植物生化制药 第五章 核酸类药物

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1、第五章第五章 核酸类药物核酸类药物第一节第一节 概述概述核酸核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分子，携带和传递遗传信息。 98%98%分分布布于于细细胞胞核核，其其余余分分布布于于核核外外如线粒体，叶绿体。如线粒体，叶绿体。主要主要分布于分布于细胞质（细胞质（90%90%），剩余），剩余10%10%位于细胞核位于细胞核。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(

2、genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。核酸核酸碱基碱基戊糖戊糖核苷核苷磷酸磷酸核苷酸核苷酸核酸类药物核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天然存在的碱基、核苷、核苷酸及碱基的统称。除了天然存在的碱基、核苷、核苷酸外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生物的外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生物的聚合物也属于核酸药物。聚合物也属于核酸药物。一、一、RNA的制备的制备（一）材料的选择与预处理（一）材料的选择与预处理制备制

3、备RNA的材料要选择含核酸量丰富的组织。的材料要选择含核酸量丰富的组织。RNA的含量和细胞的活跃程度有关，在蛋白质合成旺盛的的含量和细胞的活跃程度有关，在蛋白质合成旺盛的细胞中，其核酸的含量也相应地较高。细胞中，其核酸的含量也相应地较高。第二节第二节 核酸类药物的一般制备方法核酸类药物的一般制备方法组织匀浆组织匀浆沉淀物（沉淀物（DNA、蛋白质等）、蛋白质等）上清液（上清液（RNA等）等）残留物（残留物（DNA等）等）酸提取液（酸提取液（RNA）碱处理碱处理酸处理酸处理残留物残留物脂溶性物质脂溶性物质有机溶有机溶剂处理剂处理残留物残留物酸溶性小分子酸溶性小分子冷酸处理冷酸处理1. 酸处理法酸处

4、理法 将经酸和有机溶剂处理后的残留物用将经酸和有机溶剂处理后的残留物用1mol/L的过氯酸液的过氯酸液于于4下处理下处理18 h，从中抽提出，从中抽提出RNA，沉淀部分再用，沉淀部分再用0.5mol/L的过氯酸液的过氯酸液70 下处理下处理20 min提取提取DNA。此法的此法的缺点缺点是有些材料的是有些材料的DNA在冷过氯酸抽提时被少量提在冷过氯酸抽提时被少量提取，从而使取，从而使RNA部分中混有少量的部分中混有少量的DNA。2. 碱处理法碱处理法将残留物用将残留物用1mol/L的的NaOH溶液于溶液于37 处理过夜，则处理过夜，则RNA被碱解为碱溶性核苷酸，被碱解为碱溶性核苷酸，DNA不溶

5、解。加入过氯酸或三氯不溶解。加入过氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸浓度为乙酸使溶液酸化，至酸浓度为5%-10%,此时，此时，RNA的分解的分解产物溶解在上清液中，产物溶解在上清液中，DNA等则被沉淀下来。此法的等则被沉淀下来。此法的优点优点是是RNA和和DNA分开得较为彻底，分开得较为彻底，缺点缺点是是RNA中还含有其他中还含有其他含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。（二）提取与纯化（二）提取与纯化1. 提取提取（1）乙醇沉淀法）乙醇沉淀法（2）去污剂处理法）去污剂处理法（3）酚法）酚法2. 纯化纯化（1）密度梯度离心法）密度梯度离心法（2）柱色谱法）柱色谱法（3）凝

6、胶电泳法）凝胶电泳法（三）含量测定（三）含量测定1.定磷法定磷法（1 1）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；（2 2）制定定磷标准曲线；）制定定磷标准曲线；）制定定磷标准曲线；）制定定磷标准曲线；（3 3）测定回收率和样品总磷量。）测定回收率和样品总磷量。）测定回收率和样品总磷量。）测定回收率和样品总磷量。 (NH(NH4 4)MoO)MoO4 4+H+H2 2SOSO4 4 H H2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4) ) 2 2SOSO4 4

7、 H H3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO4 4 H H3 3P(Mo3O10) P(Mo3O10) 4 4+12H+12H2 2OO H H3 3P(MoP(Mo3 3OO1010) ) 4 4 Mo Mo2 2OO3 3 MoO MoO3 3（钼蓝）（钼蓝）（钼蓝）（钼蓝）2.定糖法定糖法Vit CRNA中的戊核糖可在盐酸的水解作用下游离出来，进一步形成糠醛，然中的戊核糖可在盐酸的水解作用下游离出来，进一步形成糠醛，然后与地衣酚反应，反应物程鲜绿色，在后与地衣酚反应，反应物程鲜绿色，在670nm有最大吸收峰。有最大吸收峰。二、二、DNA的制备的制备1.材料的选择与处理材

8、料的选择与处理2.2. 提取与纯化提取与纯化3.3. 含量测定含量测定4.（1）定磷法）定磷法 同同RNA5.（2）定糖法）定糖法6. 又称二苯胺法，在酸性溶液中，将又称二苯胺法，在酸性溶液中，将DNA与二苯胺共与二苯胺共热，形成蓝色化合物，该化合物在热，形成蓝色化合物，该化合物在595nm有最大吸收。有最大吸收。当当DNA浓度在浓度在20-200ug/mL时，光吸收度与时，光吸收度与DNA浓度浓度呈正比。呈正比。三、核苷酸、核苷及碱基的制备三、核苷酸、核苷及碱基的制备（一）制备方法（一）制备方法1. 直接提取法直接提取法2. 水解法水解法（1）酶水解法）酶水解法（2）碱水解法）碱水解法（3）

