《食品酶学课件本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品酶学课件本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法).ppt（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章第三章 酶的分离纯化概述概述第一节第一节 起始材料的选择起始材料的选择第二节第二节 细胞破碎细胞破碎第三节第三节 酶的提取酶的提取第四节第四节 分离方法分离方法第五节第五节 酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价复习题复习题7/25/20247/25/20241 1分离方法分述分离方法分述n n一、离心分离法一、离心分离法一、离心分离法一、离心分离法n n二、过滤与膜分离二、过滤与膜分离二、过滤与膜分离二、过滤与膜分离n n三、沉淀分离法三、沉淀分离法三、沉淀分离法三、沉淀分离法n n四、层析分离法四、层析分离法四、层析分离法四、层析分离法n n五、电泳
2、分离法五、电泳分离法五、电泳分离法五、电泳分离法n n六、酶的结晶六、酶的结晶六、酶的结晶六、酶的结晶n n七、浓缩与干燥七、浓缩与干燥七、浓缩与干燥七、浓缩与干燥7/25/20247/25/20242 2四、层析分离法四、层析分离法n n原理原理原理原理：利用混合物中各组分利用混合物中各组分利用混合物中各组分利用混合物中各组分理化性质理化性质理化性质理化性质的差别，使各组分不同程的差别，使各组分不同程的差别，使各组分不同程的差别，使各组分不同程度地分布在度地分布在度地分布在度地分布在固定相和流动相固定相和流动相固定相和流动相固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组中，当流动相经过固定相时
3、，各组中，当流动相经过固定相时，各组中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相分随流动相分随流动相分随流动相移动速度移动速度移动速度移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。不同，从而达到分离各组分的目的。不同，从而达到分离各组分的目的。不同，从而达到分离各组分的目的。n n吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析：利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力吸附力吸附力不同，而使混合物不同，而使混合物不同，而使混合物不同，而使混合物中的各组分分离的方法。中的各组分分离的方法。中的各组分分离的方法。中的各组分分离的方法。n n离子交换层析离子交换层析
4、离子交换层析离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的依据被分离物质与分离介质间异种电荷的依据被分离物质与分离介质间异种电荷的依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电静电静电静电引力引力引力引力的不同来进行物质分离的不同来进行物质分离的不同来进行物质分离的不同来进行物质分离的的的的。n n凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的各种多孔凝胶
5、为固定相，利用溶液中各组分的各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同分子量不同分子量不同分子量不同而进而进而进而进行分离的技术。行分离的技术。行分离的技术。行分离的技术。n n亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析：利用生物分子对之间所具有的利用生物分子对之间所具有的利用生物分子对之间所具有的利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和专一而又可逆的亲和专一而又可逆的亲和专一而又可逆的亲和力力力力，使生物分子分离纯化的技术。，使生物分子分离纯化的技术。，使生物分子分离纯化的技术。，使生物分子分离纯化的技术。7/25/20247/25/20243 3（一）吸附层析法一）吸附层析法一）吸附层析
6、法一）吸附层析法n n1 1、概念、概念、概念、概念n n吸吸吸吸附附附附层层层层析析析析是是是是利利利利用用用用吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂对对对对不不不不同同同同物物物物质质质质的的的的吸吸吸吸附附附附力力力力不不不不同同同同，而而而而使使使使混混混混合合合合物中的各组分分离的方法。物中的各组分分离的方法。物中的各组分分离的方法。物中的各组分分离的方法。图图图图n n2 2、吸附剂、吸附剂、吸附剂、吸附剂n n硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例
7、例例例n n一一一一般般般般在在在在低低低低pHpH值值值值、低低低低离离离离子子子子强强强强度度度度的的的的条条条条件件件件下下下下对对对对酶酶酶酶进进进进行行行行吸吸吸吸附附附附，而而而而在在在在提提提提高高高高pHpH值值值值和和和和增增增增加加加加离离离离子子子子强强强强度度度度的的的的条条条条件件件件下下下下，酶酶酶酶可可可可解解解解吸吸吸吸洗洗洗洗脱脱脱脱出出出出来来来来。3 3、吸附层析方法、吸附层析方法、吸附层析方法、吸附层析方法n n吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析；
8、n n把把把把吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂加加加加到到到到酶酶酶酶液液液液中中中中，吸吸吸吸附附附附后后后后过过过过滤滤滤滤出出出出来来来来，再再再再加加加加洗洗洗洗脱脱脱脱剂剂剂剂，使使使使酶解吸而洗脱出来。酶解吸而洗脱出来。酶解吸而洗脱出来。酶解吸而洗脱出来。n n4 4、特点与应用、特点与应用、特点与应用、特点与应用n n设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的一定的分辨率
9、，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的层析分离技术。的层析分离技术。的层析分离技术。的层析分离技术。 枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌-淀粉酶在弱酸性条件下，淀粉酶在弱酸性条件下，淀粉酶在弱酸性条件下，淀粉酶在弱酸性条件下，可吸附在可吸附在可吸附在可吸附在氧化铝氧化铝氧化铝氧化铝上，再用上，再用上，再用上，再用pH8pH89 9的的的的Na3PO3Na3PO3溶液洗脱；中性蛋白酶可溶液洗脱；中性蛋白酶可溶液洗脱；中性蛋白酶可溶液洗脱；中性蛋白酶可在在在在pH6.5pH6.58.58.5条件
10、下，用条件下，用条件下，用条件下，用硅藻土硅藻土硅藻土硅藻土吸吸吸吸附，再在附，再在附，再在附，再在pH9pH911.511.5的的的的2%2%氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠溶液中洗脱出来。溶液中洗脱出来。溶液中洗脱出来。溶液中洗脱出来。7/25/20247/25/20244 4吸附层析法图吸附层析法图吸附层析法图吸附层析法图7/25/20247/25/20245 5（二）离子交换层析（二）离子交换层析n n1 1 1 1、原理、原理、原理、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力依据被分离物质与分离介
