓度的变化而改变的。当的浓度的变化而改变的。当NaClNaCl的物的物质的量浓度为质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解的溶解度最低。度最低。利用这一原理，可以使溶解在利用这一原理，可以使溶解在NaClNaCl溶液中的溶液中的
180、DNADNA析出。析出。2.DNA2.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的可以进一步提取出含杂质较少的DNADNA。3.DNA3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因，因此，二苯胺可以作为鉴定此，二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。实验用具：实验用具：铁架台；铁环；镊子；三铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml10
181、0ml，一，一个）；烧杯；（个）；烧杯；（100ml100ml，一个，一个，50ml50ml、500ml500ml各二个）；试管（各二个）；试管（20ml20ml，二个）；，二个）；漏斗；试管夹；纱布。漏斗；试管夹；纱布。 二、二、DNADNA的粗提取与鉴定的实验设计的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 材料：新鲜的鸡血材料：新鲜的鸡血注意：注意： 本实验中，本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬柠檬酸钠溶液酸钠溶液）原则上只要含原则上只要含DNADNA的生物材料都可以，但是的生物材料都可以，但是选取选取DNADNA含量相对较高的生物组织，成功率含
182、量相对较高的生物组织，成功率更大。更大。(1)(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、破碎细胞、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 利用了什么原理？利用了什么原理？2 2、过滤，获取含、过滤，获取含DNADNA的滤液的滤液讨论：为什么反复地溶解与析出讨论：为什么反复地溶解与析出DNADNA，
183、能够去能够去除杂质除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出溶解与析出DNADNA，就能够除去与就能够除去与DNADNA溶解度不同的溶解度不同的多种杂质多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三利用
184、的是与蛋白质分开；方案三利用的是DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与质变性，与DNADNA分离分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNADNA的稳定性。的稳定性。（四）（四） DNADNA的的析出与鉴定析出与鉴定DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精冷却的酒精溶液（体积分数为溶液（体积分数为9595），静置，静置2-3min2-3min，溶液溶液中会出现中会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用玻用玻璃棒沿璃棒沿一个方向一
185、个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出2 2、 DNADNA的鉴定的鉴定鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，其中一只于两只试管中，其中一只加入加入DNADNA丝状物，各加入丝状物，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。混合试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热均匀后，将试管置于沸水中加热5min,5min,待试管冷待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶却后，比较两只试管中溶液颜
186、色的变化，看看溶解有解有DNADNA的溶液是否有的溶液是否有蓝色蓝色小结小结1、DNA的粗提取与鉴定的方法的粗提取与鉴定的方法2、原理、原理3、实验设计的步骤，原则、实验设计的步骤，原则作业作业尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这个实验。个实验。专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是
187、在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯( ( ( (K K K K. . . .B B B B. . . .M M M Mu u u ul l l ll l l li i i is s s s) ) ) )发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 .DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P
188、P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位: :一一. .基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOHOHOH”和和和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分
189、子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在即在即在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3 3 3、5 5 5 5、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸
190、二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNADNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端称为末端称为末端称为末端称为3 3 3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5 5 5端端端端3.3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱氧）脱氧
191、核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。. . 与与 交替连结，排列在外侧，交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；构成基本骨架； 排列在链的内侧。排列在链的内侧。. .两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来，形连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对，配对， 一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤.DNA.DNA的复制的复制2.2.时期时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期减
192、数第一次分裂前的间期。3.3.场所场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.1.概念概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。4.4.基本条件基本条件酶酶: :解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料: :四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链. .边解旋边复制边解旋边复制( (过程）过程）5.5.复制特点复制特点. .半保留复制（结果）半保留复制（结果）6.6.遵循原则：遵循原则：碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因8.