9、酸水解法）酸水解法3. 化学合成法化学合成法4. 酶合成法酶合成法5. 微生物发酵法微生物发酵法光合磷酸化法制备光合磷酸化法制备ATP的工艺流程的工艺流程5-AMP 溶解，混合溶解，混合 Na2HPO4，Tris，PMS肌激酶，肌激酶，ATP（引子）（引子）混合液混合液反应液反应液ATP粗制品粗制品上清液上清液滤液滤液ATP成品成品ATP沉淀沉淀洗脱液（含洗脱液（含ATP）吸附物吸附物流出液流出液 光合光合 叶绿体叶绿体pH3,1-1.5h 沉淀沉淀 三氯乙酸三氯乙酸10以下以下 提取提取 乙醇乙醇10 4-5h 干燥干燥 乙醇，乙醚乙醇，乙醚减压减压 去阳离子去阳离子 732树脂树脂pH61

10、212 除热源、沉淀除热源、沉淀 硅藻土、乙醇硅藻土、乙醇 去杂质去杂质 蒸馏水、硅藻土蒸馏水、硅藻土 洗脱洗脱 NaCl溶液溶液pH3.8 吸附吸附 NaOH，717树脂树脂pH6.5-7ATPATP的药理作用与临床应用的药理作用与临床应用 在生物体内，在生物体内，ATP广泛参与各种生化过程，除参与核广泛参与各种生化过程，除参与核酸形成外，主要起着供应能量和磷酸基团的作用。酸形成外，主要起着供应能量和磷酸基团的作用。 ATP除了作为危重病人抢救的辅助药物外，还可对慢除了作为危重病人抢救的辅助药物外，还可对慢性肝炎、肝硬化、肾炎、心肌炎、冠状动脉硬化、进行性性肝炎、肝硬化、肾炎、心肌炎、冠状动

11、脉硬化、进行性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、脑血管意外后遗症、中心性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、脑血管意外后遗症、中心性血管痉挛性视网膜脉络膜炎、风湿性关节炎、耳聋、耳鸣血管痉挛性视网膜脉络膜炎、风湿性关节炎、耳聋、耳鸣等有一定疗效。等有一定疗效。第五章第五章 酶类药物酶类药物第一节第一节 概述概述 一、酶类药物发展简史一、酶类药物发展简史 酶类药物是直接用各种剂型的酶以改变体内酶活力，或酶类药物是直接用各种剂型的酶以改变体内酶活力，或改变体内某性质生物活性物质和代谢产物的数量等，从而达改变体内某性质生物活性物质和代谢产物的数量等，从而达到治疗某些疾病的目的。到治疗某些疾病的目的。1926年，年，S

12、umner将尿素酶结晶是药用酶工业化的起点。将尿素酶结晶是药用酶工业化的起点。1952年，年，Innerfield首次将结晶的胰蛋白酶用于治疗血栓性首次将结晶的胰蛋白酶用于治疗血栓性静脉炎，真正揭开了酶在医疗应用的序幕。静脉炎，真正揭开了酶在医疗应用的序幕。20世纪世纪60年代后期，逐渐发展到从微生物发酵液中获得大量年代后期，逐渐发展到从微生物发酵液中获得大量的酶。的酶。70年代后，开始利用人的某些组织细胞培养技术和基因工程年代后，开始利用人的某些组织细胞培养技术和基因工程手段来获取有关的酶，使酶类药物的应用得到了迅速发展。手段来获取有关的酶，使酶类药物的应用得到了迅速发展。对酶类药物的要求对

13、酶类药物的要求1. 药用酶应在生理环境（药用酶应在生理环境（pH中性）下具有最高活力和稳定性。中性）下具有最高活力和稳定性。2. 对其作用的底物具有较高的亲和力。对其作用的底物具有较高的亲和力。3. 在血清中半衰期较长。在血清中半衰期较长。4. 要求纯度高，特别是对注射用的酶类药物纯度要求更高。要求纯度高，特别是对注射用的酶类药物纯度要求更高。5. 酶应免疫源性较低或无免疫源性。酶应免疫源性较低或无免疫源性。二、酶的分子组成及分类二、酶的分子组成及分类1. 酶分子的组成酶分子的组成单体酶单体酶寡聚酶寡聚酶多酶复合体多酶复合体酶酶有机物分子有机物分子金属有机物金属有机物金属金属辅酶或辅基（非蛋白