11、质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离。的不同来进行物质分离。的不同来进行物质分离。的不同来进行物质分离。 n n2 2 2 2、离子交换剂的构成：、离子交换剂的构成：、离子交换剂的构成：、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反离基质、功能基团（电荷基团）、反离基质、功能基团（电荷基团）、反离基质、功能基团（电荷基团）、反离子。羧甲基纤维素（子。羧甲基纤维素（子。羧甲基纤维素（子。羧甲基纤维素（CM-CM-纤维素）：纤维素）：纤维素）：纤维素）：纤维素纤维素纤维素纤维素-O-CH-O-CH2 2-COO-COO-NaNa 反离子反离子反离子反离子 基质基质基质基质 电荷基团电荷基
12、团电荷基团电荷基团n n3 3 3 3、离子交换剂的种类、离子交换剂的种类、离子交换剂的种类、离子交换剂的种类n n4 4 4 4、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择n n5 5 5 5、离子交换层析的操作流程、离子交换层析的操作流程、离子交换层析的操作流程、离子交换层析的操作流程n n6 6 6 6、离子交换层析的应用：、离子交换层析的应用：、离子交换层析的应用：、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、制备纯化生命物质：活性可保存、制备纯化生命物质：活性可保存、制备纯化生命物质：活性可保存、分辨率高、测定蛋白质的等电点。分辨率高、测定蛋白质的等
13、电点。分辨率高、测定蛋白质的等电点。分辨率高、测定蛋白质的等电点。7/25/20247/25/20246 6离子交换原理图离子交换原理图离子交换原理图离子交换原理图7/25/20247/25/20247 73、离子交换剂的种类、离子交换剂的种类基质基质电荷基团电荷基团疏水性：疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离小分子物质。小分子物质。大孔树脂大孔树脂可用于酶可用于酶 。（离子交换树脂）。（离子交换树脂）亲水性：亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。天然或人工合成的与水结合力较大的物质。 （离子交换纤维素、离子交换凝胶）（离子交换纤
14、维素、离子交换凝胶）阳离子交换剂：阳离子交换剂：电荷基团为（电荷基团为（- -），反离子为（），反离子为（+ +），），与溶液中的阳离子交换，分为与溶液中的阳离子交换，分为强型强型和和弱型弱型阴离子交换剂：阴离子交换剂：电荷基团为（电荷基团为（+ +），反离子为（），反离子为（- -），），与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型常用的离子交换介（基）质常用的离子交换介（基）质 离子交换剂保存剂离子交换剂保存剂7/25/20247/25/20248 8亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂n n离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换纤
15、维素离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有有有有DEAE-DE
16、AE-纤维素、纤维素、纤维素、纤维素、AE-AE-纤维素、纤维素、纤维素、纤维素、CMCCMC（羧甲基纤维素）等。羧甲基纤维素）等。羧甲基纤维素）等。羧甲基纤维素）等。n n离子交换凝胶离子交换凝胶离子交换凝胶离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换离子交换离子交换离子交换和和和和分子筛分子
17、筛分子筛分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有方面具有广阔的应用前景。常用的有方面具有广阔的应用前景。常用的有方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAEDEAE葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、DEAEDEAE聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、DEAEDEAE琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶、CMCM凝胶凝胶凝胶凝胶、SESE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、磺酸乙基）葡聚
18、糖凝胶、磺酸乙基）葡聚糖凝胶、磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SPSP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶磺酸丙基）葡聚糖凝胶磺酸丙基）葡聚糖凝胶磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。等。等。等。 7/25/20247/25/20249 9常用离子交换介质常用离子交换介质7/25/20247/25/20241010离子交换剂保存剂离子交换剂保存剂7/25/20247/25/202411114、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择n n强弱离子交换剂的选择强弱离子交换剂的选择强弱离子交换剂的选择强弱离子交换剂的选择： 强型：适用范围广，无离子水中或极端强型：适用范围广，无离子水中或极端强型：适用范围广，无离子水中或极端强型：适用范围广
19、，无离子水中或极端pHpHpHpH条件下稳定。条件下稳定。条件下稳定。条件下稳定。 弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。 酶蛋白的酶蛋白的酶蛋白的酶蛋白的pIpI为为为为6- 96- 9时，考虑用强型离子交换剂。时，考虑用强型离子交换剂。时，考虑用强型离子交换剂。时，考虑用强型离子交换剂。n n基质的选择基质的选择基质的选择基质的选择： 分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。分离有活性的生物大分子物质时，亲
20、水性好于疏水性。分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。离子交换剂类型的选择离子交换剂类型的选择离子交换剂类型的选择离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性考虑酶的稳定性考虑酶的稳定性考虑酶的稳定性 酶在酶在酶在酶在pH pH pH pH pIpI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂； 酶在酶在酶在酶在pH pH pH pH pIpI的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；的条件下稳定，酶带负电，用阴离子交换剂；的条件下稳定，酶带