193、8.复制的意义复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性代，从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶
194、聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：胞内总结：胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸. .PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶
195、链式反应）2.DNA2.DNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从只能从DNADNA的的33端开始延端开始延伸伸DNADNA链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3.DNA3.DNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的的合成方向合成方向总是从子链的总是从子链的55端向端向33端延端延伸。伸。1.1.定义：定义：是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的
196、技术。能以极片段的技术。能以极少量的少量的DNADNA为模板，在几小时内复制出上百万为模板，在几小时内复制出上百万份的份的DNADNA拷贝。拷贝。4.PCR4.PCR原理原理. .在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的的双螺旋结双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。构将解体，双链分开，这个过程称为变性。. .当温度缓慢降低后，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。.PCR.PCR利用了利用了DNADNA的的热变性原理，通过控制温度热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来
197、控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪仪实实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNADNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的
198、问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCRPCRPCR技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。5.Taq DNA5.Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用6.6.需要为需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质缓冲液缓冲液、DNADNA模板，分别与两条模板链相结合模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚聚合酶，同时通过控制温度使合酶，同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复制在体外反复进行。复进行。PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起
199、来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出。简便、重复性好、易自动化等突出。7.PCR7.PCR技术的特点：技术的特点：8.8.细胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制PCRPCR模板模板模板模板( ( ( (母链母链母链母链) ) ) )引物引物引物引物原料原料原料原料: : : :dNTPdNTPdNTPdNTP聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶反应环境反应环境反应环境反应环境细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源引物合成酶引物合成酶引物合成酶引物合成酶细胞内的环
200、境细胞内的环境细胞内的环境细胞内的环境细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源外源加入外源加入外源加入外源加入缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入.PCR.PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合而是人工合成的成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核个脱氧核苷酸苷酸9.9.细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点.PCR.PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控
201、制来实现的过对反应温度的控制来实现的10.PCR10.PCR的重要应用：的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。1 1、PCRPCR仪仪. .设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头其
202、上的一次性吸液枪头用一次更换一次。用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液. .实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。用手指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心离心约约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离
203、心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环仪的循环程序。程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494，10min10min10min10min30303030次次次次94949494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min5555555
204、5，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1minPCRPCR一般经历一般经历三十多次三十多次循环，每次循环可以分循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸. . .变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使以上。一定时间后，使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。应作准备。. .复性（退火）复性（退火
205、）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左左右，引物与模板右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合。单链的互补序列配对结合。. .延伸延伸DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的一条新的DNADNA链。链。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性靶序
206、列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序
207、列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6.6.注意事项注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头. .理论上理论上DNADNA扩增数目的计
208、算扩增数目的计算三三. .课题成果评价课题成果评价1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a a2 2n n. .实验中实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与收峰，峰值的大小与DNADNA的的含量有关。含量有关。2.2.过程过程. .稀释稀释 2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，
209、加入98uL98uL蒸馏水，即蒸馏水，即将样品进行将样品进行5050倍稀释倍稀释. . .对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零。紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至至比色杯中，测定比色杯中，测定260nm260nm处处的光的光吸收值吸收值. .计算计算. .计算计算DNADNA含量含量( ( g g) )5050(260nm(260nm的读数的读数) )稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g /ml /ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色
210、杯中的吸比色杯中的吸光值为光值为0.020.02光光吸吸收收波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.2比色杯比色杯四四. .课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。增技术。 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快快速、速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点简便、重复性好、易自动化等突出特点五五. .实
211、验小结实验小结PCRPCR仪仪加加热热使使（ ）变变性性, , 复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（ ）, ,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温( ( ),),在在（ ）的的作作用用下下, ,以以 （ ）为为原原料料, ,以以（ ）为为复复制制的的起起点点, ,合合成成新新链链。 如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度, ,经经（ ）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环, ,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍, ,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环, ,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍; ;
212、将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳, ,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色, ,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能见到扩增特异区段的能见到扩增特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小
213、多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路
214、径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理4 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用
215、的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（ ）对溶液）对溶液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的缓冲液。使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3磷
216、酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察(红色红色)和科学研究其和科学研究其(活性活性)4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？（三）（三） 电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相
217、反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。3.3.类型类型: :琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳
218、示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。（2 2
219、）原理：）原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽由几条肽链组成的链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单单条肽链的分子量条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形能与各种蛋白质形成成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子量大大超过了蛋白质分子原有电荷量原有电荷量。因因而掩盖了而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。电泳迁移率完全取决于分子的大小。（
220、3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理: : 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电
221、泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一一一一肽链肽链肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁
222、红素基团四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？血液有哪些成分？2. 2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速
223、短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍体积生理盐水体积生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明得到红色透明液体。液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。二、实验操作：二、实验操作：
224、样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物暗红色沉淀物透析过程动画演示透析过程动画演示（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作-纯化纯化1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱2 2、凝胶
225、色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填步步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色色谱柱垂直固定在支架上柱垂直固定在支架上计算称量凝算称量凝胶胶根据色根据色谱柱体柱体积计算凝胶用量算凝胶用量配制配制悬浮液浮液凝胶凝胶颗粒蒸粒蒸馏水水充分溶充分溶胀凝胶凝胶颗粒洗脱液粒洗脱液沸水浴沸水浴装填装填悬浮液浮液一次性一次性缓慢倒入；慢倒入；轻轻敲打敲打缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸立刻用磷酸缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡12h12h装配好的凝胶柱3 3、样品加入与洗脱、样品加入与洗脱-调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样品品品品调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓
226、冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质（1 1）调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。（2 2）滴加透析样品：）滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝破坏凝胶面。胶面。（3 3）样品渗入凝胶床：）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等
227、样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。（4 4）洗脱：）洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。（5 5）收集：）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一
228、致的移动，说明色谱柱制作成功）（6 6）注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。目的：目的：目的：目的：血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶
229、液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。四、实验结果分析与评价四、实验结果分
230、析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝
231、色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱
232、、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？效果？效果？效果？四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价本课题作业本课题作业本课题
233、作业本课题作业; ; ; ;1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? ?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液? ?它的作用是什么它的作用是什么? ?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么? ?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? ?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比, ,红细胞有什么特点红细胞有什么特点? ?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义? ?（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量凝胶量（2）凝胶溶胀：
234、）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液胀后，配成凝胶悬浮液（3）固定：固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置固定在支架上（4）装填：装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。（5）洗涤平衡：）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH为为7.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡12小时小时。装填时装填时注意：注意：
235、1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时注意：注意：注意：注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒
236、的现象。2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填4 4、用、用SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定蛋白质的分子量时，可选用一组蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子已知分子量的标准蛋白量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以，可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。试剂出售。