14、部分）辅酶或辅基（非蛋白部分）酶蛋白酶蛋白复合蛋白质复合蛋白质单纯蛋白质（单体酶）单纯蛋白质（单体酶）2. 酶的分类酶的分类分类分类 名称名称 催化反应的类型催化反应的类型 实例实例 1 氧化还原酶氧化还原酶 电子转移电子转移 醇脱氢酶醇脱氢酶 2 转移酶转移酶 转移功能基团转移功能基团 己糖激酶己糖激酶 3 水解酶水解酶 水解反应水解反应 胰蛋白酶胰蛋白酶 4 裂合酶裂合酶 键的断裂键的断裂 丙酮脱羧酶丙酮脱羧酶 5 异构酶异构酶 分子内基团的转移分子内基团的转移 顺丁烯二酸异构酶顺丁烯二酸异构酶 6 连接酶或合成酶连接酶或合成酶 键形成与水解偶联键形成与水解偶联 丙酮羧化酶丙酮羧化酶表表6

15、-1 6-1 酶的国际分类酶的国际分类三、酶类药物的临床应用三、酶类药物的临床应用1. 消化酶类消化酶类2. 抗炎、黏痰溶解酶抗炎、黏痰溶解酶3. 与纤维蛋白溶解作用有关的酶类与纤维蛋白溶解作用有关的酶类4. 抗肿瘤的酶类抗肿瘤的酶类5. 其它生理活性酶其它生理活性酶6. 复合酶复合酶 表表6-2 酶类药物一览表酶类药物一览表第二节第二节 酶类药物的一般制备方法酶类药物的一般制备方法酶制备过程的特点：酶制备过程的特点：一是某种酶在生物体内含量甚少，且有分布部位特异性。一是某种酶在生物体内含量甚少，且有分布部位特异性。二是酶可以通过测定其活力加以跟踪。二是酶可以通过测定其活力加以跟踪。酶制备一般

16、包括四个步骤：酶的原材料的选择与处理；酶的酶制备一般包括四个步骤：酶的原材料的选择与处理；酶的提取；酶的纯化；酶活力的测定和纯度检测。提取；酶的纯化；酶活力的测定和纯度检测。一、酶的原材料选择与预处理一、酶的原材料选择与预处理（一）原材料的选择（一）原材料的选择（1）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。生物材料。（2）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差别及杂质干扰的情况。差别及杂质干扰的情况。（3）原料来源是否丰富，原料易得，原料产地较近。）原料来源是否丰富，原料易得，原料

17、产地较近。（4）提取步骤是否简便易行。）提取步骤是否简便易行。用植物组织作原料，要择时采集并就地去除不用部分，用植物组织作原料，要择时采集并就地去除不用部分，将有用部分保鲜处理。将有用部分保鲜处理。（二）原材料的预处理（二）原材料的预处理1. 机械法机械法2.反复冻融法反复冻融法3. 超声波法超声波法4. 酶解法酶解法5. 丙酮粉法丙酮粉法二、酶的提取二、酶的提取1. 水溶液法水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。可用水溶液抽提。 水溶液的水溶液的

18、pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：选择对抽提具有影响，应考虑的因素有： 酶的稳定性酶的稳定性 酶的溶解性酶的溶解性 酶与其他物质结合的性质酶与其他物质结合的性质 选择选择pH的总原则是，在酶稳定的的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离范围内，选择偏离等电点的适当的等电点的适当的pH。2. 有机溶剂法有机溶剂法 某些结合酶，由于和脂质结合牢固，某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。剂是丁醇。 丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能

19、起表面活性剂的桥梁作用。起表面活性剂的桥梁作用。 丁醇提取方法：均相法和两相法丁醇提取方法：均相法和两相法3. 表面活性剂法表面活性剂法三、酶的纯化三、酶的纯化不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。力回收率。（一）杂质的除去（一）杂质的除去1. 调调pH和加热沉淀法（核糖核酸酶，溶菌酶的提取）和加热沉淀法（核糖核酸酶，溶菌酶的提取）2. 蛋白质表面变性法（蛋白质表面变性法（CAT用氯仿提取）用氯仿提取）3. 选择性变性法（细胞色

20、素选择性变性法（细胞色素C可用三氯醋酸提取）可用三氯醋酸提取）4. 降解或沉淀核苷酸法降解或沉淀核苷酸法5. 利用结合底物保护法除去杂蛋白（利用结合底物保护法除去杂蛋白（D-甲基苯甲酸为甲基苯甲酸为D-氨氨基酸氧化酶的保护剂）基酸氧化酶的保护剂）（二）脱盐和浓缩（二）脱盐和浓缩1. 脱盐脱盐（1）透析）透析（2）凝胶过滤）凝胶过滤2. 浓缩浓缩（1）蒸发）蒸发（2）超滤法）超滤法（3）凝胶吸水法）凝胶吸水法（4）冷冻干燥法）冷冻干燥法（三）酶的结晶（三）酶的结晶1. 盐析法盐析法2. 有机溶剂法有机溶剂法3. 透析平衡法透析平衡法4. 等电点法等电点法四、酶活力的测定与纯度检验四、酶活力的测定

21、与纯度检验1. 活力测定活力测定 无论在酶的抽提纯化过程中或是对酶的性质进行研究无论在酶的抽提纯化过程中或是对酶的性质进行研究过程中为了了解所选择方法是否适宜，几乎每一步骤前后过程中为了了解所选择方法是否适宜，几乎每一步骤前后都应进行酶的活力测定，做出总活力和比活力的比较。都应进行酶的活力测定，做出总活力和比活力的比较。2.纯度检测纯度检测 在酶的分离提纯中，总活力用于计算某一抽提或纯化在酶的分离提纯中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的回收率（步骤后酶的回收率（Y），而比活力则用于计算某一纯化），而比活力则用于计算某一纯化步骤的效果，即纯度的提高（步骤的效果，即纯度的提高（E），其关系如