21、负电，用阴离子交换剂； 在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。 7/25/20247/25/202412125 5、离子交换层析操作流程、离子交换层析操作流程、离子交换层析操作流程、离子交换层析操作流程 离子交换剂可装成离子交换柱进行离子交换剂可装成离子交换柱进行离子交换剂可装成离子交换柱进行离子交换剂可装成离子交换柱进行柱柱柱柱层析；层析；层析；层析； 可可可可将将将将离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂加加加加到到到到酶酶酶酶液液液液中中中中，待待待待交交交
22、交换换换换后后后后，将将将将离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂过过过过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。离子交换柱层析主要操作过程：离子交换柱层析主要操作过程：离子交换柱层析主要操作过程：离子交换柱层析主要操作过程：（1 1）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱（2 2）上柱）上柱）上柱）上柱（3 3）洗脱和收集）洗脱和收集）洗脱和收集）洗脱和收集 （4 4）离子交换剂的再生）离子交换剂的再生）离子交换剂的再生）离子交换剂
23、的再生 7/25/20247/25/20241313（1 1 1 1）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱）离子交换剂的处理与装柱n n预处理：浸泡与脱气预处理：浸泡与脱气预处理：浸泡与脱气预处理：浸泡与脱气n n将将将将干干干干燥燥燥燥的的的的离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂用用用用水水水水浸浸浸浸泡泡泡泡2h2h以以以以上上上上，充充充充分分分分吸吸吸吸水水水水膨膨膨膨胀胀胀胀后后后后，减减减减压压压压抽抽抽抽除除除除气气气气泡泡泡泡，倾倾倾倾去去去去水水水水，用用用用无无无无离离离离子子子子水水水水洗洗洗洗至至至至澄澄澄澄清清清清。再再再再先先先
24、先后后后后用用用用4 4倍倍倍倍体体体体积积积积左左左左右右右右的的的的2mol/L2mol/L盐盐盐盐酸酸酸酸和和和和2mol/L2mol/L氢氢氢氢氧氧氧氧化化化化钠钠钠钠浸浸浸浸泡泡泡泡各各各各4h4h，再用无离子水洗至中性。再用无离子水洗至中性。再用无离子水洗至中性。再用无离子水洗至中性。n n转型转型转型转型n n经经经经上上上上述述述述处处处处理理理理后后后后的的的的离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂需需需需经经经经转转转转型型型型，使使使使离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂所所所所带带带带的的的的可可可可交交交交换换换换离离离离子子子子转转转转变变变变为为为为适适适适
25、当当当当的的的的离离离离子子子子型型型型。如如如如阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂用用用用NaOHNaOH处处处处理理理理，转转转转为为为为NaNa+型型型型；用用用用HClHCl处处处处理理理理，转转转转为为为为HH+型型型型。阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂用用用用NaOHNaOH处处处处理理理理成成成成OHOH- -型型型型；用用用用HClHCl处处处处理理理理成成成成ClCl- -型型型型等等等等。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。交换剂在
26、使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。n n装柱装柱装柱装柱n n转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离效果有影响，要求装填得效果有影响，要求装填得效果有影响，要求装填得效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹均匀，无气泡，无裂纹均匀，无气泡，无裂纹均匀，无气泡，无裂纹。装好后，。装好后，。装好后，。装好后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。保持液面在交换剂平面以上，防止空气
27、进入。保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。 7/25/20247/25/20241414（2 2 2 2）上柱）上柱）上柱）上柱n n样品液的控制样品液的控制样品液的控制样品液的控制：上柱时要注意酶液的：上柱时要注意酶液的：上柱时要注意酶液的：上柱时要注意酶液的pHpH值、温度和离子值、温度和离子值、温度和离子值、温度和离子强度强度强度强度等条件。等条件。等条件。等条件。n n上柱上柱上柱上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当液面刚好到达交换
28、剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均均均均匀匀匀匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和饱和饱和饱和为止。为止。为止。为止。
29、n n流速的控制流速的控制流速的控制流速的控制：要控制好：要控制好：要控制好：要控制好流速流速流速流速。流速太快，分离效果不好；。流速太快，分离效果不好；。流速太快，分离效果不好；。流速太快，分离效果不好；流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太慢时，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太慢时，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太慢时，或柱较高，或酶液浓度、
30、粘度较高等原因引起流速太慢时，为为为为加快离子交换层析速度加快离子交换层析速度加快离子交换层析速度加快离子交换层析速度，可采用在柱进口适当，可采用在柱进口适当，可采用在柱进口适当，可采用在柱进口适当加压加压加压加压或在出或在出或在出或在出口适当口适当口适当口适当减压减压减压减压的方法。的方法。的方法。的方法。 7/25/20247/25/20241515（3 3 3 3）洗脱和收集）洗脱和收集）洗脱和收集）洗脱和收集n n 洗未吸附物洗未吸附物洗未吸附物洗未吸附物n n 上上上上柱柱柱柱完完完完毕毕毕毕后后后后，先先先先用用用用水水水水或或或或缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液流流流流过过过过层层层层析
31、析析析柱柱柱柱，使使使使未未未未吸吸吸吸附附附附的的的的物物物物质洗出。质洗出。质洗出。质洗出。n n 洗脱目标物洗脱目标物洗脱目标物洗脱目标物n n 用用用用适适适适当当当当的的的的洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液，将将将将吸吸吸吸附附附附在在在在离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上的的的的离离离离子子子子按按按按亲亲亲亲和和和和力力力力自小至大的顺序逐次洗脱自小至大的顺序逐次洗脱自小至大的顺序逐次洗脱自小至大的顺序逐次洗脱下来，下来，下来，下来，分别收集分别收集分别收集分别收集，以达到分离目的。，以达到分离目的。，以达到分离目的。，以达到分离目的。n n 若酶液组分很复杂，用一种洗脱液
