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1、AD以及行为学AD水迷宫、高架十字迷宫、筑巢行为等1 1研究背景研究背景2模型建立模型建立3行为学研究行为学研究 Outline2 阿尔茨海默症阿尔茨海默症(Alzheimer disease(Alzheimer disease，AD)AD)是发生在老年期或老是发生在老年期或老年前期的一种中枢神经系统退行性疾病，以神经细胞内神经纤维缠结年前期的一种中枢神经系统退行性疾病，以神经细胞内神经纤维缠结(nervefiber tangles(nervefiber tangles，NFT)NFT)和细胞外老年斑和细胞外老年斑(senile plaques(senile plaques，SP)SP)以及大
2、量神以及大量神经元丢失为主要神经病理特征经元丢失为主要神经病理特征。 临床表现1 1、进行性精神状态衰变；、进行性精神状态衰变；2 2、记忆、智力、定向、判断、记忆、智力、定向、判断能力、情感障碍和行为失常甚能力、情感障碍和行为失常甚至发生意识模糊等；至发生意识模糊等；3 3、患者通常在发病后、患者通常在发病后5 56 6年年内死于继发感染和全身衰竭内死于继发感染和全身衰竭。 Background3 Alois Alzheimer（1864-1915）Identified the first published case of Alzheimers disease.Auguste Deter（
3、1850-1906）The first person diagnosed with Alzheimers disease Background4 By 2006, there were 26.6 million sufferers worldwide. Alzheimers is predicted to affect 1 in 85 people globally by 2050. Background5 A brain without the diseaseA brain with advanced Alzheimers disease Background6 病理特征病理特征1 1、神经
4、纤维缠结、神经纤维缠结2 2、淀粉样蛋白斑、淀粉样蛋白斑 Background7 Noticeable problems coming up with the right word or nameTrouble remembering names Increasing trouble with planning or organizingstage 1stage 2stage 3stage 4stage 5stage 6stage 7No impairment (normal function)Very mild cognitive decline (may feel as if he or
5、she is having memory lapses)Mild cognitive decline Moderate cognitive decline/Mild or early-stage Alzheimers disease BackgroundlForgetfulness of recent events/ones own personal historylGreater difficulty performing complex taskslForgetfulness about Becoming moody or withdrawnModerately severe cognit
6、ive declineSevere cognitive declineSevere or late-stage Alzheimers diseaseUnable to take care of oneself8 Severe Alzheimers-maylastfrom1-5years.Plaques and tangles (shown in the blue-shaded areas) tend to spread through the cortex in a predictable pattern as Alzheimers disease progresses.Earliest Al
7、zheimers-changesmaybegin20yearsormorebeforediagnosis.Mild to moderate Alzheimer stages-generallylastfrom2-10years.Learning and memoryThinking and planning Speak and understanding speechSense of where is your body Background9 Alzheimers Disease 可能的致病分子机制可能的致病分子机制A的异常沉积：A是I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(amyloidprecurso
8、r protein，APP)的酶解产物。其沉积导致老年斑的形成，可能是所有因素导致AD的共同途径。正常情况下，A的产生和降解是平衡的，当出现如APP基因突变或过表达的特殊状况会引起A的异常沉积，引起神经元细胞膜破坏，细胞通透性增加，大量Ca2+涌入细胞内，依次激活钙依赖性激酶、蛋白酶、脂肪酶、细胞内自由基生成，从而导致细胞损伤乃至死亡。tau蛋白异常磷酸化：tau蛋白的过度磷酸化促使tau聚集形成成对的螺旋状纤维丝结构，并使tau及其他微管相关蛋白从微管释放，从而导致细胞骨架异常及轴浆运输障碍。高度磷酸化的tau蛋白易于聚集形成不可溶的纤维状缠结，进一步影响神经功能。 Background10