22、下：），其关系如下： Y=某步骤后的总活力某步骤后的总活力/某步骤前的总活力某步骤前的总活力 E=某步骤后的比活力某步骤后的比活力/某步骤前的比活力某步骤前的比活力五、菠萝蛋白酶五、菠萝蛋白酶 是从菠萝汁或加工菠萝削下的废皮中提取的一种蛋白水是从菠萝汁或加工菠萝削下的废皮中提取的一种蛋白水解酶，粗菠萝水解酶是各种成分的混合物，除蛋白水解酶系解酶，粗菠萝水解酶是各种成分的混合物，除蛋白水解酶系外，还含有磷酸酯酶、过氧化物酶、纤维素酶、其它糖苷酶外，还含有磷酸酯酶、过氧化物酶、纤维素酶、其它糖苷酶及非蛋白物质。及非蛋白物质。 实验证明，菠萝蛋白酶具有消炎抗水肿作用，作用特点实验证明，菠萝蛋白酶具有

23、消炎抗水肿作用，作用特点是能选择性水解纤维蛋白，对与凝血有关的纤维蛋白原仅有是能选择性水解纤维蛋白，对与凝血有关的纤维蛋白原仅有微弱的作用，不影响正常血液的凝固。能分解肌纤维，可单微弱的作用，不影响正常血液的凝固。能分解肌纤维，可单独或与胰蛋白酶制成合剂使用，消除各种单纯性炎症、水肿、独或与胰蛋白酶制成合剂使用，消除各种单纯性炎症、水肿、血肿，促进抗生素和化疗药物的渗透和扩散。血肿，促进抗生素和化疗药物的渗透和扩散。 临床适用于治疗支气管哮喘、急性肺炎、产后乳房充血、临床适用于治疗支气管哮喘、急性肺炎、产后乳房充血、乳腺炎、产后血栓静脉炎、视网膜炎等。试用于同抗生素配乳腺炎、产后血栓静脉炎、视

24、网膜炎等。试用于同抗生素配伍治疗关节炎、关节周围炎、蜂窝组织炎和小腿溃疡等。伍治疗关节炎、关节周围炎、蜂窝组织炎和小腿溃疡等。（一）化学性质和组成（一）化学性质和组成白色至浅棕黄色无定形粉末。略溶于水，水溶液无色至白色至浅棕黄色无定形粉末。略溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，为淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚，为一种巯基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金属抑一种巯基酶。半胱氨酸能激活酶的活性，但受重金属抑制。最适制。最适pH7.0，相对分子量，相对分子量33000。 主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的肽类。主要作用原理：使多肽类水解为低分子量的

25、肽类。（二）生产工艺（白陶土吸附法）（二）生产工艺（白陶土吸附法）（吸附）（吸附）白陶土白陶土10菠萝蛋白酶成品菠萝蛋白酶成品湿菠萝蛋白酶精制品湿菠萝蛋白酶精制品澄清液澄清液粗制品粗制品（沉淀）（沉淀）HCl pH4（溶解）（溶解）自来水，自来水，NaOH洗脱液洗脱液（盐析、抽滤）（盐析、抽滤）HCl，（，（NH4）2SO4pH=4.55吸附物吸附物（洗脱）（洗脱）Na2CO3或或NaOH（NH4）2SO4pH=6.57压出液压出液菠萝皮菠萝皮（压榨）（压榨）苯甲酸钠苯甲酸钠（干燥、粉碎）（干燥、粉碎）pH77.5（三）检验方法（三）检验方法1. 性状性状 富有菠萝香气，浅黄色或浅棕黄色粉末。

26、富有菠萝香气，浅黄色或浅棕黄色粉末。2. 蛋白酶水解活力测定蛋白酶水解活力测定（1）原理）原理 菠萝蛋白酶在一定温度与菠萝蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并沉淀酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并沉淀除去未水解的蛋白，滤液对紫外光有吸收，用紫外分除去未水解的蛋白，滤液对紫外光有吸收，用紫外分光光度计法测定，根据吸光度计算酶活力。光光度计法测定，根据吸光度计算酶活力。（2）酶活力单位定义）酶活力单位定义 在测定条件下在测定条件下 pH7.0，（37+0.2），每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸，每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在可溶

27、物在275nm的吸光度与的吸光度与1g酪氨酸的吸光度相当酪氨酸的吸光度相当时，所需酶量为时，所需酶量为1U。（3）测定步骤）测定步骤 适当稀释样品后，精密量取样品待测液适当稀释样品后，精密量取样品待测液1mL，置于具，置于具塞试管中，于，塞试管中，于，37预温预温10min，迅速加入，迅速加入37预温的酪预温的酪蛋白溶液蛋白溶液5mL，从开始加入起准确反应，从开始加入起准确反应10min，加入三氯，加入三氯乙酸溶液乙酸溶液5mL，混匀，保温，混匀，保温10min后过滤。后过滤。另量取另量取1mL待测样品液于待测样品液于37预温预温10min，精密加入三，精密加入三氯乙酸溶液氯乙酸溶液5mL，准