32、还达不到良好的分离效若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分离效若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分离效若酶液组分很复杂，用一种洗脱液还达不到良好的分离效果。为此，可采用连续或阶梯式的果。为此，可采用连续或阶梯式的果。为此，可采用连续或阶梯式的果。为此，可采用连续或阶梯式的梯度洗脱法梯度洗脱法梯度洗脱法梯度洗脱法。即采用按一。即采用按一。即采用按一。即采用按一定规律改变定规律改变定规律改变定规律改变pHpHpHpH值（值（值（值（pHpHpHpH值梯度）或盐浓度（浓度梯度）的洗脱值梯度）或盐浓度（浓度梯度）的洗脱值梯度）或盐浓度（浓度梯度）的洗脱值梯度）或盐浓度（浓度梯度）的洗
33、脱液进行洗脱。液进行洗脱。液进行洗脱。液进行洗脱。连续梯度洗脱液连续梯度洗脱液连续梯度洗脱液连续梯度洗脱液可按预先设计的梯度范围，在可按预先设计的梯度范围，在可按预先设计的梯度范围，在可按预先设计的梯度范围，在梯度混合器中配置。而梯度混合器中配置。而梯度混合器中配置。而梯度混合器中配置。而阶梯式梯度洗脱液阶梯式梯度洗脱液阶梯式梯度洗脱液阶梯式梯度洗脱液则分别配置几种不则分别配置几种不则分别配置几种不则分别配置几种不同同同同pHpHpHpH值或不同盐浓度的缓冲液，使用时按设计好次序依次洗值或不同盐浓度的缓冲液，使用时按设计好次序依次洗值或不同盐浓度的缓冲液，使用时按设计好次序依次洗值或不同盐浓度
34、的缓冲液，使用时按设计好次序依次洗脱。脱。脱。脱。 7/25/20247/25/20241616（4 4 4 4）离子交换剂的再生）离子交换剂的再生）离子交换剂的再生）离子交换剂的再生n n洗洗洗洗脱脱脱脱收收收收集集集集完完完完毕毕毕毕后后后后，为为为为使使使使离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂再再再再次次次次使使使使用用用用，需需需需要要要要经经经经过过过过再再再再生生生生处理。处理。处理。处理。n n含含含含杂质较少杂质较少杂质较少杂质较少时，再生只要用酸、碱或盐进行时，再生只要用酸、碱或盐进行时，再生只要用酸、碱或盐进行时，再生只要用酸、碱或盐进行转型转型转型转型即可；即可；即可
35、；即可；n n含含含含杂杂杂杂质质质质较较较较多多多多的的的的情情情情况况况况下下下下，再再再再生生生生时时时时要要要要先先先先经经经经过过过过酸酸酸酸、碱碱碱碱浸浸浸浸泡泡泡泡清清清清洗洗洗洗，用用用用水水水水洗洗洗洗至至至至中中中中性性性性，然然然然后后后后再再再再转转转转型型型型，以以以以备备备备再再再再次次次次上上上上柱柱柱柱进进进进行行行行交交交交换换换换。如如如如此此此此循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。n n 如离子交换柱要较长时间
36、停用，可在再生后，加入适当的如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的防腐剂防腐剂防腐剂防腐剂以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用0.02%0.02%0.02%0.02%的叠的叠的叠的叠氮钠氮钠氮钠氮钠作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是10ppm10
37、ppm10ppm10ppm的苯乙酸汞的苯乙酸汞的苯乙酸汞的苯乙酸汞等等等等。 7/25/20247/25/20241717（三）凝胶过滤层析（三）凝胶过滤层析n n1 1 1 1、原理：、原理：、原理：、原理：依据分子筛效应，按分子的依据分子筛效应，按分子的依据分子筛效应，按分子的依据分子筛效应，按分子的大小和形状大小和形状大小和形状大小和形状来分离样来分离样来分离样来分离样品。品。品。品。当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔当样品经过分子筛介质时，由于分子筛有一定大小和孔径，小分子样品
38、进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部径，小分子样品进入颗粒内部，大分子由于进不了颗粒内部而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程而直接流出来，它与进入颗粒的小分子相比，流过柱的路程相对较短。相对较短。相对较短。相对较短。n n2 2 2 2、分配系数、分配系数、分配系数、分配系数（KKd d）：反映凝胶对溶质排阻程度的反映凝胶对溶质排阻程度的反映凝胶对溶质排阻程度的反映凝胶对
39、溶质排阻程度的量。量。量。量。 KKd d值的意值的意值的意值的意义义义义 KKd d值的计值的计值的计值的计算算算算n n3 3 3 3、凝胶种类凝胶种类凝胶种类凝胶种类：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶n n 常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质n n4 4、影响凝胶过滤的因素：、影响凝胶过滤的因素：、影响凝胶过滤的因素：、影响凝胶过滤的因素：n n5 5、凝胶过滤层析的应用：、凝胶过滤层析的应用：、凝胶过滤层析的应用：、凝胶过滤层析的应用
40、：Ve-Vo Vi iKd=7/25/20247/25/202418181 1、凝胶过滤层析的原理、凝胶过滤层析的原理、凝胶过滤层析的原理、凝胶过滤层析的原理7/25/20247/25/202419192 2、分配系数、分配系数、分配系数、分配系数 为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数为了定量地衡量各组分的流出顺序，常常采用分配系数KKd d来量度。来量度。来量度。来量度。 KKd d值值是是是是反映凝胶对溶质排阻程度的量反映凝胶对溶质排阻程度的量反映凝胶对溶质排阻程度的量反映凝胶对溶质
41、排阻程度的量。V Ve e：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时所用洗脱液体积分出现高峰时所用洗脱液体积分出现高峰时所用洗脱液体积分出现高峰时所用洗脱液体积（mLmL）V Vo o：外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积（mLmL）V Vi i i i：内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内（
42、水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积( ( ( (mLmL) )7/25/20247/25/20242020（1 1）KdKd值的意义值的意义值的意义值的意义n nKKd d=0=0时时时时 即即即即V V V Ve e e e=V=V=V=Vo o o o，该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。n nKKd d=1=1时时时时 即即即即V V V Ve e e e=V=V=V=Vo o o
43、 o+V+V+V+Vi i i i，该组分可进入全部的微孔，最后流出。该组分可进入全部的微孔，最后流出。该组分可进入全部的微孔，最后流出。该组分可进入全部的微孔，最后流出。n n00KKd d1 1 KKd d小的先流出，小的先流出，小的先流出，小的先流出， KKd d大的后流出。大的后流出。大的后流出。大的后流出。K Kd d可可可可定量定量定量定量地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。地衡量各组分的流出顺序，也是判断分离效果的参数。当当当当K Kd d差异大时，分离效果好，差异大时，分