9、 Background11 研究并建立可靠的AD动物模型对于探明阿尔茨海默症的病制及发病机制及防治药物的开发与研究具有重要的意义。小鼠小鼠斑马鱼斑马鱼大鼠大鼠猕猴兔犬模模式式生生物物 & & 神神经经系系统统疾疾病病研研究究线虫大鼠繁殖力和抗病力强，价格低廉，大鼠繁殖力和抗病力强，价格低廉，医学研究的应用范围仅次子小鼠，医学研究的应用范围仅次子小鼠，在神经系统疾病研究中应用广泛。在神经系统疾病研究中应用广泛。传统上可以用于复制脑缺血、脑出传统上可以用于复制脑缺血、脑出血、蛛网膜下腔出血、癫痫、血、蛛网膜下腔出血、癫痫、ParkinsonParkinson病、病、AlzheimerAlzheim
10、er病等多种动病等多种动物疾病模型。物疾病模型。小鼠个体小，生长繁殖快，价格低廉可以小鼠个体小，生长繁殖快，价格低廉可以大大量量供供应应，并并且且全全世世界界科科研研工工作作者者均均用用国国际际公公认认的的品品系系和和标标准准的的条条件件进进行行实实验验，因因此此其其实实验验结结果果的的科科学学性性、可可靠靠性性、重重复复性性高高，用用途途最最广广。在在神神经经系系统统疾疾病病研研究究应应用用方方面面，由由于于小小鼠鼠对对多多种种病病原原体体特特别别是是病病毒毒敏敏感感，传传统统上上可可用用于于乙乙型型脑脑炎炎、脊脊髓髓灰灰质质炎炎等等病病毒毒性性疾疾病病的的研研究究。近近年年来来通通过过转转
11、基基因因小小鼠鼠对对ParkinsonParkinson、AlzheimerAlzheimer等等病病的的发发病病机制进行了大量研究。机制进行了大量研究。 model animals12 快速老化小鼠快速老化小鼠 （senescence accelerated mice SAMsenescence accelerated mice SAM） 模型模型胆碱能神经系统功能损伤模型胆碱能神经系统功能损伤模型-淀粉样蛋白淀粉样蛋白 ( ( )或多肽诱发的模型或多肽诱发的模型铝中毒：铝中毒：D-D-半乳糖和三氯化铝给小鼠联合腹腔注射半乳糖和三氯化铝给小鼠联合腹腔注射代谢紊乱所致模型代谢紊乱所致模型APP
12、APP转基因小鼠模型转基因小鼠模型tautau转基因小鼠模型转基因小鼠模型APPswe/PS-1APPswe/PS-1转基因小鼠模型转基因小鼠模型转基因小鼠模型转基因小鼠模型 model animals13 model animals-SAMR & SAMPFamily tree of SAM mouse（Senescence-accelerated mouse）14 SAMRSAMRsenescence accelerated-resistant senescence accelerated-resistant mousemouse，SAMR1SAMR1SAMPSAMPSenescence
13、accelerated prone Senescence accelerated prone mouse SAMP8mouse SAMP8 SAMP8SAMP8在渡过一段正常生长期在渡过一段正常生长期( (约约4 46 6月龄月龄) )后迅速出现老化特征；后迅速出现老化特征；SAMR1SAMR1则表现则表现为正常衰老，常作为为正常衰老，常作为SAMP8SAMP8的正常对照。快速老化痴呆模型小鼠的正常对照。快速老化痴呆模型小鼠SAMP8SAMP8主要以学习记主要以学习记忆能力障碍为老化特征，人类许多老年性疾病如忆能力障碍为老化特征，人类许多老年性疾病如肺泡扩张、骨质疏松、骨关节疾病、肺泡扩张、骨
14、质疏松、骨关节疾病、学习记忆功能障碍、情感紊乱学习记忆功能障碍、情感紊乱( (抑郁抑郁) )、白内障、听觉障碍、脑萎缩、免疫缺陷、白内障、听觉障碍、脑萎缩、免疫缺陷等在等在SAMPSAMP不同亚系上均有不同程度的体现，而不同亚系上均有不同程度的体现，而SAMRSAMR亚系的各项生理指标及生存期限与正亚系的各项生理指标及生存期限与正常动物相似。是目前比较理想的自然衰老痴呆模型。常动物相似。是目前比较理想的自然衰老痴呆模型。 model animals-SAMR & SAMP15 model animals-SAMR & SAMP氧化应激氧化应激能量代谢能量代谢氧化物岐化酶活性降低神经系统神经系统
15、神经递质活性 乙酰胆碱释放葡萄糖代谢异常线粒体功能线粒体功能16 老化度评分老化度评分广场实验广场实验(Open field test)高架十字迷宫实验高架十字迷宫实验(Elevated plus maze)筑巢智力测试筑巢智力测试(Nesting test)水迷宫实验水迷宫实验(Morris water maze，MWM) behavior tests17 用日本京都大学竹田俊男和细川昌则教授制定的老化度评分标准：反应性被动性逃避反应皮毛光泽皮毛粗糙程度脱毛程度皮肤溃病眼周损害角膜混浊角膜溃疡白内障脊柱后凸等11项进行观察 再根据程度不同，将每项指标划分为35级不等，标定分值。根据这个统一的
16、评分标准，客观地给动物评分，积分越高则老化度越高。 behavior tests-老度化评分老度化评分18 检测各组小鼠活动度情况，活动箱为一无盖、长宽各42 cm、高35 cm的黑色方盒，盒底用白色2 mm宽线条将底面划分为36个正方形小格(7 cm7 cm)。检测时将小鼠面朝墙壁放人纸盒的四个角落之一，记录小鼠3 min内跑动格子数、直立次数，连续记录3 d。结论：SAMP8相邻两个月龄的小鼠活动度显示出随增龄性活动度增加，SAMR1组没有表现出随月龄增加而活动度快速增加的特点，这也是老化小鼠对周围环境危险意识降低的表现。 behavior tests-广场实验广场实验（open fiel