28、确反应，准确反应10min，加入酪蛋白溶液，加入酪蛋白溶液5mL，摇匀，保温，摇匀，保温10min后过滤，滤液作为上述溶液的空白对后过滤，滤液作为上述溶液的空白对照。用分光光度计在照。用分光光度计在275nm的波长处测吸光度的波长处测吸光度A。以水做空白对照，在以水做空白对照，在275nm的波长处测定的波长处测定50g/mL酪氨酪氨酸吸光度酸吸光度A。（四）菠萝蛋白酶在医药、保健品业的应用（四）菠萝蛋白酶在医药、保健品业的应用 1、抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的生长 经相关临床研究观察表明，菠萝蛋白酶能抑制肿瘤经相关临床研究观察表明，菠萝蛋白酶能抑制肿瘤细胞的生长。细胞的生长。 2、对心血

29、管疾病的防治、对心血管疾病的防治 菠萝蛋白酶作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是菠萝蛋白酶作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的。它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风有益的。它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风, 缓解心绞痛症状缓解心绞痛症状,缓和动脉收缩缓和动脉收缩, 加速纤维蛋白原的分解。加速纤维蛋白原的分解。 3、用于烧伤脱痂、用于烧伤脱痂 菠萝蛋白酶能选择性地除菠萝蛋白酶能选择性地除 皮皮, 使新皮移植得以尽早使新皮移植得以尽早进行。动物实验证明进行。动物实验证明, 菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不菠萝蛋白酶对邻近的正常皮肤无不良影响。局部使用抗生素不影响菠萝蛋白酶的效果。良影响

30、。局部使用抗生素不影响菠萝蛋白酶的效果。 4、消炎作用、消炎作用 菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤尿病人溃疡及运动损伤)，菠萝蛋白酶具有激活炎症反，菠萝蛋白酶具有激活炎症反应的潜力。菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。应的潜力。菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。 5、增进药物吸收、增进药物吸收 将菠萝蛋白酶与各种抗生素将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素如四环素, 阿莫西林阿莫西林等等)联用联用, 能提高其疗效。相关研究表明能提高其疗效。相关研究表明,

31、它能促进抗它能促进抗生素在感染部位的传输生素在感染部位的传输, 从而减少抗生素的用药量。据从而减少抗生素的用药量。据推断推断, 对于抗癌药物对于抗癌药物, 也有类似的作用。此外，菠萝蛋也有类似的作用。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。白酶能促进营养物质的吸收。第七章第七章 多糖类药物多糖类药物第一节第一节 糖类药物概述糖类药物概述按照含有糖基数目的不同分为按照含有糖基数目的不同分为: 单糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素单糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。等。 低聚糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖等。低聚糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖等。 多糖：（糖类药物研究的最多是多糖类药物多糖：（糖类药物研究

32、的最多是多糖类药物 ）多糖如有）多糖如有旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。旋糖酐、甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖等。 还有一些糖类药物是糖的衍生物，如还有一些糖类药物是糖的衍生物，如6-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖，1，6-二磷酸果糖，磷酸肌醇等。二磷酸果糖，磷酸肌醇等。多糖的药理作用多糖的药理作用（1）调节免疫功能）调节免疫功能 主要表现为影响抗体活性，促进淋巴主要表现为影响抗体活性，促进淋巴细胞增殖，激活或提高吞噬细胞的功能。增强机体的抗细胞增殖，激活或提高吞噬细胞的功能。增强机体的抗炎、抗氧化和抗衰老作用。炎、抗氧化和抗衰老作用。（2）抗感染作用，多糖可以提高机体组织细胞对细菌，）抗感染作

33、用，多糖可以提高机体组织细胞对细菌，原虫，病毒和真菌感染的抵抗力。原虫，病毒和真菌感染的抵抗力。（3）促进细胞）促进细胞DNA，蛋白质的合成，促进细胞的增殖、，蛋白质的合成，促进细胞的增殖、生长。生长。（4）抗辐射损伤作用，抗射线的损伤，有抗氧化、防辐）抗辐射损伤作用，抗射线的损伤，有抗氧化、防辐射作用。射作用。（5）抗肿瘤和抗凝血作用，肝素是天然抗凝剂。）抗肿瘤和抗凝血作用，肝素是天然抗凝剂。 （6）降血脂和抗动脉粥样硬化功能。硫酸软骨素、小分）降血脂和抗动脉粥样硬化功能。硫酸软骨素、小分子肝素、壳聚糖等具有降血脂、降血胆固醇，抗动脉粥样子肝素、壳聚糖等具有降血脂、降血胆固醇，抗动脉粥样硬化