44、离效果好，差异大时，分离效果好，差异大时，分离效果好， 差异小时，分离效果差。差异小时，分离效果差。差异小时，分离效果差。差异小时，分离效果差。Ve-Vo Vi iKd=7/25/20247/25/20242121（2 2）K Kd d值的计算值的计算值的计算值的计算n nVVe e、VVo o和和和和VVi i与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱量与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱量与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱量与凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法、装柱量的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的凝胶的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的凝胶的多少以及装柱
45、质量等因素都有密切关系。对于不同的凝胶的多少以及装柱质量等因素都有密切关系。对于不同的凝胶柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在使柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在使柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在使柱，其数值都往往不同。所以，需要在装好凝胶柱后，在使用于酶液分离之前，通过试验，用于酶液分离之前，通过试验，用于酶液分离之前，通过试验，用于酶液分离之前，通过试验，测定该层析柱的测定该层析柱的测定该层析柱的测定该层析柱的VVo o和和和和VVi i （图图图图例）例）例）例） ， 并对某些已知组分并对某些已知组分并对某些已知组分并对某些已知组分的的的的
46、VVe e进行测定，从而计算出其进行测定，从而计算出其进行测定，从而计算出其进行测定，从而计算出其KKd d值。值。值。值。n n n n在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的在凝胶柱装好后，要尽量维持相同的使用条件，使各组分的KKd d值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的值保持一定，即保持各组分的流出顺序，从而达到良好的分离效果。分离效果。分离效果。分离效果。7/
47、25/20247/25/20242222V Vo o和和和和V Vi i 的测定的测定的测定的测定n n当当当当把把把把分分分分子子子子量量量量不不不不同同同同的的的的混混混混合合合合溶溶溶溶液液液液铺铺铺铺在在在在凝凝凝凝胶胶胶胶床床床床上上上上时时时时，其其其其在在在在内内内内水水水水体体体体积积积积和外水体积中的分布是不一样的。和外水体积中的分布是不一样的。和外水体积中的分布是不一样的。和外水体积中的分布是不一样的。n nVoVo ：溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的分分分分子子子子大大大大于于于于凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径上上上上限限限限者者者者不不不不能能能能进进进进入入入入凝凝
48、凝凝胶胶胶胶网网网网孔孔孔孔内内内内，如如如如蓝蓝蓝蓝色色色色葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖（blue blue dextrandextran，分分分分子子子子量量量量约约约约2 2 000 000 000000），而而而而被被被被排排排排阻阻阻阻在在在在外外外外水水水水体体体体积积积积的的的的溶溶溶溶液液液液中中中中。凝凝凝凝胶胶胶胶床床床床的的的的洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积积积积VeVe刚刚刚刚好好好好等等等等于外水体积。即于外水体积。即于外水体积。即于外水体积。即VeVe=Vo (=Vo (KKd d=0)=0)。n nViVi：溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的分分分分子子子子小小小小于于于于
49、凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径下下下下限限限限者者者者, ,（如如如如T T2 2OO，tritium tritium oxideoxide，氧氧氧氧化化化化氚氚氚氚，氚氚氚氚水水水水）能能能能自自自自由由由由进进进进入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶网网网网孔孔孔孔内内内内，凝凝凝凝胶胶胶胶床床床床的的的的洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积积积积VeVe应应应应等等等等于于于于凝凝凝凝胶胶胶胶床床床床总总总总体体体体积积积积，即即即即VeVe= = VtVt= = Vo+Vi Vo+Vi ( (KKd d=1)=1)。也可也可也可也可从凝胶从凝胶从凝胶从凝胶干、湿重差干、湿重差干、湿重差干、湿重差求得。求得
50、。求得。求得。n n而而而而溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的分分分分子子子子大大大大小小小小介介介介于于于于凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径上上上上限限限限和和和和下下下下限限限限之之之之间间间间者者者者，则则则则能能能能进进进进入入入入部部部部分分分分凝凝凝凝胶胶胶胶网网网网孔孔孔孔中中中中，故故故故其其其其洗洗洗洗脱脱脱脱体体体体积积积积VeVe是是是是在在在在VoVo和和和和VtVt之之之之间间间间（KKd d在在在在0 01 1之间）之间）之间）之间）。7/25/20247/25/20242323（1）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶n n构成：构成：构成：构成： 以葡聚糖（葡萄糖通过以葡聚糖（
51、葡萄糖通过以葡聚糖（葡萄糖通过以葡聚糖（葡萄糖通过1 1，6 6糖苷键结合而成的线性糖苷键结合而成的线性糖苷键结合而成的线性糖苷键结合而成的线性高分子）为单体，以高分子）为单体，以高分子）为单体，以高分子）为单体，以1 1，2-2-环氧氯丙烷为交联剂聚合环氧氯丙烷为交联剂聚合环氧氯丙烷为交联剂聚合环氧氯丙烷为交联剂聚合而成。而成。而成。而成。SephadexSephadex：GG值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的值后的数值为该类型凝胶膨润时吸水量的1010倍。如：倍。如：倍。如：倍。如：G-25G-25表示表示表示表示1
52、g1g凝胶可吸收凝胶可吸收凝胶可吸收凝胶可吸收2.5ml2.5ml水。水。水。水。 GG值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离；值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离；值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离；值小，吸水量少，凝胶孔径小，适合于较小分子的分离； GG值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。值大，吸水量多，凝胶孔径大，适合于较大分子的分离。n n特点：特点：特点：特点： 有良好的化学稳定性（耐酸碱）和热稳定性，室温保有良好的化学稳定性（耐酸碱）