17、d test）19 正常小鼠在有屏壁的臂内产生安全感，无屏壁臂内产生恐惧不安感。实验时将小鼠面向两个相邻的臂的交界口置于十字架的中心平台处，测定5 min内进入无屏壁臂(危险区)的次数及时间，以反映其产生恐惧不安状态的程度，检查其对危险与安全的识别能力。 behavior tests-高架十字迷宫实验高架十字迷宫实验（elevsted plus maze）20 说明SAMP8随增龄识别安全与危险环境的能力降低，处于低恐怖低紧张状态。 behavior tests-广场实验广场实验（open field test）21 检测小鼠与生俱来的特殊筑巢能力，筑巢行为的完成度和小鼠海马及前脑皮质的功能密
18、切相关。 将小鼠单独放养过夜，给食物、水、新的木絮，每只笼内放入6块5*5 cm2大小的薄布，过夜后，于次日清晨观察小鼠窝的筑成情况及组成的材料，木絮围升的凹状、是否有布条碎片等，并给予相应的评分。具体评分如下：0分没有可见的木絮窝，没有布；1分只有木絮窝，没有碎布条；2分有木絮窝，有碎布条或整块布在窝里或围着；3分2加上形成一个杯口状窝；4分碎布条像一个球状覆盖着小鼠。 behavior tests-筑巢实验筑巢实验（nesting test）22 0分1分2分3分4分 behavior tests-筑巢实验筑巢实验（nesting test）23 Morris圆形水迷宫 （Morris W
19、ater Maze）是水迷宫中常用的一种， 它通过强迫实验动物 （大鼠、 小鼠）游泳， 让实验动物学习在水中寻找隐藏平台并通过分析其寻找平台所用时间和所走路径测试实验动物对空间位置觉和方向觉 （空间定位）的学习记忆能力， 进而判断实验动物的记忆功能好坏。 通过该设备可以得到丰富的实验信息， 比如实验动物的潜伏期、 游泳总路程、 平均速度、 穿越平台的次数、 多次实验数据的统计运算 （平均值/总和） 、 象限分析 （四个象限中游泳轨迹分析， 时间/路程/百分比） 、 圆形区域分析 （定位搜索、 四象限中与平台相对称位置的轨迹分析、 时间/路程/百分比/密度） 、 环形区域分析（定距搜索， 与平台
20、相切的环形区域内的轨迹分析，时间/路程/百分比/密度） 、 游泳轨迹图、 轨迹图编辑分析等。通过对这些丰富的实验参数进行分析，不仅可以对与空间学习记忆相关的脑区功能进行评价， 而且可以对影响学习记忆的相关的药物效果、环境、 基因、 电磁辐射等其他因素进行评价。 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）24 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）25 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）26 1隐蔽平台试验(hidden platform tria
21、l)试验前1d，让动物在不含平台的水池中自由游泳90 S，使其熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变，置于西北象限中央，平台中点离池壁25 cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency，EL)，然后让小鼠在平台上停留10 s。如果90 s内找不到平台，潜伏期记为90 s，并将小鼠引导至平台上休息10 s。每天在2个入水点各训练1次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。2空间探索试验(probe trial)隐蔽平台试验结束24 h后，撤除平台。
22、任选一相同入水点将小鼠放入水中，记录小鼠在60 s内的游泳路径，对小鼠在原平台象限的停留时间进行统计分析。3反向试验(reversal trial)将平台位置移至对面象限，其余操作同隐蔽平台试验。4可视平台试验(visible platform trial)为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后1 d进行可视平台试验。让平台位置露出水面2 cIIl，并帖上黄色胶带，其余操作同隐蔽平台试验。 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）27 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）28
23、1、各组小鼠在隐蔽平台实验中的逃避潜伏期时间随天数的增加均有缩短，说明各组小鼠均有学习记忆能力。2、实验结果说明快速老化小鼠SAMP8的学习记忆能力较正常老化SAMR1鼠差。 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）29 无无明明显显变变化化 behavior tests-水迷宫实验水迷宫实验（morris water maze）30 SAM小鼠确实表现出包括外在衰老体征、情绪以及学习记忆能力方面的增龄性快速衰老现象。其作为一种自然衰老模型的合理性与可行性，可作为衰老模型、老年性痴呆模型或是情绪行为紊乱模型，在衰老和老年性痴呆机制研究、药物筛选等方面及抗精神药物研究等方面均具有很好的应用前景。 summary31 32