34、作用，用于防治冠心病和动脉硬化。硬化作用，用于防治冠心病和动脉硬化。多糖多糖结合型结合型游离型游离型脂多糖：与脂类结合在一起脂多糖：与脂类结合在一起糖蛋白：与蛋白质结合在一起糖蛋白：与蛋白质结合在一起 多糖的相对分子量较大，有直链和支链两种，多可溶多糖的相对分子量较大，有直链和支链两种，多可溶于水，水溶液具有一定的黏度，能被酸、碱和酶水解成单于水，水溶液具有一定的黏度，能被酸、碱和酶水解成单糖或低聚糖。糖或低聚糖。多糖根据来源不同可分为：多糖根据来源不同可分为：(1) 植物多糖：黄芪多糖，人参多糖。植物多糖：黄芪多糖，人参多糖。(2) 动物多糖：肝素，透明质酸，硫酸软骨素等。动物多糖：肝素，透

35、明质酸，硫酸软骨素等。 (3) 微生物多糖：香菇多糖，灵芝多糖。微生物多糖：香菇多糖，灵芝多糖。第二节第二节 糖类药物的一般制备技术糖类药物的一般制备技术一、单糖、低聚糖及其衍生物的制备一、单糖、低聚糖及其衍生物的制备 用水或在中性条件下以用水或在中性条件下以50乙醇，也可以用乙醇，也可以用82乙醇，乙醇，在在7078下回流提取。溶剂用量一般为材料的下回流提取。溶剂用量一般为材料的10倍，需多倍，需多次提取。次提取。 植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，以植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，以50乙醇温浸，浸液合并，于乙醇温浸，浸液合并，于4045减压浓缩至适当体积，用减压浓缩

36、至适当体积，用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可通中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可通H2S除去，再除去，再浓缩至粘稠状。浓缩至粘稠状。以甲醇或乙醇温浸，去不溶物如无机盐或残留蛋白质等。以甲醇或乙醇温浸，去不溶物如无机盐或残留蛋白质等。 醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。 二、多糖的分离与纯化二、多糖的分离与纯化 多糖可来自动物、植物和微生物多

37、糖可来自动物、植物和微生物 ，植物体内含有水，植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。取天然存在形式的多糖。 提取多糖的材料必须新鲜或及时干燥保存，避免受提取多糖的材料必须新鲜或及时干燥保存，避免受高温破坏因此，速冻冷藏是保存材料的有效方法。高温破坏因此，速冻冷藏是保存材料的有效方法。 提取所用溶剂根据多糖的溶解性质而定。提取所用溶剂根据多糖的溶解性质而定。（一）多糖的提取（一）多糖的提取提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇

38、或方法是将材料粉碎，用甲醇或1 1乙醇乙醚混合液，加乙醇乙醚混合液，加热搅拌热搅拌13小时，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙小时，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。酮脱脂、脱水处理。 1、稀碱液提取、稀碱液提取 用于难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者。这一用于难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者。这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚精、半乳聚糖等。类多糖主要是不溶性胶类，如木聚精、半乳聚糖等。用冷水浸润材料后用用冷水浸润材料后用0.5 molL NaOH提取，提取液提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。 如在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼

39、砂，对甘露如在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼砂，对甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可得相当纯的物质。得相当纯的物质。2、温热水提取、温热水提取 易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者。易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者。材料用冷水浸材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至过，用热水提取，必要时可加热至8090搅拌提取。搅拌提取。 提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白（或用三氯提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白（或用三氯乙酸除杂蛋白），离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙酸除杂蛋白），离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。乙醇沉淀得多糖

40、。 3、粘多糖、粘多糖 因大部粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解因大部粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱解法使糖法或碱解法使糖-白质间的结合键断裂，促使多糖释放。白质间的结合键断裂，促使多糖释放。（1）碱解法）碱解法 多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。可用碱解法使糖与蛋白质分开。（2）酶解法）酶解法 蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。最常用方法。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，为除去鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，为除去长

41、肽段，常与碱解法合用。长肽段，常与碱解法合用。 常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶。及枯草杆菌蛋白酶。（二）多糖的纯化（二）多糖的纯化1. 乙醇沉淀法乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用手段。乙醇的加乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。 向溶液中加入一定浓度的盐，如醋酸钠，醋酸钾、醋向溶液中加入一定浓度的盐，如醋酸钠，醋酸钾、醋酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出，盐的最终浓

42、度浓度5即足够。即足够。多次乙醇沉淀法脱盐，也可以用超滤法或分子筛法多次乙醇沉淀法脱盐，也可以用超滤法或分子筛法（SephadexG-10或或G-15）进行多糖脱盐。）进行多糖脱盐。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。得疏松粉末状产品。2. 分级沉淀法分级沉淀法 不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖。子大小不同的粘多糖。 在在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存

43、在下，采用乙等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离粘多糖可以获得最佳效果。醇分级分离粘多糖可以获得最佳效果。 3. 季胺盐络合法季胺盐络合法 粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化砒啶（）和十六烷基氯化砒啶（CPC）等能形成季胺盐络合物。等能形成季胺盐络合物。络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，络合物可以解离、溶解、释放。强度大时，络合物可以解离、溶解、释放。（三）多糖药物的鉴定检测方法（三）多糖药物的鉴定检测方法1. 定量测定定量测定（1）苯酚