53、和热稳定性，室温保有良好的化学稳定性（耐酸碱）和热稳定性，室温保有良好的化学稳定性（耐酸碱）和热稳定性，室温保存要防腐存要防腐存要防腐存要防腐。葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附作葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附作葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附作葡聚糖凝胶系酸性物质，能与碱性蛋白发生吸附作用。当用。当用。当用。当离子强度大于离子强度大于离子强度大于离子强度大于0.050.05时时时时吸附作用可丧失。吸附作用可丧失。吸附作用可丧失。吸附作用可丧失。n n葡聚糖凝胶的操作流程葡聚糖凝胶的操作流程葡聚糖凝胶的操作流程葡聚糖凝胶的操作流程7/25/20247/25/202
54、42424葡聚糖凝胶的操作流程葡聚糖凝胶的操作流程n n选择凝胶和选择凝胶和选择凝胶和选择凝胶和溶胀溶胀溶胀溶胀：可可可可根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗根据分子量大小范围选择凝胶，还有粗中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸中细之分，粗分用中粗的凝胶，分析工作用细的凝胶。水浸过夜或沸水煮过夜或沸水煮过夜或沸水煮过夜或沸水煮2hr2hr（速度快且可以杀菌）。速度快且可以杀菌）。速度快且可以杀菌）。速度快且可以
55、杀菌）。n n装柱装柱装柱装柱：均匀、无纹路、无均匀、无纹路、无均匀、无纹路、无均匀、无纹路、无气泡（兰色气泡（兰色气泡（兰色气泡（兰色葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖20002000检验）检验）检验）检验），用缓冲液平衡。用缓冲液平衡。用缓冲液平衡。用缓冲液平衡。n n上样和上样和上样和上样和洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：体积体积体积体积不超过柱床体积的不超过柱床体积的不超过柱床体积的不超过柱床体积的1/ 401/ 40。然后用缓冲液。然后用缓冲液。然后用缓冲液。然后用缓冲液洗脱，注意流速和操作压。洗脱，注意流速和操作压。洗脱，注意流速和操作压。洗脱，注意流速和操作压。n n再生再生再生再生：稀盐和缓冲液
56、洗涤，保存在液体中，为防止微生物生稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微生物生长，长，长，长， 加加加加0.02% NaN0.02% NaN3 3（使用时可能会抑制所要分离的酶）。使用时可能会抑制所要分离的酶）。使用时可能会抑制所要分离的酶）。使用时可能会抑制所要分离的酶）。7/25/20247/25/20242525（2）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶n n构成：构成：构成：构成： 由由由由D-D-半乳糖和半乳糖和半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脱水半乳糖连接构成的糖链。本脱水半乳糖连接构成的糖链。本脱水半
57、乳糖连接构成的糖链。本脱水半乳糖连接构成的糖链。本身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳身不包含另外的交联物质，依靠糖基之间的氢键作用形成稳定的网状结构。定的网状结构。定的网状结构。定的网状结构。 SepharoseSepharose：数字表示琼脂糖含量数字表示琼脂糖含量数字表示琼脂糖含量数字表示琼脂糖含量（2B2B表示含量为表示含量为表示含量为表示含量为2%2%），），），），数字越大含量越高，但筛孔越小。数字越大含量越高，但筛孔越小。数字越大含量越高，但筛孔越小。数字越大含
58、量越高，但筛孔越小。n n特点：特点：特点：特点：孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。孔径较大，非特异吸附作用小，但稳定性差。n nSepharoseSepharose-CL-CL型型型型 ：是琼脂糖在强碱性条件下与是琼脂糖在强碱性条件下与是琼脂糖在强碱性条件下与是琼脂糖在强碱性条件下与1,3-1,3-二溴二溴二溴二溴异丙醇生成的异丙醇生成的异丙醇生成的异丙醇生成的交联型琼脂糖交联型琼脂糖交联型琼脂糖交联型琼脂糖。孔径与同浓度未交联琼脂糖相。孔径与同浓度未交联琼脂糖相。孔径与同浓度未交联琼脂糖相。孔径与同浓度未
59、交联琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在同，但热稳定性和化学稳定性都有提高，可在0-400-40 、pH3-14pH3-14间使用。间使用。间使用。间使用。7/25/20247/25/20242626（3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶n n构成：构成：构成：构成：人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯人工合成凝胶。是以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联酰胺为
60、交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物，通过改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径。剂浓度可改变凝胶孔径。剂浓度可改变凝胶孔径。剂浓度可改变凝胶孔径。 Bio-gel PBio-gel P系列：系列：系列：系列：P P值越大孔径也越大，数值值越大孔径也越大，数值值越大孔径也越大，数值值越大孔径也越大，数值* * * *10001000表示排阻表示排阻表示排阻表示排阻限度，可根据欲分离的分子量选择适宜的凝胶。限度，可根据欲分离的分子量选择适宜的凝胶。限度，可根据欲分离的分子量选择适宜的凝胶。限度，可根据欲分离
61、的分子量选择适宜的凝胶。n n特点：特点：特点：特点： 属于惰性凝胶，但遇强酸时，可能使其中的酰胺键水属于惰性凝胶，但遇强酸时，可能使其中的酰胺键水属于惰性凝胶，但遇强酸时，可能使其中的酰胺键水属于惰性凝胶，但遇强酸时，可能使其中的酰胺键水解而遭到破坏。解而遭到破坏。解而遭到破坏。解而遭到破坏。 7/25/20247/25/20242727厂家厂家厂家厂家/ /商品名商品名商品名商品名型号型号型号型号凝胶种类凝胶种类凝胶种类凝胶种类备注备注备注备注Bio-Red Bio-Red Bio-gel P Bio-gel P Bio-gel A Bio-gel AP-2P-2、 P-4 P-4、 P-
62、5 P-10 P-5 P-10、 P-30 P-30、 P- P-6060、 P-100 P-100、 P-150 P-150、 P-200 P-200、 P-300P-300聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺不同型不同型不同型不同型号所排号所排号所排号所排阻的蛋阻的蛋阻的蛋阻的蛋白质分白质分白质分白质分子量不子量不子量不子量不同同同同A-0.5mA-0.5m、 A-1.5m A-1.5m、 A- 5.0m A- 5.0m、 A- A-15m15m、 A-50m A-50m、 A-150m A-150m琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖LKB LKB UltrogelUltrogelAgarose