44、）苯酚-硫酸法硫酸法（2）蒽酮）蒽酮-硫酸法硫酸法（3）氨基己糖的比色测定）氨基己糖的比色测定 先在盐酸溶液中将氨基己糖经先在盐酸溶液中将氨基己糖经碱性乙酰化后，再与对二甲基苯甲酸发生呈色反应，从而碱性乙酰化后，再与对二甲基苯甲酸发生呈色反应，从而进行定量测定。进行定量测定。 2.鉴别鉴别（1）测定糖基组成）测定糖基组成（2）高压电泳法鉴定多糖均一性）高压电泳法鉴定多糖均一性（3）超离心法鉴定多糖均一性）超离心法鉴定多糖均一性（4）凝胶柱色谱法鉴定多糖均一性）凝胶柱色谱法鉴定多糖均一性（5）分子量测定）分子量测定第三节第三节 香菇多糖香菇多糖一、结构与性质一、结构与性质为白色粉末状固体，对为白

45、色粉末状固体，对光和热稳定。溶于水和光和热稳定。溶于水和0.5mol/L的的NaOH，不，不溶于甲醇、乙醇、丙酮溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。等有机溶剂。二、生产工艺二、生产工艺1.常规提取法常规提取法 鲜香菇鲜香菇 捣碎捣碎 浸渍浸渍 过滤过滤 浓缩浓缩 乙醇沉淀乙醇沉淀 乙醇、乙醚洗涤乙醇、乙醚洗涤 干燥干燥 成品成品2. 复合酶提取法复合酶提取法3. 深层培养提取法深层培养提取法三、质量检测三、质量检测1.试剂试剂浓硫酸：分析纯，浓硫酸：分析纯，95.5%苯酚：苯酚：80g苯酚加苯酚加20g水使之溶解，可置冰箱中长期贮存。水使之溶解，可置冰箱中长期贮存。6%苯酚：临用前用苯酚：临用前用

46、80%苯酚配制。苯酚配制。标准葡聚糖、葡萄糖或标准香菇多糖。标准葡聚糖、葡萄糖或标准香菇多糖。2. 方法方法（1）制作标准曲线）制作标准曲线 准确称取标准葡萄糖准确称取标准葡萄糖20mg溶于溶于500mL容量瓶中加水至刻度，分别吸取容量瓶中加水至刻度，分别吸取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及，及，1.8mL各用水补充至各用水补充至2.0mL，然后加入，然后加入6%苯酚苯酚1.0mL以及浓硫酸以及浓硫酸5.0mL，静止，静止10min，摇匀，室温放置，摇匀，室温放置20min。在。在490nm处测光密度，以处测光密度，以2.0mL水按同样显水按

47、同样显色操作作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光色操作作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。密度值，得标准曲线。（2）样品含量测定。吸取）样品含量测定。吸取1mL样品，按上述步骤操样品，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。第八章第八章 脂脂 类类 药药 物物第一节第一节 概概 述述 脂类物质是广泛存在于生物体中的脂肪及类似脂肪脂类物质是广泛存在于生物体中的脂肪及类似脂肪的、能够被有机溶剂提取出来的化合物，由于分子中的的、能够被有机溶剂提取出来的化合物，由于分子中的碳氢比例都较高，能够溶解在乙醚、氯仿、苯等有机溶碳氢比

48、例都较高，能够溶解在乙醚、氯仿、苯等有机溶剂中，不溶于水。脂类化合物的这种性质，称之为脂溶剂中，不溶于水。脂类化合物的这种性质，称之为脂溶性，利用这一性质，将脂类物质用有机溶剂从生物体中性，利用这一性质，将脂类物质用有机溶剂从生物体中提取出来。提取出来。 实际上，脂类药物往往是互溶在一起的，依据脂溶实际上，脂类药物往往是互溶在一起的，依据脂溶性这一共同特点归为一大类成为脂类，而不是一个准确性这一共同特点归为一大类成为脂类，而不是一个准确的化学名词。的化学名词。脂类药物脂类药物是具有重要生理生化、药理药效作用的脂类物质。是具有重要生理生化、药理药效作用的脂类物质。大体可分为以下几类：大体可分为以

49、下几类：胆汁酸类，如胆酸、脱氧胆酸。胆汁酸类，如胆酸、脱氧胆酸。不饱和脂肪酸类，如花生四烯酸、亚麻油酸等；不饱和脂肪酸类，如花生四烯酸、亚麻油酸等； 磷脂类，如：卵磷脂、脑磷脂；磷脂类，如：卵磷脂、脑磷脂； 固醇类，如：胆固醇、麦角固醇；固醇类，如：胆固醇、麦角固醇； 色素类，如：胆红素、血红素等；色素类，如：胆红素、血红素等； 其他，如鲨烯等。其他，如鲨烯等。一、脂类药物的制备方法一、脂类药物的制备方法1. 直接抽提法直接抽提法2. 水解法水解法3. 化学合成化学合成4. 生物合成法生物合成法二、脂类药物的分离二、脂类药物的分离1. 溶解度法溶解度法2. 吸附分离法吸附分离法3. 超临界流体

50、萃取技术超临界流体萃取技术 待分离物质待分离物质 提提 取取 溶溶 剂剂（脑干提取液）（脑干提取液） 丙酮丙酮 乙醇乙醇 乙醚乙醚 胆固醇胆固醇 卵磷脂卵磷脂 脑磷脂脑磷脂 超临界流体超临界流体（supercritical fluid, SF）是指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和是指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和温度均高于临界点时，使其密度接近液体，而其扩散系数和温度均高于临界点时，使其密度接近液体，而其扩散系数和黏度均接近气体，其性质介于气体和液体之间的流体。黏度均接近气体，其性质介于气体和液体之间的流体。超临界流体萃取法超临界流体萃取法（supercrit