63、AgaroseACA22ACA22、 ACA34 ACA34、 ACA44 ACA44、 ACA54ACA54、琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖/ /聚丙烯聚丙烯聚丙烯聚丙烯酰胺酰胺酰胺酰胺A2A2、A4A4、 A6 A6琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖PharmaciaPharmaciaSephadexSephadexSepharoseSepharoseSephecrylSephecrylG-10G-10、 G-15 G-15、 G-25 G-25、 G-50 G-50、 G- G-7575、 G-100 G-100、 G-150 G-150、 G-200 G-200葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖6B6B、4B4
64、B、2B2B琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖CL-3BCL-3B、CL-4BCL-4B、CL-2BCL-2B交联琼脂糖交联琼脂糖交联琼脂糖交联琼脂糖S-200S-200、S-300S-300、S-400S-400、S-500S-500、S-1000S-1000葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖/ /双丙烯双丙烯双丙烯双丙烯酰胺酰胺酰胺酰胺常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质常用凝胶过滤层析介质7/25/20247/25/202428284、影响凝胶过滤层析的因素、影响凝胶过滤层析的因素n n选择合适的选择合适的选择合适的选择合适的凝胶粒度凝胶粒度凝胶粒度凝胶粒度：细颗粒凝胶分辨率高，但洗
65、脱慢；：细颗粒凝胶分辨率高，但洗脱慢；：细颗粒凝胶分辨率高，但洗脱慢；：细颗粒凝胶分辨率高，但洗脱慢；n n柱长柱长柱长柱长：L/DL/D高的柱子分辨率高，但影响流速；高的柱子分辨率高，但影响流速；高的柱子分辨率高，但影响流速；高的柱子分辨率高，但影响流速；n n层析柱的装柱质量：减少气泡和裂纹；层析柱的装柱质量：减少气泡和裂纹；层析柱的装柱质量：减少气泡和裂纹；层析柱的装柱质量：减少气泡和裂纹；n n样品体积样品体积样品体积样品体积：量少，分辨率清晰，用于分析目的时不超过：量少，分辨率清晰，用于分析目的时不超过：量少，分辨率清晰，用于分析目的时不超过：量少，分辨率清晰，用于分析目的时不超过柱
66、床床床床体积的体积的体积的体积的5%5%，脱盐时，脱盐时，脱盐时，脱盐时10%10%左右。制备层析可左右。制备层析可左右。制备层析可左右。制备层析可25%-30%25%-30%；n n洗脱液的洗脱液的洗脱液的洗脱液的流速流速流速流速：流速快分辨率低。：流速快分辨率低。：流速快分辨率低。：流速快分辨率低。7/25/20247/25/202429295、凝胶过滤层析的应用、凝胶过滤层析的应用n n生物大分子的脱盐和浓缩；生物大分子的脱盐和浓缩；生物大分子的脱盐和浓缩；生物大分子的脱盐和浓缩；n n分离生命物质（对某些理化性质相似如溶解度、带电性质等，分离生命物质（对某些理化性质相似如溶解度、带电性
67、质等，分离生命物质（对某些理化性质相似如溶解度、带电性质等，分离生命物质（对某些理化性质相似如溶解度、带电性质等，但分子量不同的混合液）；但分子量不同的混合液）；但分子量不同的混合液）；但分子量不同的混合液）；n n去除热源物质；去除热源物质；去除热源物质；去除热源物质；n n分子量检测；分子量检测；分子量检测；分子量检测；n n其它：其它：其它：其它：DEAE-DEAE-SephadexSephadex可作为离子交换层析介质。可作为离子交换层析介质。可作为离子交换层析介质。可作为离子交换层析介质。7/25/20247/25/20243030（四）亲和层析（四）亲和层析（四）亲和层析（四）亲和
68、层析n n1 1 1 1、原理、原理、原理、原理：利用生物大分子与配基之间所具有的利用生物大分子与配基之间所具有的利用生物大分子与配基之间所具有的利用生物大分子与配基之间所具有的专一又可逆专一又可逆专一又可逆专一又可逆的的的的结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂的生物大分
69、子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂质分离而达到纯化目的。质分离而达到纯化目的。质分离而达到纯化目的。质分离而达到纯化目的。 亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法。n n2 2 2 2、亲和层析基质和配体：、亲和层析基质和配体：、亲和层析基质和配体：、亲和层析基质和配体：n n3 3 3 3、基质与配体偶联：、基质与配体偶联：、基质与配体偶联：、基质与配体偶联：n n4 4 4 4、亲和层析操作步骤：、亲和层析操作步骤：、亲和层析操作步骤：、
70、亲和层析操作步骤：n n5 5 5 5、亲和层析的、亲和层析的、亲和层析的、亲和层析的应用：应用：应用：应用：（7/25/20247/25/202431311 1、亲和层析的原理、亲和层析的原理、亲和层析的原理、亲和层析的原理7/25/20247/25/202432322 2、亲和层析基质和配体、亲和层析基质和配体、亲和层析基质和配体、亲和层析基质和配体n n理想的理想的理想的理想的基质基质基质基质应满足的条件：应满足的条件：应满足的条件：应满足的条件： （1 1）能构成松散的多孔网络；）能构成松散的多孔网络；）能构成松散的多孔网络；）能构成松散的多孔网络；（2 2） 极低的非特异性吸附；极低
71、的非特异性吸附；极低的非特异性吸附；极低的非特异性吸附； （3 3） 高度的亲水性；高度的亲水性；高度的亲水性；高度的亲水性； （4 4） 较好的理化稳定性；较好的理化稳定性；较好的理化稳定性；较好的理化稳定性； （5 5）具）具）具）具有大量能活化并与配基结合的基团。有大量能活化并与配基结合的基团。有大量能活化并与配基结合的基团。有大量能活化并与配基结合的基团。n n可供选择的亲和层析基质：可供选择的亲和层析基质：可供选择的亲和层析基质：可供选择的亲和层析基质：琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素纤维素纤维素纤
72、维素等。等。等。等。以以以以4%4%的交联琼脂糖（的交联琼脂糖（的交联琼脂糖（的交联琼脂糖（SepharoseSepharose 4B 4B）最为常最为常最为常最为常见见见见。n n亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析配体配体配体配体的的的的条件：条件：条件：条件： （1 1 1 1）与纯化的物质有较强的亲和力；（）与纯化的物质有较强的亲和力；（）与纯化的物质有较强的亲和力；（）与纯化的物质有较强的亲和力；（2 2 2 2）具有与基质共价）具有与基质共价）具有与基质共价）具有与基质共价结合的基团。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、结合的基团。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、结合的基团
73、。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、结合的基团。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、辅因子、抑制剂、抗体、染料等。辅因子、抑制剂、抗体、染料等。辅因子、抑制剂、抗体、染料等。辅因子、抑制剂、抗体、染料等。7/25/20247/25/20243333亲和层析的几个名词亲和层析的几个名词亲和层析的几个名词亲和层析的几个名词n n在在在在成成成成对对对对互互互互配配配配的的的的生生生生物物物物分分分分子子子子中中中中，可可可可把把把把任任任任何何何何一一一一方方方方作作作作为为为为固固固固定定定定相相相相，而而而而对对对对样样样样品品品品溶溶溶溶液液液液（流流流流动动动动相相相相）中中中中
74、的的的的另另另另一一一一方方方方分分分分子子子子进进进进行行行行亲亲亲亲和和和和层层层层析析析析。例例例例如如如如，酶酶酶酶与与与与其其其其辅辅辅辅酶酶酶酶是是是是分分分分子子子子对对对对，既既既既可可可可把把把把辅辅辅辅酶酶酶酶作作作作为为为为固固固固定定定定相相相相，对对对对样样样样品品品品液液液液中中中中的的的的酶酶酶酶进进进进行行行行亲亲亲亲和和和和层层层层析析析析分分分分离离离离；也也也也可可可可把把把把酶酶酶酶作作作作为为为为固固固固定定定定相相相相，使使使使样样样样品品品品液液液液中中中中的的的的辅辅辅辅酶酶酶酶分分分分离离离离纯纯纯纯化化化化。在在在在亲亲亲亲和和和和层层层层析
75、析析析中中中中，作作作作为为为为固固固固定定定定相相相相的的的的一一一一方方方方称称称称为为为为配配配配体（配基）体（配基）体（配基）体（配基）。n n配配配配基基基基必必必必须须须须偶偶偶偶联联联联于于于于不不不不溶溶溶溶性性性性母母母母体体体体上上上上。母母母母体体体体又又又又称称称称载载载载体体体体或或或或担担担担体体体体或或或或基基基基质质质质，一一一一般般般般采采采采用用用用琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶和和和和纤纤纤纤维维维维素等作为母体。素等作为母体。素等作为母体。素等作
76、为母体。n n活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为偶联凝胶偶联凝胶偶联凝胶偶联凝胶。7/25/20247/25/202434343 3、基质和配体的偶联、基质和配体的偶联、基质和配体的偶联、基质和配体的偶联n n基质的活化：基质的活化：基质的活化：基质的活化： CNBrCNBr法：法：法：法：作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚氨基碳酸盐衍生
77、物。氨基碳酸盐衍生物。氨基碳酸盐衍生物。氨基碳酸盐衍生物。 n n引入连接（手）臂：引入连接（手）臂：引入连接（手）臂：引入连接（手）臂： 通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增
78、配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。图例图例图例图例n n偶联：偶联：偶联：偶联：一般在活化后快速进行。一般在活化后快速进行。一般在活化后快速进行。一般在活化后快速进行。OHOHOHOHCNBrO OO OC=NHC=NHpH117/25/20247/25/20243535亲和层析连接臂
79、的作用亲和层析连接臂的作用7/25/20247/25/202436364 4、亲和层析操作步骤、亲和层析操作步骤、亲和层析操作步骤、亲和层析操作步骤（1 1）制备亲和层析剂）制备亲和层析剂）制备亲和层析剂）制备亲和层析剂 选配基选配基选配基选配基 选偶联凝胶选偶联凝胶选偶联凝胶选偶联凝胶 偶联偶联偶联偶联 例例例例（2 2 2 2）装柱层析）装柱层析）装柱层析）装柱层析 亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱时，酶与其配基结合
80、，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，时，酶与其配基结合，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，时，酶与其配基结合，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，时，酶与其配基结合，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出。可洗涤流出。可洗涤流出。可洗涤流出。 （3 3 3 3）洗脱）洗脱）洗脱）洗脱 用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害地脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害
81、地脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害地脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害地洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。例例例例 注意事项注意事项注意事项注意事项：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并使亲和层析剂免受损害，一般应在低温（使亲和层析剂免受损害，一般应在低温（使亲
82、和层析剂免受损害，一般应在低温（使亲和层析剂免受损害，一般应在低温（0 01010）的条件）的条件）的条件）的条件下进行操作。下进行操作。下进行操作。下进行操作。 7/25/20247/25/20243737制备亲和层析剂实例制备亲和层析剂实例n n在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞
83、体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于溶菌酶溶菌酶溶菌酶溶菌酶的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化脂糖凝胶为母体制成亲和层
84、析剂，用于分离纯化-淀粉淀粉淀粉淀粉酶酶酶酶；以辅酶；以辅酶；以辅酶；以辅酶为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶为辅酶的酶的纯化，如为辅酶的酶的纯化，如为辅酶的酶的纯化，如为辅酶的酶的纯化，如乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶。 7/25/20247/25/20243838亲和亲和层析洗脱举例层析洗脱举例n n 以卵类粘蛋白为配基，在以卵类粘蛋白为配基，在pH78的条的条件下，胰蛋白酶与配基亲和吸附，而以件下，胰蛋白酶与配基亲和吸附，而以pH23的缓冲液可将胰蛋白酶洗脱出来的缓冲液
85、可将胰蛋白酶洗脱出来 。7/25/20247/25/202439395 5、亲和层析的应用、亲和层析的应用、亲和层析的应用、亲和层析的应用n n纯化大分子物质：纯化大分子物质：纯化大分子物质：纯化大分子物质： 酶的纯化、酶的纯化、酶的纯化、酶的纯化、糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化（以抗原做配体）（以抗原做配体）（以抗原做配体）（以抗原做配体）n n研究酶的结构与功能。研究酶的结构与功能。研究酶的结构与功能。研究酶的结构与功能。n n将有将有将有将有生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开，也可进行活力，也可进行活力，也可进行活力，也可进行活力检测。检测。检测。检测。7/25/20247/25/20244040