51、ical fluid extraction, SFE）技）技术就是利用超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某些术就是利用超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某些有效组分，并进行分离的一种技术。有效组分，并进行分离的一种技术。 超临界流体萃取法的超临界流体萃取法的特点特点在于充分利用超临界流体兼有气、在于充分利用超临界流体兼有气、液两重性的特点，在临界点附近，超临界流体对组分的溶解液两重性的特点，在临界点附近，超临界流体对组分的溶解能力随体系的压力和温度发生连续变化，从而可方便的调节能力随体系的压力和温度发生连续变化，从而可方便的调节组分的溶解度和溶剂的选择性。组分的溶解度和溶剂的选择性。

52、三、脂类药物的精制三、脂类药物的精制 经分离后的脂类中常有微量杂质，需用适当的方法精制，经分离后的脂类中常有微量杂质，需用适当的方法精制，常用的有结晶法、重结晶法和有机溶剂沉淀法。常用的有结晶法、重结晶法和有机溶剂沉淀法。第三节第三节 发酵工程生产脂类药物发酵工程生产脂类药物 发酵工程生产脂类药物是利用微生物在最适宜条件下发酵工程生产脂类药物是利用微生物在最适宜条件下把糖等底物转化成脂类化合物的现代生物技术。把糖等底物转化成脂类化合物的现代生物技术。碳水化合物碳水化合物 柠檬酸柠檬酸苹果酸苹果酸丙酮酸丙酮酸 PKPFK 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶乙酰辅酶A草酰乙酸草酰乙酸苹果酸苹果酸草

53、酰乙酸草酰乙酸乙酰辅酶乙酰辅酶A丙二酸单酰辅酶丙二酸单酰辅酶A脂酰辅酶脂酰辅酶A甘油三酯甘油三酯柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸继续继续TCA循环循环线粒体膜线粒体膜TCA循环循环EMP途径途径ACCFASPDPCCS线粒体膜线粒体膜细细胞胞质质微生物生产脂类的优点微生物生产脂类的优点1. 微生物适应性强，生长繁殖迅速，周期短，代谢活力微生物适应性强，生长繁殖迅速，周期短，代谢活力强，易于培养，易于改良，遗传稳定。强，易于培养，易于改良，遗传稳定。2. 微生物生产脂类占地面积小，不受场地、气候、季节微生物生产脂类占地面积小，不受场地、气候、季节限制，能连续大规模生产，所需劳动力少

54、。限制，能连续大规模生产，所需劳动力少。3. 微生物生长所需原材料丰富、价格便宜，如：乳清、微生物生长所需原材料丰富、价格便宜，如：乳清、糖蜜、废糖液、淀粉生产中的废液和废料、木材糖化液、糖蜜、废糖液、淀粉生产中的废液和废料、木材糖化液、亚硫酸纸浆等，均可利用，又可保护环境。亚硫酸纸浆等，均可利用，又可保护环境。4. 微生物脂类生物安全性好。微生物脂类生物安全性好。第四节第四节 大豆磷脂大豆磷脂一、化学组成与性质一、化学组成与性质 豆磷脂是多种磷脂的混合物，主要含卵磷脂、脑磷豆磷脂是多种磷脂的混合物，主要含卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂，还含相当量的三酰甘油、游离脂肪酸及脂、肌醇磷脂，还含相当量的三

55、酰甘油、游离脂肪酸及糖类化合物等。糖类化合物等。 呈浅黄或浅棕色，无味或有些许气味，极易吸潮，呈浅黄或浅棕色，无味或有些许气味，极易吸潮，变粘稠至蜡状。不耐高温，变粘稠至蜡状。不耐高温，8080变棕色，变棕色，120120分解。能溶分解。能溶于乙醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，也溶于脂肪酸和矿于乙醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，也溶于脂肪酸和矿物油，不溶于丙酮，部分溶于乙醇。物油，不溶于丙酮，部分溶于乙醇。二、生产工艺二、生产工艺1.从豆油中提取豆磷脂的制备工艺从豆油中提取豆磷脂的制备工艺 大豆油大豆油 磷脂化合物磷脂化合物 粗磷脂粗磷脂 豆磷脂成品豆磷脂成品（水合）（水合）2% 3%H2O50 70分离分离干燥干燥2. 注射用豆磷脂的制备工艺注射用豆磷脂的制备工艺粗磷脂粗磷脂 沉淀物沉淀物 提取液提取液 上层提取液上层提取液注射用豆磷脂注射用豆磷脂浓缩液浓缩液滤液滤液（脱脂）（脱脂）丙酮丙酮（提取）提取）95%乙醇乙醇回流回流1h，5次次（吸附）（吸附）Al2O3回流回流1h（脱色）（脱色） 活性炭活性炭 回流回流1h浓缩浓缩减压减压（脱色、脱油）（脱色、脱油）活性炭、丙酮活性炭、丙酮